Nghiên cứu cơ chế phân tử của sự đề kháng kháng sinh nhóm Fluoroquinolone trên vi khuẩn Streptococcus nhóm B phân lập tại Hàn Quốc

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Chuyên Đề Dược Học 78 NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ PHÂN TỬ CỦA SỰ ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH NHÓM FLUOROQUINOLONE TRÊN VI KHUẨN STREPTOCOCCUS NHÓM B PHÂN LẬP TẠI HÀN QUỐC Đặng Nguyễn Đoan Trang*, Usha Srinivasany**, Zachary Britt**, Carl F. Marrs**, Lixin Zhang**, Moran Ki***, Betsy Foxman** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Streptococcus nhóm B (Group B Streptococcus, GBS) là nguyên nhân chính của nhiễm trùng ở trẻ sơ sinh và cũng là nguyên nhân thường gặp ở nhiễm trùng người lớn có những tổn thương về miễn dịch.Sự đề kháng kháng sinh nhóm fluoroquinolone trên GBS đã được báo cáo ở nhiều nước trên thế giới. Đối tương và phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu được tiến hành trên 1075 mẫu vi khuẩn phân lập từ bệnh phẩm của các bệnh nhân tại các bệnh viện ở Hàn Quốc. Đột biến trên các gene mã hóa các enzyme gyrase và topoisomerase được xác định bằng kỹ thuật PCR và giải mã trình tự chuỗi DNA đặc hiệu. Hoạt động của bơm đẩy được xác định thông qua sự thay đổi nồng độ ức chế tối thiểu của norfloxacin và ethidium bromide trên GBS với sự có mặt của reserpine (20 µg/mL). Kết quả: Sự đề kháng ciprofloxacin, levofloxacin và moxifloxacin có liên quan đến đột biến trên các gene mã hóa các enzyme gyrase và topoisomerase. Bằng chứng về hoạt động của bơm đẩy được phát hiện trên 52,2 % các vi khuẩn đề kháng với norfloxacin nhưng không có đột biến. Từ khóa: Fluoroquinolones, norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin, đột biến, bơm đẩy, MIC ABSTRACT MOLECULAR MECHANISMS OF RESISTANCE TO FLUOROQUINOLONES AMONG CLINICAL STRAINS OF GROUP B STREPTOCOCCUSFROM SOUTH KOREA Dang Nguyen Doan Trang, Usha Srinivasan, Zachary Britt, Carl F. Marrs, Lixin Zhang, Moran Ki, Betsy Foxman * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 - Supplement of No 4 - 2013: 78 - 82 Introduction: Group B Streptococcus (GBS) is a major cause of neonatal sepsis and an emerging cause of infection in immune-compromised adult populations. GBS resistance to fluoroquinolones has been reported in many countries worldwide. Materials and methods: The study collection included 1075 clinical strains of GBS isolated from South Korea. Mutations in genes encoding gyrase and topoisomerase were identified by PCR with specific primers followed by sequencing. Evidence of efflux-mediated resistance to norfloxacin was identified by changes in MIC of norfloxacin and ethidium bromide in the presence of reserpine (20 µg/mL), an efflux pump inhibitor.. Results: Mutations were detected in strains resistant to ciprofloxacin, levofloxacin and moxifloxacin. Evidence of the efflux phenotype was found in 52,2% of GBS strains resistant only to norfloxacin with no known mutations. Keywords: Fluoroquinolones, norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin, mutations, efflux, MIC * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh ** Khoa Dịch tễ, Đại học Michigan, Hoa Kỳ *** 3Khoa Y học Dự phòng, Trường Đại học Y khoa Eulji, Daejeon, Hàn Quốc Tác giả liên lạc: DS. Đặng Nguyễn Đoan Trang ĐT: 0909907976 Email: dtrangpharm@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 79 ĐẶT VẤN ĐỀ Streptococcus nhóm B (Group B Streptococcus, Streptococcus agalactiae, GBS) là nguyên nhân chính của nhiễm trùng ở trẻ sơ sinh và cũng là nguyên nhân thường gặp ở nhiễm trùng người lớn có những tổn thương về miễn dịch(3). Sự đề kháng kháng sinh nhóm fluoroquinolone trên GBS đã được báo cáo ở nhiều nước trên thế giới (4,9,11,12). Trong một nghiên cứu tại Mỹ (12), tỷ lệ đề kháng levofloxacin trên GBS là 4,4%. Theo nghiên cứu của Savoia D. và cộng sự tại Ý, tỷ lệ đề kháng norfloxacin, ciprofloxacin, ofloxacin, pefloxacin và levofloxacin trên GBS lần lượt là 6,8%, 2,7%, 6,8%, 10,9% và 1,3% (11). Trong nhiều nghiên cứu đã được báo cáo, sự đề kháng các fluoroquinolone trên một số vi khuẩn gram dương bao gồm GBS liên quan đến đột biến trên các gene mã hóa các enzyme gyrase và topoisomerase làm giảm khả năng gắn kết và giảm hoạt tính của các fluoroquinolone. Sự đề kháng các fluoroquinolone trên vi khuẩn gram dương còn được giải thích bởi cơ chế bơm đẩy trên Staphylococcus aureus(5), Streptococcus pneumonia (8), Streptococcus pyogenes (8) và Streptococcus suis (8) nhưng chưa có báo cáo trên GBS. Trên một nghiên cứu trên 1075 mẫu GBS được phân lập từ các bệnh phẩm tại các bệnh viện ở Hàn Quốc, tỷ lệ đề kháng các fluoroquinolones khá cao, đặc biệt đối với norfloxacin (tỷ lệ đề kháng với norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin và moxifloxacin lần lượt là 93%, 8,9%, 8,1% và 0,8%) (7). Tỷ lệ đề kháng này đặt ra vấn đề cần xác định cơ chế đề kháng ở mức độ phân tử của các vi khuẩn phân lập được nhằm góp phần vào việc lựa chọn kháng sinh hiệu quả trong trị liệu cũng như nghiên cứu các công thức thuốc mới có hiệu quả cao trên GBS. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chọn mẫu nghiên cứu Việc xác định các đột biến trên các gene mã hóa gyrase và topoisomerase được tiến hành trên 95 mẫu GBS được lựa chọn ngẫu nhiên từ 1075 mẫu GBS phân lập từ nước tiểu, âm đạo, trực tràng, vết thương của các bệnh nhân nhập viện từ các bệnh viện ở Hàn Quốc từ năm 2006 đến 2008. Sau khi xác định các đột biến, 146 mẫu GBS được tiếp tục thử nghiệm để xác định hoạt động của bơm đẩy bao gồm 88 mẫu chỉ đề kháng với norfloxacin (20 trong số này đã qua xác định đột biến) và 58 mẫu đề kháng với các fluoroquinolone khác đã qua xác định đột biến. Phân lập GBS GBS được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm bằng cách nuôi cấy trên môi trường chọn lọc. Thử nghiệm catalase và phản ứng ngưng kết latex (Streptex; Murex Biotech Ltd., Dartford, Anh) được sử dụng để phát hiện và xác định GBS. Xác định tính nhạy cảm của GBS đối với các kháng sinh nhóm fluoroquinolone Tính nhạy cảm của GBS đối với các kháng sinh nhóm fluoroquinolone(norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin và moxifloxacin) được xác định bằng máy kháng sinh đồ tự động VITEK II (thực hiện tại Seoul Clinical Laboratories và Seoul Medical Science Institute) dựa trên các tiêu chuẩn EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) 2009 và 2011. Trên 1075 mẫu GBS nghiên cứu, tỷ lệ đề kháng với norfloxacin, ciprofloxacin, levofloxacin và moxifloxacin phát hiện lần lượt là 93%, 8,9%, 8,1% và 0,8%. Xác định đột biến trên vùng QRDR (Quinolone Resistance Determining Region) Các bước xác định đột biến trên vùng QRDR của các gene gyr và par (mã hoá các enzyme gyrase và topoisomerase): Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Chuyên Đề Dược Học 80 - Vùng QRDR được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với các đoạn mồi đặc hiệu của gyrA, gyrB, parC và parE (12). Phản ứng PCR được tiến hành trong điều kiện như sau: biến tính chuỗi DNA ở 94oC trong 3 phút, 30 chu kỳ nhiệt bao gồm giai đoạn bắt cặp ở nhiệt độ 45oC trong 30 giây và giai đoạn kéo dài ở 68oC trong 1 phút, giai đoạn kéo dài cuối cùng ở 68oC trong 6 phút. Sản phẩm PCR được tiếp tục phân tích bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 1% trong đệm Tris- acetic acid/EDTA (pH 7.5) với chất nhuộm gel an toàn GelRed và soi bằng nguồn sáng đèn UV. - Sản phẩm PCR được giải mã trình tự DNA (sequencing) tại Trung tâm Giải mã DNA, Đại học Michigan, Hoa Kỳ và phân tích bằng phần mềm Lasegene DNA STAR. Các chủng vi khuẩn GBS ATCC 12403 and A909 được sử dụng làm đối chứng âm trong phân tích. Xác định hoạt động của bơm đẩy (efllux pump) đối với norfloxacin Hoạt động của bơm đẩy đối với norfloxacin được xác định dựa trên sự thay đổi MIC của norfloxacin (giảm ít nhất 4 lần) và ethidium bromide (giảm ít nhất 2 lần) với sự có mặt của reserpine (20 µg/mL), một chất ức chế bơm đẩy (6,10). Mỗi kết quả MIC báo cáo là trung bình của 2 lần thử nghiệm lặp lại. Norfloxacin dùng trong thử nghiệm được cung cấp bởi Sigma Aldrich, Co., Missouri, Hoa Kỳ; reserpine được cung cấp bởi MP Biomedicals, LLC, Ohio, Hoa Kỳ và ethidium bromide được cung cấp bởi Fisher Scientific, New Jersey, Hoa Kỳ. Chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus 1199B được cấy bơm đẩy norA được sử dụng làm đối chứng dương; các chủng GBS ATCC 12403 và A909 được sử dụng làm đối chứng âm trong thử nghiệm này. Xử lý số liệu Các số liệu thu được được xử lý thống kê bằng phần mềm SAS (SAS Version 9.2 for Windows; SAS Institute Inc., Cary, NC). KẾT QUẢ Đột biến trên các gene mã hoá gyrase và topoisomerase Việc xác định đột biến được tiến hành trên các tiểu đơn vị gyrA, gyrB của gyrase và parC, parE của topoisomerase. Chỉ có những đột biến làm thay đổi ít nhất một acid amin mới được đưa vào phân tích. Không có trường hợp đột biến nào được phát hiện trên các chủng vi khuẩn nhạy cảm với tất cả bốn fluoroquinolone và những chủng vi khuẩn chỉ đề kháng với norfloxacin. Đột biến trên gyrA và parC được phát hiện trên các chủng đề kháng với ciprofloxacin, levofloxacin và moxifloxacin theo những tỷ lệ khác nhau (Bảng 1). Chỉ có ba trường hợp đề kháng với ciprofloxacin có đột biến trên gyrB và không có trường hợp đột biến trên parE nào được phát hiện. Đột biến đồng thời trên cả parC và gyrA được phát hiện trên 90% chủng vi khuẩn đề kháng với levofloxacin và 100% chủng vi khuẩn đề kháng với moxifloxacin. Tất cả những trường hợp này đều đề kháng chéo với norfloxacin và ciprofloxacin (Bảng 1). Bảng 1: Tỷ lệ đột biến trên các gene gyrA và parC trên 95 mẫu Streptococcus nhóm B (GBS) đề kháng với các fluoroquinolone phân lập từ Hàn Quốc (2006 – 2008) Tỷ lệ đột biến Đề kháng NF Đề kháng NF và CF Đề kháng LF Đề kháng MF Số lượng mẫu 20 37 29 9 Đột biến trên parC hay gyrA 0% 86% 90% 100% Đột biến trên cả parC hay gyrA 0% 4% 7% 0% Không có đột biến 100% 1% 0% 0% NF: norfloxacin, CF: ciprofloxacin, LF: levofloxacin, MF: moxifloxacin Mối liên quan giữa đột biến trên các gene gyrA và parC và MIC Có mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa sự hiện diện của đột biến trên cả hai gene par và gyr và MIC trong những trường hợp đề kháng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 81 với ciprofloxacin (p=0,001), levofloxacin (p=0,001) và moxifloxacin (p=0,001). Không có mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa đột biến trên duy nhất 1 gene (par hay gyr) và MIC. Bằng chứng về hoạt động của bơm đẩy đối với norfloxacin Trên các mẫu GBS chỉ đề kháng với norfloxacin và không có đột biến, MIC trung bình của norfloxacin khi có reserpine giảm khoảng 4 lần so với khi không có reserpine cho thấy có sự hoạt động của bơm đẩy (Bảng 2). Trên các mẫu GBS chỉ có đột biến trên duy nhất một gene (parC hay gyrA), hoạt động của bơm đẩy yếu hơn (MIC trung bình chỉ giảm 1,6 lần khi có mặt reserpine). Trên các mẫu GBS có đột biến trên cả 2 gene gyrA và parC, hoàn toàn không có sự thay đổi MIC khi có mặt reserpine chứng tỏ bơm đẩy không tồn tại hay không hoạt động (Bảng 2). Bảng 2: Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của norfloxacin khi có và không có reserpine trên 146 mẫu Streptococcus nhóm B (GBS) phân lập từ Hàn Quốc (2006-2008) Phân loại Số lượng Giá trị MIC trung bình (µg/mL) Tỷ lệ có hoạt động của bơm đẩy (%) - Reserpin e + Reserpin e Không có đột biến Nhạy cảm với các FQ Đề kháng trung gian với NF Đề kháng NF 2 9 88 4 13.3 33.9 4 7.6 12.8 0 33.3 52.2 Đột biến chỉ trên parC hay gyrA 17 41 31.5 18.8 Đột biến trên cả parC và gyrA 30 128 128 0 NF: Norfloxacin, FQ: fluoroquinolone Khi sử dụng ethidium bromide làm chất nền, bằng chứng về hoạt động của bơm đẩy được phát hiện trên 54,1% các chủng GBS chỉ đề kháng duy nhất với norfloxacin và không có đột biến. Tuy nhiên, tỷ lệ đồng thuận của hai phương pháp phát hiện bơm đẩy (sử dụng norfloxacin và ethidium bromide) chỉ ở mức trung bình (kappa=0,6, khoảng tin cậy 95%: 0,45 – 0,78) MIC của norfloxacin trên 2 chủng GBS ATCC 12403 and A909 (đối chứng âm) là 4 µg/mL. Không có sự khác biệt về MIC của norfloxacin trên 2 chủng này khi thêm reserpine. BÀN LUẬN Tỷ lệ đề kháng các kháng sinh nhóm fluoroquinolone, đặc biệt đề kháng norfloxacin, trong nghiên cứu này cao hơn kết quả của những nghiên cứu trước đây (1,6,11). Kết quả nghiên cứu cho thấy sự đề kháng ciprofloxacin và levofloxacin liên quan đến đột biến trên ít nhất một gene gyrA hay parC trong khi sự đề kháng moxifloxacin đòi hỏi phải có sự hiện diện đồng thời của hai đột biến trên cả gyrA và parC. Sự khác biệt này có thể được lý giải dựa trên cấu trúc phân tử cồng kềnh của moxifloxacin. Kết quả nghiên cứu thu được cũng khá tương đồng với kết quả của các nghiên cứu trước đây về vị trí ưu tiên tác động của các fluoroquinolone trên vi khuẩn gram dương: các quinolone không thân nước như moxifloxacin sẽ ưu tiên tấn công vào gyrase trong khi các quinolone thân nước như ciprofloxacin và levofloxacin sẽ ưu tiên tấn công vào topoisomerase (7,10). Tỷ lệ đề kháng norfloxacin của 1075 mẫu GBS nghiên cứu là 93%. Tuy nhiên, không có đột biến nào được phát hiện trong các mẫu lựa chọn ngẫu nhiên từ các trường hợp chỉ đề kháng với norfloxacin. Kết quả của thử nghiệm tiếp theo cho thấy có bằng chứng về hoạt động của bơm đẩy trên 52,2% các trường hợp chỉ đề kháng với norfloxacin. Như vậy, bơm đẩy có thể là nguyên nhân dẫn đến đề kháng norfloxacin trên GBS. Trên GBS, hoạt động của bơm đẩy dẫn đến đề kháng macrolide(2) và tetracycline(1) đã được báo cáo nhưng chưa có nghiên cứu nào về hoạt động của bơm đẩy trên fluoroquinolones. Kết quả nghiên cứu này chính là phát hiện đầu tiên về hoạt động của bơm đẩy dẫn đến đề kháng norfloxacin trên GBS. Tuy nhiên, đây chỉ là bước khởi đầu. Trong tương lai, cần tiến hành thêm Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 4 * 2013 Chuyên Đề Dược Học 82 nhiều nghiên cứu khác để xác định rõ hơn cơ chế đề kháng các fluoroquinolone của GBS nhằm góp phần vào việc lựa chọn kháng sinh hiệu quả trong điều trị cũng phát triển các hoạt chất và các phối hợp thuốc mới hiệu quả trên GBS (Ví dụ: phối hợp chất có tác dụng ức chế hoạt động của bơm đẩy và fluoroquinolone). Lời cám ơn: Xin chân thành cám ơn TS. Glenn W. Kaatz, Đại học Wayne State, Detroit, Michigan đã cung cấp mẫu đối chứng cho nghiên cứu; Quỹ Nghiên cứu Korea Research Foundation, Hàn Quốc và Trung tâm MAC-EPID (The Center for Molecular and Clinical Epidemiology of Infectious Diseases), Đại học Michigan, Hoa Kỳ đã tài trợ cho nghiên cứu này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Brown MG, Mitchell EH, Balkwill DL. (2008). Tet 42, a novel tetracycline resistance determinant isolated from deep terrestrial subsurface bacteria. Antimicrob. Agents Chemother., 52: 4518–4521. 2. Cai Y, Kong F, Gilbert GL. (2007).Three new macrolide efflux (mef) gene variants in Streptococcus agalactiae. J. Clin. Microbiol. , 45: 2754–2755. 3. GIBBS RS, SCHRAG S, SCHUCHAT A. (2004). Perinatal infections due to group B streptococci. Obstet. Gynecol. ,104: 1062-1076. 4. Gonzalez JJ, Andreu A. (2005). Multicenter study of the mechanisms of resistance and clonal relationships of Streptococcus agalactiae isolates resistant to macrolides, lincosamides, and ketolides in Spain. Antimicrob. Agents and Chemother., 49: 2525–2527. 5. Kaatz GW, Mcaleese F, Seo SM. (2005). Multidrug resistance in Staphylococcus aureus due to overexpression of a novel multidrug and toxin extrusion (MATE) transport protein. Antimicrob. Agents Chemother. , 49: 1857–1864. 6. Kaatz GW et al. (2000). Evidence for the existence of a multidrug efflux transporter distinct from NorA in Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. , 44: 1404-1406. 7. KI M et al. (2012). Emerging fluoroquinolone resistance in Streptococcus agalatiae from South Korea. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 31: 3199-205. 8. Li X-Z, Nikaido H. (2009). Efflux-mediated drug resistance in bacteria: an update. Drugs, 69: 1555–1623. 9. MAEDA K et al. (2008). Fluoroquinolone-resistant group B streptococci in acute Exacerbation of Chronic Bronchitis. Emerging Infect. Diseases,14: 349-350. 10. Patel D et al.(2010). Ethidium bromide MIC screening for enhanced eflux pump gene expression or efflux activity in Staphylococcus aureus. Antimicrob. Agents Chemother. 2010; 54: 5070-5073. 11. Savoia D et al. (2008). Streptococcus agalactiae in pregnant women: phenotypic and genotypic characters. J. Infect., 56: 120-125. 12. Wehbeh W et al. (2005). Fluoroquinolone-resistant Streptococcus agalactiae: Epidemiology and mechanism of resistance. Antimicrob. Agents Chemother., 49: 2495-2497. Ngày nhận bài báo: 13.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 24.12.2012 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014