Nghiên cứu ảnh hưởng của resveratrol lên sự bám dính của các dòng tế bào ung thư dld-1 và hl-60

Chương 1. Tổng quan tài liệu 3 Chương 1 Tổng quan tài liệu 1.1. RV RV, tên khoa học là 3,4’,5-trihydroxy-stilbene, là hợp chất polyphenol thường hiện diện trong nho, dâu, các loại hạt và rượu vang đỏ. Theo một vài nghiên cứu gần đây, rượu vang có chứa nhiều thành phần giúp chống lại nhiều loại bệnh, trong đó có ung thư [15], [17]. Trong các bài thuốc y học cổ truyền của Trung Quốc và Nhật Bản, dịch chiết từ rễ của loài cỏ Polygonum cuspidatum có chứa RV giúp chống lại bệnh gan, da, và các bệnh liên quan đến hệ tuần hoàn [25], [48]. Năm 1997, hoạt tính kháng ung thư của RV lần đầu tiên được chứng minh khi Jang và cs công bố RV có hoạt tính ngăn ngừa ung thư vì ức chế được ba giai đoạn chính của quá trình phát sinh ung thư bao gồm khởi phát, thúc đẩy và phát triển của khối u [22]. Sau công bố này, RV được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu và cũng thu hút được rất nhiều sự quan tâm từ công chúng. Rất nhiều bằng chứng từ các nghiên cứu sử dụng mô hình in vitro và in vivo về đặc tính ngăn ngừa ung thư cũng như các nghiên cứu về dịch tễ học đã chỉ ra mối quan hệ tỉ lệ nghịch giữa việc tiêu thụ rượu vang ở mức vừa phải và bệnh lý về động mạch vành ở tim, còn được gọi là “nghịch lý nước Pháp” (French Paradox) [44], [27]. Chương 1. Tổng quan tài liệu 4 1.1.1. Các nguồn chứa RV Các loại nho đỏ cũng như rượu vang được biết là nguồn chứa RV rất dồi dào. Tuy nhiên, RV cũng được tìm thấy ở nhiều loại thực vật khác, như cây chút chít Nhật Bản (Polygonum cuspidatum), đậu phộng, giống Vaccinum (bao gồm cây việt quất, cây nam việt quất), Reynoutria japonica, thông Scots. Những loài thực vật khác có chứa RV như giống Vitis (bao gồm trong lá, thân và vỏ quả nho); giống Morus (bao gồm cây dâu tằm); giống Veratrum (huệ tây); các cây họ đậu (giống Cassia, Pterolobium hexapetallum); giống Picea (cây khuynh diệp, vân sam), giống Pinus (thông), giống Poaceae (các loài cỏ như Festuca, Hordeum, Poa, Stipa), giống Trifolium, giống Nothofagus, giống Artocarpus, giống Gnetum, Pleuropterus ciliinervis; Bauhinia racemosa; Paeonia lactiflora; Scilla nervosa; và Tetrastigma hypoglaucum (hình 1.1) [1]. Hình 1.1. Các loài thực vật có chứa RV [1]. Chương 1. Tổng quan tài liệu 5 1.1.2. Tính chất hóa học của RV Cấu trúc hóa học của RV có liên quan mật thiết đến hoạt tính sinh học. Cấu trúc hóa học của RV dạng cis- và trans- được trình bày ở hình 1.2. Mặc dù sự hiện diện của liên kết đôi thúc đẩy quá trình chuyển dạng của hai đồng phân cis- và trans-RV, tương ứng với cấu hình (E)- và (Z)-, đồng phân trans- RV được cho là bền hơn đồng phân cis-RV về mặt cấu hình không gian [45]. Do có nhiều hơn một nhóm phenol trong cấu trúc phân tử, RV được phân loại vào họ polyphenol. Các hợp chất polyphenol thường là những chất chống oxy hóa, chúng có thể phản ứng với những gốc tự do để hình thành những phân tử có cấu trúc bền và ít độc hơn những gốc tự do ban đầu [7]. 1.1.3. Hoạt tính kháng ung thư của RV Đặc tính ngăn ngừa và điều trị ung thư cũng như các cơ chế tác động của RV đến các mục tiêu của nó đã được nghiên cứu khá nhiều. Hợp chất này có những đặc tính đã được chứng minh bao gồm (1) khả năng ngăn cản sự hoạt động của nhiều chất gây ung thư khác nhau và/hoặc kích thích sự giải độc cho cơ thể, ngăn ngừa tác động oxy hóa lên DNA của tế bào, (2) điều khiển diễn tiến của chu trình phân bào, (3) kích thích quá trình apoptosis ở nhiều loại tế bào ung thư khác nhau hay những tế bào có khả năng kháng thuốc, (4) ức chế quá trình viêm, (5) ức chế quá trình hình thành mạch máu cũng như di căn của khối u [1], [7], [19], [28], [46]. Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của RV [45]. Chương 1. Tổng quan tài liệu 6 RV còn có khả năng điều tiết các con đường dẫn truyền tín hiệu nội bào khác nhau như MAPK, NF-B, và PI3K/Akt. Đây là những con đường thường khiếm khuyết hoặc bị mất khả năng tự điều hòa trong quá trình phát sinh ung thư. Tùy thuộc vào loại tế bào và tác nhân kích thích, RV hoặc là sẽ ức chế sự biểu hiện bất thường hay hoạt hóa những con đường truyền tín hiệu đặc biệt, hoặc là sẽ phục hồi hoạt tính của những protein mà chức năng của chúng bị suy giảm hay mất chức năng (hình 1.3) [28]. Ví dụ như trong tế bào thường, RV sẽ hoạt hóa con đường PI3K/Akt để hoạt hóa nhân tố phiên mã Nrf-2 nhằm thúc đẩy quá trình khử độc các tác nhân gây ung thư. Ngược lại, trong tế bào ung thư, RV sẽ ức chế sự hoạt động của con đường này dẫn đến sự ức chế hoạt động con đường NF-B để đưa tế bào ung thư vào quá trình Hình 1.3. Các phân tử và đường truyền tín hiệu mục tiêu của RV trong tế bào thường và tế bào ung thư [28]. Chương 1. Tổng quan tài liệu 7 apoptosis. Một ví dụ khác như: trong tế bào bị kích thích bởi các nhân tố gây ung thư (tia UV, các hóa chất gây ung thư, độc tố vi khuẩn,…) các nhân tố phiên mã như STAT3, NF-B, AP-1 hoạt động bất thường. RV giúp các tế bào này ức chế hoạt động của con đường MAPK dẫn đến ức chế hoạt động của các nhân tố phiên mã vừa nêu (hình 1.3). Các nghiên cứu tác động của RV lên các con đường truyền tín hiệu giúp cho các nhà nghiên cứu nhận diện được một loạt phân tử mục tiêu mới của RV [30]. Các phân tử này được xếp vào các nhóm: apoptosis, kháng apoptosis, nhân tố tăng trưởng, nhân tố phiên mã, các phân tử bám dính, di căn, chu trình tế bào và protein kinase (hình 1.4). RV Protein Kinase IKK  HER2  AKT  Src  MEK  SAPK  FAK  JNK  PKC  PKD  CK2  Transcription Factors NF-B  AP-1  Egr-1  STAT3  Nrf-2  c-myc  p53  AR  Antiapoptotic Proteins Bcl-2  Bcl-xL  Survivin  TRAF1  TRAF2  c-IAP1  c-IAP2  Growth Factor Pathway TNF  EGF  PDGF  TGF/  IL-1, 2, 6  FGF  Apoptotic Proteins Caspase 9  Caspase 8  Caspase 7  Caspase 3  PARP  Bax  Cell Cycle Proteins Cyclin D1  Cyclin E  p21  Cdc2-tyr15  Cell Adhesion Molecules FAK  ICAM-1  VCAM  ELAM  Metastasis 5-LOX  COX2  iNOS  MMP-9  MMP-2  IL-8  VEGF  Hình 1.4. Các mục tiêu phân tử của tác động kháng ung thư của RV. AP, activator protein; AR, androgen receptor; c-IAP, cellular inhibitor of apoptosis protein; EGF, epidermal growth factor; Egr, early growth response factor; ELAM, endothelialleukocyte adhesion molecule; FGF, fibroblast growth factor; HER, human epidermal growth factor receptor; ICAM, intercellular cell adhesion molecule; IKK, I kappa B kinase; IL, interleukin; iNOS, inducible nitric oxide synthase; JNK, c-Jun N- terminal kinase; LOX, lipoxygenase; Nrf, NF-E2-related factor; PARP, poly (ADP- ribose) polymerase; PDGF, platelet-derived growth factor; STAT, signal transducers and activators of transcription; TGF, transforming growth factor; TNF, tumor necrosis factor; TRAF, tumor necrosis factor receptor-associated factor; VCAM, vascular cell adhesion molecule; VEGF, vascular endothelial growth factor. [30] Chương 1. Tổng quan tài liệu 8 Bên cạnh đó, khả năng kháng ung thư và cơ chế tác động của RV còn được nghiên cứu trên khá nhiều dòng tế bào ung thư (hình 1.5). Hình 1.5. Ảnh hưởng của RV trên các dòng tế bào ung thư. [4] Chương 1. Tổng quan tài liệu 9 Các nghiên cứu trên mô hình in vivo của RV Nghiên cứu đầu tiên trên tác động ngăn ngừa ung thư của RV được thực hiện bởi Jang và cs (1997). Các tác giả này đánh giá tác động của RV trong quá trình hình thành khối u thông qua mô hình chuột bị ung thư da ở giai đoạn 2, và kết quả cho thấy RV có hiệu quả làm giảm quá trình ung thư da đến 98%. Từ nghiên cứu đầu tiên này, một số lượng lớn các công trình nghiên cứu tác động của RV trên sự tăng trưởng và tiềm năng di căn của các khối u ác tính được cấy ghép trong chuột lần lượt được công bố. Trong tất cả các trường hợp ung thư này, RV có tác động làm giảm tốc độ tăng trưởng và di căn của các tế bào ung thư cũng như cảm ứng quá trình apoptosis. Mặc dù hoạt tính kháng ung thư của RV đã được chứng minh trên mô hình in vitro cũng như trên động vật nhưng vẫn có rất ít thử nghiệm lâm sàng được tiến hành trên người. RV ức chế sự tăng sinh của những tế bào tủy xương mới sinh được thu nhận từ 5 bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu dòng tủy ác tính (Acute Myelogenous Leukeumia, AML) được chẩn đoán sớm, và sự ức chế này phụ thuộc vào nồng độ của RV, cho thấy RV là một chất ức chế mạnh tế bào AML trong điều kiện in vitro, do đó, đây là một chất rất có tiềm năng cho điều trị trong tương lai đối với bệnh AML. Gần đây, các thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I chứng minh rằng sự tiêu thụ RV (5 g) không gây ra bất cứ tác dụng phụ nghiêm trọng nào trên những người tình nguyện mạnh khỏe, nhưng dư lượng trong huyết tương (2,4 µmol/L) vẫn còn thấp hơn nồng độ đòi hỏi tối thiểu (5 µmol/L) của hợp chất này khi đánh giá hoạt tính ngăn ngừa ung thư trên tế bào nuôi cấy. Các dữ liệu về động dược học của các nghiên cứu này trên mô hình chuột cho thấy sự tích lũy sinh học của RV trong cơ thể rất kém. Do đó, cần có những nghiên cứu tập trung hơn trên khả năng tăng cường sự chống lại quá trình đào thải của hợp chất này trong cơ thể sinh vật. Tuy nhiên, những dữ liệu thu nhận được từ các thử nghiệm in vitro, in vivo, và tiền lâm sàng trong những thập kỷ qua cho thấy RV là một trong những hợp chất tự nhiên tiềm năng nhất trong phòng ngừa và điều trị ung thư [5], [14], [28]. Chương 1. Tổng quan tài liệu 10 1.2. RV và sự bám dính của tế bào 1.2.1. Sự bám dính của tế bào Sự bám dính tế bào thường được phân ra làm hai loại: sự bám dính giữa tế bào với tế bào và sự bám dính giữa tế bào với giá thể, ví dụ như ECM (hình 1.6). Sự bám dính của tế bào thường liên quan đến quá trình gắn chuyên biệt của phân tử bám dính của tế bào (cell adhesion molecules, CAMs) hay các thụ thể trên màng tế bào với phân tử mục tiêu trên màng tế bào lân cận hay trên ECM. Các CAMs hay các thụ thể này đồng thời cũng hình thành các liên kết trực tiếp với các phức hợp protein đa phân tử trong tế bào chất. Đến lượt mình, các phức hợp protein này sẽ tương tác với khung xương tế bào và các con đường dẫn truyền tín hiệu nội bào, cung cấp những thông tin cần thiết cho tế bào để tế bào thay đổi sự biểu hiện của một số gene. Tiếp theo, sự thay đổi biểu hiện gene này cho phép tế bào biến đổi các tương tác của nó đối với môi trường ngoại bào. Do đó, sự bám dính tế bào không chỉ liên kết các tế bào với nhau và liên kết các tế bào với ECM, mà còn giúp kết nối các thông tin bên ngoài môi trường với các con đường tín hiệu bên trong tế Hình 1.6. Sự bám dính giữa tế bào với tế bào và giữa tế bào với ECM. (Wary Cell Communication and Signaling 2005 3:7) Chương 1. Tổng quan tài liệu 11 bào. Bên cạnh đó, những tương tác bám dính của tế bào quyết định sự liên kết của các tế bào thành các mô và cơ quan, điều khiển sự vận động, ảnh hưởng đến hình dạng tế bào và quá trình điều tiết sự hoạt hóa của mạng lưới dẫn truyền tín hiệu trong quá trình phát triển phôi, quá trình viêm, sự đáp ứng miễn dịch và quá trình di căn của khối u. Chúng cũng giúp điều hòa sự tăng trưởng, biệt hóa và apoptosis [2], [13], [31]. Trong đề tài này, chúng tôi nghiên cứu tác động của RV lên sự bám dính giữa tế bào ung thư với protein của ECM. Vai trò của sự bám dính của tế bào trong ung thư Nhiều phân tử bám dính khác nhau tham gia vào các tương tác liên bào và tương tác giữa tế bào – ECM của tế bào ung thư. Sự tiến triển của ung thư là một quá trình gồm nhiều bước và ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy sự biến đổi đặc tính bám dính của các tế bào khối u đóng vai trò quan trọng trong sự tái phát, xâm lấn và di căn. Sự mất liên kết bám dính liên bào và sự tách ra khỏi ECM cho phép tế bào ung thư vượt ra khỏi vị trí mô ban đầu, phân cắt ECM, thâm nhập vào hệ mao mạch và hình thành nên một nhóm các tế bào bất thường tại vị trí khác trong cơ thể. Bên cạnh việc tham gia vào các quá trình xâm lấn và di căn, các phân tử bám dính còn điều hòa hay tham gia vào các quá trình truyền tín hiệu,di động, tăng trưởng, và biệt hóa [36]. Các bước trong quá trình bám dính của tế bào lên giá thể Bước đầu tiên trong quá trình bám dính vào giá thể là việc gắn các thụ thể trên màng sinh chất và những phân tử tương tác khác của tế bào lên các phân tử giá thể như các protein ECM. Integrin thường là phân tử trung gian trong quá trình bám. Theo sau sự bám là hiện tượng tế bào trải dài trên giá thể (nghĩa là vùng bám của tế bào vào chất nền lan rộng ra). Khi tế bào trải dài hoàn toàn, tế bào sẽ bám chặt hơn lên giá thể [50]. Quá trình bám dính của tế bào lên giá thể luôn đi cùng với sự tái tổ chức bộ khung actin của tế bào chất, cụ thể là sự hình thành các chân giả dạng phiến (lamellipodia) và chân giả dạng sợi (filopodia). Lamellipodia là một cấu trúc dạng Chương 1. Tổng quan tài liệu 12 phiến mỏng của sợi actin, còn filopodia có cấu trúc dạng sợi mỏng. Sự kéo dài của các cấu trúc này rất cần thiết cho việc bám dính của tế bào. Khi tế bào bắt đầu trải dài, lamellipodia bắt đầu được tạo ra từ các vùng giàu actin ở ngoại vi của tế bào. Tiếp theo đó, các lamellipodia được kéo ra theo hướng trải dài của tế bào. Tại các lamellipodia này, filopodia bắt đầu nhô ra để “thăm dò” môi trường xung quanh. Sau đó, filopodia được kéo dài ra hình thành các điểm bám, vị trí các protein tham gia vào quá trình bám dính tập trung và hoạt động. Ngoài ra, sợi filopodia còn có thể tương tác với các tế bào xung quanh [32]. 1.2.2. Ảnh hưởng của RV lên sự bám dính của tế bào ung thư Mặc dù có rất nhiều công trình nghiên cứu khả năng kháng ung thư của RV, nhưng không có nhiều các công trình tìm hiểu tác động của RV lên sự bám dính của tế bào ung thư. Một nghiên cứu mới đây đã tìm hiểu tác động của RV lên sự bám dính của tế bào u mô bào xơ ác tính (fibrosacroma) HT1080 lên tế bào nội mô ECV304. Kết quả cho thấy RV ức chế sự bám dính của tế bào HT1080 được cảm ứng với Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) lên tế bào ECV304 một cách phụ thuộc liều. Tế bào HT1080 khi được cảm ứng với PMA sẽ gia tăng tính bám và tăng sự biểu hiện phân tử bám dính liên bào 1 (intercellular adhesion molecule-1 ICAM-1). Xử lý tế bào HT1080 với RV trước khi cảm ứng với PMA sẽ làm giảm khả năng bám của tế bào HT1080 lên tế bào nội mô ECV304 và ức chế sự biểu hiện của ICAM-1. Mặt khác, Hình 1.7. Lamellipodia và filopodia. [6] filopodia filopodia lamellipodia Chương 1. Tổng quan tài liệu 13 sự hoạt hóa con đường NF-B là cần thiết cho sự biểu hiện của ICAM-1 và các tác giả cũng đã chứng minh RV ức chế sự hoạt hóa NF-B. Do đó các tác giả kết luận rằng RV có thể có khả năng kháng di căn thông qua sự ức chế con đường tín hiệu NF-B và sự biểu hiện của ICAM-1 dẫn đến ức chế sự bám dính của tế bào ung thư lên tế bào nội mô [37]. Trong một nghiên cứu khác, RV được chứng minh ức chế mạnh khả năng bám dính và di chuyển của tế bào ung thư buồng trứng di căn HO-8910PM in vitro ở nồng độ 100 µM và sau 6 giờ xử lý [38]. Nghiên cứu xác định các gene mục tiêu của RV trên dòng tế bào ung thư bạch cầu người K562 cho thấy mức độ biểu hiện gene tensin tăng đáng kể. Tensin là một protein có khả năng gắn với integrin và các sợi actin trong khung xương tế bào và tương tác với các con đường truyền tín hiệu nội bào. Sự cảm ứng tensin bởi RV liên quan đến sự tăng cường bám dính của tế bào K562 trên fibronectin, làm tế bào trải dài và tăng tổng hợp actin. Các đáp ứng tương tự cũng được quan sát ở dòng tế bào ung thư vú MCF-7 khiếm khuyết tensin. RV làm tăng khả năng di chuyển và bám dính của tế bào MCF-7 vào fibronectin, và làm ngừng sự xâm lấn của tế bào được cảm ứng bởi estrogen. Kết quả này cho thấy RV có khả năng phục hồi sự bám dính của tế bào vào giá thể và ức chế sự xâm lấn thông qua việc cảm ứng tensin ở các dòng tế bào ung thư khiếm khuyết tensin [41]. Từ những nghiên cứu được mô tả ở phần trên cho thấy RV có những ảnh hưởng nhất định lên sự bám dính của tế bào ung thư và một vài phân tử bám dính đã được xác định có liên quan đến tác động này như ICAM-1 và tensin. 1.3. FAK và sự bám dính của tế bào FAK là phân tử trung tâm trong các con đường truyền tín hiệu được khởi phát tại vị trí bám dính của tế bào vào một giá thể. FAK còn là nhân tố điều hòa chủ đạo sự tăng sinh, di động và xâm lấn trong quá trình phát triển của ung thư. Hơn thế nữa, trong nhiều dạng ung thư người ta thường tìm thấy sự biểu hiện hay/và hoạt Chương 1. Tổng quan tài liệu 14 động quá mức của FAK. Bởi vai trò quan trọng của FAK nên tác nhân ức chế được hoạt động của FAK rất có thể là một thuốc kháng ung thư tiềm năng [47]. Trong luận văn này, chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của RV lên sự hoạt động của FAK trong mối liên quan đến sự bám dính của tế bào ung thư. 1.3.1. Sơ lược cấu trúc phân tử của FAK FAK là một protein tyrosine kinase của tế bào chất có trọng lượng phân tử là 125 kDa, hoạt động trong phức hợp bám dính trung tâm (focal adhesion), nơi các protein truyền tín hiệu nội bào tập trung sau khi tế bào bám vào giá thể nhờ sự hoạt hóa integrin. Cấu trúc phân tử của FAK gồm có ba vùng (domain) chính: đầu N, kinase trung tâm, và đầu C, mỗi vùng gồm khoảng 400 amino acid (hình 1.8). Vùng đầu C, còn được gọi là vùng Focal Adhesion Targeting (FAT) có vai trò gắn FAK Binds EGFR, PDGFR receptors Hình 1.8. Cấu trúc phân tử của FAK. [49] Chương 1. Tổng quan tài liệu 15 vào phức hợp gắn trung tâm và gắn với talin, paxillin. Hai vùng giàu proline ở đầu C (P1 và P2) có chức năng gắn với một số protein có vùng SH3 như Cas (Crk associated substrate), GRAF (GTPase regulator associated with FAK), hay ASAP1 (Arf GTPase - activating protein ) nhằm điều hòa sự di động, khung xương tế bào. Vùng kinase trung tâm có hai vị trí tyrosine (Tyr) kinase Y576 và Y577 giúp điều hòa hoạt động kinase của FAK. Vùng đầu N của FAK, còn được gọi là FERM (FAK-Ezrin-Radixin-Moesin), tương tác với các thụ thể của nhân tố tăng trưởng như thụ thể nhân tố tăng trưởng biểu mô (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR), thụ thể nhân tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu (Platelet - Derived Growth Factor Receptor, PDGFR). Ngoài ra, vùng này còn có vị trí Tyr kinase Y397 có vai trò rất quan trọng trong quá trình hoạt hóa FAK [29], [47], [49]. 1.3.2. Sự điều hòa hoạt động của FAK Sự hoạt hóa FAK Mặc dù một số nghiên cứu ban đầu cho thấy sự tập trung (clustering) các integrin trên màng tế bào trong đáp ứng với sự bám dính của tế bào lên giá thể sẽ hoạt hóa FAK, nhưng cơ chế chính xác vẫn chưa được hiểu rõ. Sự hoạt hóa FAK cần sự định vị của FAK trong phức hợp bám dính trung tâm và sự tự phosphoryl hóa ở vị trí Tyr-397 xảy ra khi các integrin tập trung trên màng tế bào trong đáp ứng với sự bám dính của tế bào lên giá thể. Các nghiên cứu in vitro cho thấy tương tác trực tiếp giữa vùng FERM với phần nằm trong tế bào chất của intergrin dẫn đến sự tự phosphoryl hóa nhanh chóng của Tyr-397. Quá trình tự phosphoryl hóa Tyr-397 có thể là một quá trình nội phân tử hay liên phân tử. Một số nghiên cứu khác cho thấy tương tác giữa vùng FAT với các protein paxillin và talin giúp cho sự định vị ổn định của FAK trong phức hợp bám dính trung tâm [23], [29], [47]. Sự ức chế hoạt động của FAK Hoạt động của FAK bị ức chế bởi protein tương tác với FAK có trọng lượng phân tử 200 kDa (FAK family interacting protein, FIP200). FIP2000 được xác định Chương 1. Tổng quan tài liệu 16 qua quá trình sàng lọc sử dụng hệ thống “hai thành phần” (yeast two-hydrid system). FIP200 gắn với vùng kinase trung tâm của FAK và ức chế hoạt động của FAK. Ngoài ra, một số tyrosine phosphatase cũng có vai trò điều hòa hoạt động của FAK như PTP-, Shp-2 và PTEN [29]. Con đường dẫn truyền tín hiệu thông qua FAK (hình 1.8) FAK có vùng đầu N gắn được với các thụ thể của nhân tố tăng trưởng, và vùng đầu C gắn với in