Nghiên cứu chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen mã hóa telomerase reverse transcriptase (hTERT)

Nghiên cứu chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen mã hóa telomerase reverse transcriptase (hTERT) Hoàng Thị Ngà Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số 60 42 01 14 Người hướng dẫn: TS. Lã Thị Huyền, PGS. TS. Nguyễn Quang Huy Năm bảo vệ: 2013 Abstract. Thiết kế vector tái tổ hợp pcDNA3.1(+)/hTERT mang đoạn gen mã hóa cho epitope của kháng nguyên hTERT. Tạo hạt nano chitosan/TPP có kích thước mong muốn. Tạo phức hệ nano chitosan-plasmid tái tổ hợp pcDNA3.1(+)/hTERT. Đánh giá khả năng mang plasmid DNA của hạt nano chitosan/TPP. Keywords. Sinh học thực nghiệm; Phức hệ Nano Chitosan; Gen mã hóa. Luận văn thạc sỹ khoa học Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Ung thƣ là một căn bệnh hiểm nghèo, bệnh nhân mắc bệnh có tỷ lệ tử vong cao và hiện nay số ngƣời mắc bệnh ngày càng tăng. Mặc dù cộng đồng y sinh đã rất nỗ lực nhƣng ung thƣ vẫn là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến cái chết, đau khổ và bệnh tật. Hầu hết các bệnh nhân ung thƣ đƣợc điều trị bởi các liệu pháp: phẫu thuật, xạ trị hoặc hóa trị. Các phƣơng pháp này cũng chỉ ngăn chặn tạm thời không tiêu diệt đƣợc tận gốc khối u nguyên phát. Bên cạnh đó, các phƣơng pháp này không đặc hiệu thƣờng gây ra tác dụng phụ gây suy nhƣợc, đau đớn cho cơ thể ngƣời bệnh, phá hủy các mô khỏe mạnh. Với hy vọng khắc phục những trở ngại trên, nhiều nhà khoa học đang tập trung phát triển liệu pháp miễn dịch để chống lại căn bệnh ung thƣ. Một trong các liệu pháp chính là sử dụng vaccine ung thƣ, vaccine ung thƣ cung cấp các lợi thế khác biệt so với phƣơng pháp tiếp cận thông thƣờng: đặc hiệu, giảm thiểu độc tính, loại bỏ đƣợc tính kháng thuốc, và tiềm năng bền trong điều trị thông qua bộ nhớ miễn dịch,... Với sự phát triển của công nghệ nano, vaccine dạng nano đang đƣợc nghiên cứu. Các vaccine dạng này thƣờng cho tính kích thích sinh miễn dịch, bảo hộ cao. Telomerase là một enzyme ribonucleoprotein cần thiết cho sự sao chép telomere của đầu cuối nhiễm sắc thể trong hầu hết các sinh vật nhân chuẩn. Telomerase ở ngƣời là một phức hệ ribonucleoprotein gồm hTR và hTERT. hTR (hoặc hTERC) (human template for replication) là RNA làm khuôn để sao chép, và hTERT (human telomerase reverse transcriptase) là enzyme phiên mã ngƣợc. Chúng hoạt động trong các tế bào mầm và tế bào ung thƣ, không hoạt động hoặc hoạt động rất thấp trong các tế bào soma. Vì vậy, việc tạo vacxin DNA mang gen mã hóa kháng nguyên hTERT sẽ mang lại nhiều triển vọng ứng dụng trong điều trị ung thƣ. Hiện nay trên thế giới có nhiều nghiên cứu về các epitope của hTERT và nhận thấy rằng chúng có đáp ứng miễn dịch rất tốt với hầu hết các tế bào ung thƣ. Luận văn thạc sỹ khoa học Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 2 Việc tạo vacxin DNA mang gen mã hóa kháng nguyên hTERT trong điều trị ung thƣ là hƣớng nghiên cứu triển vọng, nhƣng để tăng cƣờng quá trình chuyển DNA và tăng hiệu quả của vacxin cần có một chất mang. Cùng với phát triển của công nghệ nano các chất mang có bản chất polymer có khả năng liên kết và bảo vệ DNA đã đƣợc chọn làm chất truyền trung gian. Một trong các polymer đặc biệt đƣợc quan tâm là chitosan, công nghệ nano chitosan hiện nay đã đƣợc sử dụng trong lĩnh vực y học nhƣ để phân phối thuốc và đang đƣợc ứng dụng trong nhiều nghiên cứu làm vật liệu dẫn truyền vacxin DNA. Chitosan là sản phẩm biến tính của chitin, là một loại polymer không độc, có khả năng phân hủy sinh học và tan tốt trong môi trƣờng axit. Vì chitosan tích điện dƣơng nên có thể tạo phức hợp với DNA tích điện âm, do vậy nó hứa hẹn là ứng cử viên tốt cho hệ thống mang gen. Ngoài khả năng chitosan liên kết hiệu quả với DNA chúng còn có thể bảo vệ DNA khỏi phân hủy của nuclease. Xuất phát từ những cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen mã hóa telomerase reverse transcriptase (hTERT)”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Thiết kế thành công vector tái tổ hợp biểu hiện trong tế bào động vật pcDNA3.1(+)/hTERT mang đoạn gen mã hóa cho epitope của kháng nguyên telomerase reverse transcriptase (hTERT). Hệ vector tái tổ hợp này đƣợc bao gói trong nano chitosan. 3. Nội dung nghiên cứu - Thiết kế vector tái tổ hợp pcDNA3.1(+)/hTERT mang đoạn gen mã hóa cho epitope của kháng nguyên hTERT. - Tạo hạt nano chitosan/TPP có kích thƣớc mong muốn. - Tạo phức hệ nano chitosan-plasmid tái tổ hợp pcDNA3.1(+)/hTERT. Đánh giá khả năng mang plasmid DNA của hạt nano chitosan/TPP. Luận văn thạc sỹ khoa học Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Anh Dũng (2008), "Nghiên cứu chế tạo hạt nano-chitosan làm chất mang kích thích đáp ứng miễn dịch cho vaccine cúm H5N1", Báo cáo đề tài thành phố HCM, 2. Trần Đại Lâm c. s. (2010), "Một số ứng dụng trong y sinh và môi trƣờng của chitosan", Hội nghị khoa học Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 168- 172. 3. Trần Thị Luyến (2006), "Nghiên cứu sử dụng oligoglucosamin từ chitosan để giữ tƣơi thịt heo", Tạp chí khoa học và phát triển, 4. Nguyễn Thị Bích Thúy N. T. T. N., Đỗ Thị Thu Thủy (2008), "Ảnh hƣởng của nồng độ chitosan đến chất lƣợng và thời gian bảo quản chanh", Tạp chí khoa học và phát triển, Tập VI(1), 70-75. 5. Dƣơng Thị Ánh Tuyết (2010), Nghiên cứu chế tạo vật liệu nano chitosan làm chất hấp thụ protein ứng dụng trong dẫn truyền thuốc, Luận văn thạc sỹ khoa học, Trƣờng Đại học Thủ Dầu Một. TIẾNG ANH 6. Ada G. (2005), "Overview of vaccines and vaccination ", Mol Biotechnol, 29(3), 255-272. 7. Agnihotri S. A., Mallikarjuna N. N., Aminabhavi T. M. (2004), "Recent advances on chitosan-based micro- and nanoparticles in drug delivery", J Control Release, 100(1), 5-28. 8. Arai J., Yasukawa M., Ohminami H., Kakimoto M., Hasegawa A., Fujita S. (2001), "Identification of human telomerase reverse transcriptase-derived peptides that induce HLA-A24-restricted antileukemia cytotoxic T lymphocytes", Blood, 97(9), 2903-2907. 9. Bailey S. E. O., T.J.; Bricka, R.M and Adrian, D.D (1999), "A review of potentially low-cost sorbent for heavy metals", Water Research, 33(11), 2469-2479. Luận văn thạc sỹ khoa học Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 56 10. Bernhardt S. L., Gjertsen M. K., Trachsel S., Moller M., Eriksen J. A., Meo M., Buanes T., Gaudernack G. (2006), "Telomerase peptide vaccination of patients with non-resectable pancreatic cancer: A dose escalating phase I/II study", Br J Cancer, 95(11), 1474-1482. 11. Bodnar A. G., Ouellette M., Frolkis M., Holt S. E., Chiu C. P., Morin G. B., Harley C. B., Shay J. W., Lichtsteiner S., Wright W. E. (1998), "Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells", Science, 279(5349), 349- 352. 12. Bozkir A., Saka O. M. (2004), "Chitosan nanoparticles for plasmid DNA delivery: effect of chitosan molecular structure on formulation and release characteristics", Drug Deliv, 11(2), 107-112. 13. Brine C. J., Stanford, P.A, Zikalis, J.P, (1992), "Advances in chitin and chitosan", 14. Broberg K., Bjork J., Paulsson K., Hoglund M., Albin M. (2005), "Constitutional short telomeres are strong genetic susceptibility markers for bladder cancer", Carcinogenesis, 26(7), 1263-1271. 15. Brunsvig P. F., Aamdal S., Gjertsen M. K., Kvalheim G., Markowski-Grimsrud C. J., Sve I., Dyrhaug M., Trachsel S., Moller M., Eriksen J. A., Gaudernack G. (2006), "Telomerase peptide vaccination: a phase I/II study in patients with non-small cell lung cancer", Cancer Immunol Immunother, 55(12), 1553-1564. 16. Calvo P., J. L. Vila-Jato, and M. J. Alonson (1997), "Novel hydrophilic chitosan-polyethylene oxide nanoparticles as protein carrier", J Appl Poly Sci, 63(125-132. 17. Capezzone M., Cantara S., Marchisotta S., Filetti S., De Santi M. M., Rossi B., Ronga G., Durante C., Pacini F. (2008), "Short telomeres, telomerase reverse transcriptase gene amplification, and increased telomerase activity in the blood of familial papillary thyroid cancer patients", J Clin Endocrinol Metab, 93(10), 3950-3957. Luận văn thạc sỹ khoa học Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 57 18. Carrero-Gomez B. A. D., R., (1997), "Evaluation of the biological properties of soluble chitosan and chitosan microspheres", Int J Pharm, 148(131-140. 19. Cattamanchi A., Posavad C. M., Wald A., Baine Y., Moses J., Higgins T. J., Ginsberg R., Ciccarelli R., Corey L., Koelle D. M. (2008), "Phase I study of a herpes simplex virus type 2 (HSV-2) DNA vaccine administered to healthy, HSV-2-seronegative adults by a needle-free injection system", Clin Vaccine Immunol, 15(11), 1638-1643. 20. Cesare A. J., Reddel R. R. (2008), "Telomere uncapping and alternative lengthening of telomeres", Mech Ageing Dev, 129(1-2), 99-108. 21. Cheba B. A. (2011), "Chitin and chitosan: Marine Biopolymers with Unique Properties and Versatide Applications", Global Joumal of Biotechnology & Biochemistry, 6(3), 149-153. 22. Chow KS K. E., Wan ACA (2001), "Porous chitin matrices for tissue engineering: fabrication and in - vitro cytotoxic assessment", J Polym Res, 8(27-35. 23. Cong Y. S., Wright W. E., Shay J. W. (2002), "Human telomerase and its regulation", Microbiol Mol Biol Rev, 66(3), 407-425, table of contents. 24. Dastan T. a. K. T. (2004), "In vitro characterization and delivery of chitosan- DNA microparticles into mammalian cells", J Pharm Pharm Sci, 7(2), 205- 214. 25. Davis H. L. (1997), "Plasmid DNA expression systems for the purpose of immunization", Curr Opin Biotechnol, 8(5), 635-646. 26. de Lange T. (2004), "T-loops and the origin of telomeres", Nat Rev Mol Cell Biol, 5(4), 323-329. 27. de Lange T. (2002), "Protection of mammalian telomeres", Oncogene, 21(4), 532-540. 28. Erbacher P., Zou S., Bettinger T., Steffan A. M., Remy J. S. (1998), "Chitosan- based vector/DNA complexes for gene delivery: biophysical characteristics and transfection ability", Pharm Res, 15(9), 1332-1339. Luận văn thạc sỹ khoa học Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 58 29. Faurez F., Dory D., Le Moigne V., Gravier R., Jestin A. (2010), "Biosafety of DNA vaccines: New generation of DNA vectors and current knowledge on the fate of plasmids after injection", Vaccine, 28(23), 3888-3895. 30. Feng J., Funk W. D., Wang S. S., Weinrich S. L., Avilion A. A., Chiu C. P., Adams R. R., Chang E., Allsopp R. C., Yu J., et al. (1995), "The RNA component of human telomerase", Science, 269(5228), 1236-1241. 31. Filaci G., Fravega M., Setti M., Traverso P., Millo E., Fenoglio D., Negrini S., Ferrera F., Romagnoli A., Basso M., Contini P., Rizzi M., Ghio M., Benatti U., Damonte G., Ravetti J. L., Carmignani G., Zanetti M., Indiveri F. (2006), "Frequency of telomerase-specific CD8+ T lymphocytes in patients with cancer", Blood, 107(4), 1505-1512. 32. Gan Q., Wang T. (2007), "Chitosan nanoparticle as protein delivery carrier-- systematic examination of fabrication conditions for efficient loading and release", Colloids Surf B Biointerfaces, 59(1), 24-34. 33. Greider C. W. (1994), "Mammalian telomere dynamics: healing, fragmentation shortening and stabilization ", Curr Opin Genet Dev, 4(2), 203-211. 34. Gryaznov S. M., Jackson S., Dikmen G., Harley C., Herbert B. S., Wright W. E., Shay J. W. (2007), "Oligonucleotide conjugate GRN163L targeting human telomerase as potential anticancer and antimetastatic agent", Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 26(10-12), 1577-1579. 35. Gurunathan S., Klinman D. M., Seder R. A. (2000), "DNA vaccines: immunology, application, and optimization*", Annu Rev Immunol, 18(927- 974. 36. Hahn W. C., Stewart S. A., Brooks M. W., York S. G., Eaton E., Kurachi A., Beijersbergen R. L., Knoll J. H., Meyerson M., Weinberg R. A. (1999), "Inhibition of telomerase limits the growth of human cancer cells", Nat Med, 5(10), 1164-1170. Luận văn thạc sỹ khoa học Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 59 37. Harley C. B., Futcher A. B., Greider C. W. (1990), "Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts", Nature, 345(6274), 458-460. 38. Hathcock K. S., Hemann M. T., Opperman K. K., Strong M. A., Greider C. W., Hodes R. J. (2002), "Haploinsufficiency of mTR results in defects in telomere elongation", Proc Natl Acad Sci U S A, 99(6), 3591-3596. 39. Herbert B., Pitts A. E., Baker S. I., Hamilton S. E., Wright W. E., Shay J. W., Corey D. R. (1999), "Inhibition of human telomerase in immortal human cells leads to progressive telomere shortening and cell death", Proc Natl Acad Sci U S A, 96(25), 14276-14281. 40. Hochreiter A. E., Xiao H., Goldblatt E. M., Gryaznov S. M., Miller K. D., Badve S., Sledge G. W., Herbert B. S. (2006), "Telomerase template antagonist GRN163L disrupts telomere maintenance, tumor growth, and metastasis of breast cancer", Clin Cancer Res, 12(10), 3184-3192. 41. Ingolotti M., Kawalekar O., Shedlock D. J., Muthumani K., Weiner D. B. (2010), "DNA vaccines for targeting bacterial infections", Expert Rev Vaccines, 9(7), 747-763. 42. Jang J. S., Choi Y. Y., Lee W. K., Choi J. E., Cha S. I., Kim Y. J., Kim C. H., Kam S., Jung T. H., Park J. Y. (2008), "Telomere length and the risk of lung cancer", Cancer Sci, 99(7), 1385-1389. 43. Joseph I., Tressler R., Bassett E., Harley C., Buseman C. M., Pattamatta P., Wright W. E., Shay J. W., Go N. F. (2010), "The telomerase inhibitor imetelstat depletes cancer stem cells in breast and pancreatic cancer cell lines", Cancer Res, 70(22), 9494-9504. 44. Kaats G. R., Michalek J. E., Preuss H. G. (2006), "Evaluating efficacy of a chitosan product using a double-blinded, placebo-controlled protocol", J Am Coll Nutr, 25(5), 389-394. 45. Khor E., Lim L. Y. (2003), "Implantable applications of chitin and chitosan", Biomaterials, 24(13), 2339-2349. Luận văn thạc sỹ khoa học Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 60 46. Kim N. W. (1997), "Clinical implications of telomerase in cancer", Eur J Cancer, 33(5), 781-786. 47. Kim N. W., Piatyszek M. A., Prowse K. R., Harley C. B., West M. D., Ho P. L., Coviello G. M., Wright W. E., Weinrich S. L., Shay J. W. (1994), "Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer", Science, 266(5193), 2011-2015. 48. Kipling D. (1997), "Telomere structure and telomerase expression during mouse development and tumorigenesis", Eur J Cancer, 33(5), 792-800. 49. Koping-Hoggard M., Tubulekas I., Guan H., Edwards K., Nilsson M., Varum K. M., Artursson P. (2001), "Chitosan as a nonviral gene delivery system. Structure-property relationships and characteristics compared with polyethylenimine in vitro and after lung administration in vivo", Gene Ther, 8(14), 1108-1121. 50. Kutzler M. A., Weiner D. B. (2008), "DNA vaccines: ready for prime time?" Nat Rev Genet, 9(10), 776-788. 51. Kyte J. A. (2009), "Cancer vaccination with telomerase peptide GV1001", Expert Opin Investig Drugs, 18(5), 687-694. 52. L. Qui Z. X., X. Jiang, C. Hu and X. Zou (2004), "Preparation and antibacterial activity of chitosan nanoparticle", Carbohydrate Reseach, 339(2693-2700. 53. Lansdorp P. M., Verwoerd N. P., van de Rijke F. M., Dragowska V., Little M. T., Dirks R. W., Raap A. K., Tanke H. J. (1996), "Heterogeneity in telomere length of human chromosomes", Hum Mol Genet, 5(5), 685-691. 54. Lee V. F. (1974), "Solution and shear properties of chitin and chitosan. Ph.D.Dissertation, university of Washington, university microfilms", Ann Arbor, MI, USA, Microfilm, 446(74-29. 55. Leong K. W., Mao H. Q., Truong-Le V. L., Roy K., Walsh S. M., August J. T. (1998), "DNA-polycation nanospheres as non-viral gene delivery vehicles", J Control Release, 53(1-3), 183-193. Luận văn thạc sỹ khoa học Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 61 56. Liu D., Safari A., O'Connor M. S., Chan D. W., Laegeler A., Qin J., Songyang Z. (2004), "PTOP interacts with POT1 and regulates its localization to telomeres", Nat Cell Biol, 6(7), 673-680. 57. Mao H. Q., Roy K., Troung-Le V. L., Janes K. A., Lin K. Y., Wang Y., August J. T., Leong K. W. (2001), "Chitosan-DNA nanoparticles as gene carriers: synthesis, characterization and transfection efficiency", J Control Release, 70(3), 399-421. 58. Martens U. M., Zijlmans J. M., Poon S. S., Dragowska W., Yui J., Chavez E. A., Ward R. K., Lansdorp P. M. (1998), "Short telomeres on human chromosome 17p", Nat Genet, 18(1), 76-80. 59. Meyerson M., Counter C. M., Eaton E. N., Ellisen L. W., Steiner P., Caddle S. D., Ziaugra L., Beijersbergen R. L., Davidoff M. J., Liu Q., Bacchetti S., Haber D. A., Weinberg R. A. (1997), "hEST2, the putative human telomerase catalytic subunit gene, is up-regulated in tumor cells and during immortalization", Cell, 90(4), 785-795. 60. Mirabello L., Garcia-Closas M., Cawthon R., Lissowska J., Brinton L. A., Peplonska B., Sherman M. E., Savage S. A. (2010), "Leukocyte telomere length in a population-based case-control study of ovarian cancer: a pilot study", Cancer Causes Control, 21(1), 77-82. 61. Moghaddam F. A., Atyabi F., Dinarvand R. (2009), "Preparation and in vitro evaluation of mucoadhesion and permeation enhancement of thiolated chitosan-pHEMA core-shell nanoparticles", Nanomedicine, 5(2), 208-215. 62. Muzzarelli R. A. (1997), "Human enzymatic activities related to the therapeutic administration of chitin derivatives", Cell Mol Life Sci, 53(2), 131-140. 63. Nakamura T. M., Morin G. B., Chapman K. B., Weinrich S. L., Andrews W. H., Lingner J., Harley C. B., Cech T. R. (1997), "Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human", Science, 277(5328), 955-959. 64. Nakayama J., Tahara H., Tahara E., Saito M., Ito K., Nakamura H., Nakanishi T., Tahara E., Ide T., Ishikawa F. (1998), "Telomerase activation by hTRT in Luận văn thạc sỹ khoa học Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 62 human normal fibroblasts and hepatocellular carcinomas", Nat Genet, 18(1), 65-68. 65. Nguyen Anh Dung N. T. N. H., Dang Thi Hong Van, Nguyen Thi Lan Phuong, Nguyen Thi Nhu Quynh, Dinh Minh Hiep, Le Van Hiep (2011), "Chitosan nanoparticle as a novel delivery system for A/H1N1 influenze vaccine: safe property and immunogenicity in mice", World Academy of Science, Engineering and Technology, 5(12), 1300-1308. 66. No H. K., Park N. Y., Lee S. H., Meyers S. P. (2002), "Antibacterial activity of chitosans and chitosan oligomers with different molecular weights", Int J Food Microbiol, 74(1-2), 65-72. 67. Okamoto Y., Watanabe M., Miyatake K., Morimoto M., Shigemasa Y., Minami S. (2002), "Effects of chitin/chitosan and their oligomers/monomers on migrations of fibroblasts and vascular endothelium", Biomaterials, 23(9), 1975-1979. 68. Park I. K., Park Y. H., Shin B. A., Choi E. S., Kim Y. R., Akaike T., Cho C. S. (2000), "Galactosylated chitosan-graft-dextran as hepatocyte-targeting DNA carrier", J Control Release, 69(1), 97-108. 69. Pascual E., Julia M. R. (2001), "The role of chitosan in wool finishing", J Biotechnol, 89(2-3), 289-296. 70. Purbhoo M. A., Li Y., Sutton D. H., Brewer J. E., Gostick E., Bossi G., Laugel B., Moysey R., Baston E., Liddy N., Cameron B., Bennett A. D., Ashfield R., Milicic A., Price D. A., Classon B. J., Sewell A. K., Jakobsen B. K. (2007), "The HLA A*0201-restricted hTERT(540-548) peptide is not detected on tumor cells by a CTL clone or a high-affinity T-cell receptor", Mol Cancer Ther, 6(7), 2081-2091. 71. Reyes-Sandoval A., Ertl H. C. (2001), "DNA vaccines", Curr Mol Med, 1(2), 217-243. Luận văn thạc sỹ khoa học Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Kh