Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn cao chiết ethanol 70% từ lá chùm ngây (Moringa oleifera)

715 NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CAO CHIẾT ETHANOL 70% TỪ LÁ CHÙM NGÂY (Moringa oleifera) Phạm Minh Nhựt Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH, trường Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh TÓM TẮT Trong xã hội phát triển hiện nay, thảo dược được xem là một giải pháp an toàn và hiệu quả trong việc điều trị bệnh, và lá chùm ngây được xem là một trong những đối tượng có nhiều tiềm năng. Trong nghiên cứu này, lá chùm ngây (Moringa oleifera) được thu tại tỉnh Vĩnh Long được phơi khô, xay nhuyễn và tách chiết cao bằng dung môi ethanol 70% bằng phương pháp ngấm kiệt. Dịch chiết được cô ở 400C và thu cao. Tiến hành đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và chỉ số MIC của cao chiết này với 15 chủng vi khuẩn chỉ thị bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch ở nồng độ mg/ml. Kết quả cho thấy cao chiết ức chế 11/15 chủng vi khuẩn với đường kính vòng kháng từ 8,3 – 10,8 mm. Kết quả MIC, nồng độ của MoEE từ 12,5 mg/ml đến 50 mg/ml. Trong cao chiết, có sự hiện diện của carbohydrate, alkaloid, saponin, cardiac glycoside, flavonoid, các hợp chất phenol, tannin, steroid và amino acid. Từ khóa: Cao chiết ethanol, lá chùm ngây, hoạt tính kháng khuẩn, MIC, thành phần hóa học. 1. GIỚI THIỆU Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng các loại cây cỏ thiên nhiên nhằm mục đích trị bệnh, vì đây là một liệu pháp an toàn, dễ tìm, đồng thời mang đến hiệu quả cao. Khi xã hội ngày càng phát triển cùng với những tiến bộ của khoa học kỹ thuật thì các nhà khoa học đã không ngừng nghiên cứu tạo ra các loại thuốc tây y giúp hỗ trợ điều trị bệnh tốt hơn, trong đó, phần lớn là các loại thuốc kháng sinh. Mặc dù kháng sinh giải quyết rất nhiều vấn đề liên quan đến trị bệnh và mang lại lợi ích rất lớn cho con người, nhưng cũng chính việc sử dụng kháng sinh cũng dẫn đến hiện tượng kháng thuốc xảy ra nhiều hơn. Nguyên nhân chủ yếu là do việc lạm dụng, sử dụng thuốc kháng sinh tùy tiện, tràn lan của con người. Dẫn đến hiện tượng xuất hiện ngày càng nhiều chủng vi khuẩn kháng kháng sinh, kể cả những loại kháng sinh thế hệ mới. Để giải quyết vấn đề này là sử dụng các nhóm chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ thực vật kết hợp với y học hiện đại để thay thế dần các loại kháng sinh hiện nay vì vừa có thể mang lại hiệu quả điều trị bệnh vừa đảm bảo an toàn đồng thời phòng ngừa hiện tượng kháng thuốc của vi sinh vật gây bệnh. Cây chùm ngây (Moringa oleifera) là một cây thảo dược mọc hoang ở khắp nước ta, dược liệu này rất dễ trồng trọt, thu hái, chế biến. Thuộc nhóm cây thân mộc cao cỡ trung bình, ở độ tuổi trưởng thành cây có thể mọc cao hàng chục mét. 1 tuổi nếu không cắt ngọn cây có thể cao tới 5-6m và có đường kính 10 cm. 3- 4 năm tuổi là cây ở độ tuổi trưởng thành. Thân cây óng chuốt, không có gai. Lá kép dài 30–60 cm, hình lông chim, màu xanh mốc; lá chét dài 12–20 mm hình trứng, mọc đối có 6-9 đôi. Cây trổ hoa vào các tháng 1–2. Hoa trắng kem, có cuống, hình dạng giống hoa đậu, mọc thành chùy ở nách lá, có lông tơ, nhiều mật. Quả dạng nang treo, dài 25–40 cm, ngang 2 cm, có 3 cạnh, chỗ có hạt hơi gồ lên, dọc theo quả có khía rãnh. Hạt màu đen, tròn có 3 cạnh, lớn cỡ hạt đậu Hà Lan. Mặc dù chùm ngây đã được sử dụng từ lâu đời nhưng những công trình nghiên cứu về cây vẫn còn hạn chế. Việc đánh giá hoạt tính sinh học của chùm ngây là điều hết sức cần thiết, góp phần hoàn thiện một phương thuốc dân gian có tiềm năng sử dụng trong điều trị bệnh. Với cơ sở khoa học và ý nghĩa thực tiễn 716 trên, nghiên cứu này được thực hiện để đánh giá một số hoạt tính sinh học bao gồm hoạt tính kháng khuẩn để làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Nguồn mẫu cây thuốc và tách chiết cao Lá cây chùm ngây được thu tại xã An Bình, huyện Long Hồ, tỉnh Vĩnh Long. Các mẫu này được phơi khô, xay nhuyễn và tách chiết với cồn 70% bằng phương pháp ngâm dầm với tỷ lệ 1:20 (trọng lượng/thể tích) (Milosevic et al., 2007). Dịch lọc sau đó được cô quay chân không ở nhiệt độ 400C và bảo quản ở 40C. 2.2. Chủng vi khuẩn chỉ thị Vi sinh vật chỉ thị được sử dụng trong nghiên cứu là 15 chủng vi khuẩn được cung cấp bởi Trường Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh, gồm có: E. coli, E. coli 0208, E. coli O157:H7, ETEC; Salmonella dublin, S. enteritidis, S. typhi, S. typhimurium; Shigella boydii, S. flexneri, S. sonnei; Vibrio cholerae, V. harveyi, V. alginolyticus, V. parahaemolyticus. 2.3. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết bằng phƣơng pháp khuếch tán trên giếng thạch Cao chiết cồn 70% từ lá chùm ngây sau khi được hòa tan trong DMSO 1% ở nồng độ 100 mg/ml được tiến hành đánh giá mức độ kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch (well diffusion agar) (Sen, Batra, 2012). Tiến hành tăng sinh các chủng vi khuẩn khảo sát trong môi trường TSB bổ sung NaCl với nồng độ 15 g/l đối với Vibrio sp. và môi trường TSB đối với các chủng vi khuẩn còn lại ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Đo OD600nm xác định mật độ và pha loãng để đạt mật độ là 106 cfu/ml. Hút 100 l dịch vi khuẩn sau khi pha loãng cho vào môi trường TSA hoặc TSA bổ sung NaCl (15g/l) và trang đều đến khi khô dịch rồi đục lỗ có đường kính 8 mm. Hút 100 μl dịch cao ở các nồng độ khảo sát cho vào các giếng. Đối chứng là DMSO 1%. Đem ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Tiến hành đo đường kính vòng kháng khuẩn (mm) xung quanh giếng. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. 2.4. Xác định sơ bộ thành phần hóa học của cao chiết Mẫu cao chiết được tiến hành thử nghiệm định tính thành phần hóa học theo phương pháp của Jayaveera et al. (2010). Các thành phần hóa học được xác định bao gồm: carbohydrate (thử nghiệm Molisch, Fehling và Barfoed), alkaloid (thử nghiệm Mayer, Dragendorff, Hager, Wagner); saponin (thử nghiệm tạo bọt), cardiac glycoside (thử nghiệm Legal; Keller – Killiani); anthraquinone glycoside (thử nghiệm Borntrager); flavonoid (thử nghiệm alkaline, Ferric Chloride); tannin (thử nghiệm Ferric chloride, lead acetate), steroid (thử nghiệm Salkowski, Libermann Burchard), amino acid (thử nghiệm Ninhydrin). 2.5. Trình bày kết quả: Thí nghiệm được lặp lại ba lần và kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD). 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả hiệu suất tách chiết cao chiết chùm ngây Bột lá cây Moringa oleifera sau khi ngâm trong dung môi ethanol 70%, lọc, thu dịch và cô dịch lọc ở 70 o C, kết thúc quá trình này thu được cao chiết ethanol 70% với hiệu suất là 18,89%. 717 3.2. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết 717hum ngây Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của MoEE ở các nồng độ 100 mg/ml đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị cho thấy rằng cao chiết này thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị. Ở nồng độ 100 mg/ml kháng 11/15 chủng vi khuẩn khảo sát với đường kính vòng ức chế từ 8,20 mm đến 10,80 mm. Theo nghiên cứu của Aibinu et al. (2007), khi đánh giá khả năng kháng khuẩn đối với S. flexneri và E. coli trên một số loại cao chiết từ cây Bryophyllum pinnatum và Kalanchoe crenata kết quả cho thấy rằng, cao methanol của Kalanchoe crenata ở nồng độ 512 mg/ml cho đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là 17 mm và 12 mm. Trong khi đó, đường kính vòng kháng khuẩn của MoEE ở nồng độ 100 mg/ml đối với E. coli và S. flexneri là 9,5 mm và 9,3 mm khi so sánh ở cùng đường kính lỗ. Mặc dù đường kính vòng kháng khuẩn của MoEE thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với S. flexneri thấp hơn so với cao methanol của Kalanchoe crenata nhưng MoEE chỉ sử dụng ở nồng độ 100 mg/ml trong khi cao methanol của Kalanchoe crenata sử dụng ở nồng độ 512 mg/ml. Khi so sánh hoạt tính kháng khuẩn đối với V.parahaemolyticus và V.harveyi của MoEE ở nồng độ 100 mg/ml với cao ethanol của Salichornia brachiata ở nồng độ 500 mg/ml cho thấy rằng MoEE ở nồng độ 100 mg/ml cho đường kính vòng kháng khuẩn là 8,5 mm và 13 mm so với 14 mm và 12 mm của cao chiết ethanol từ cây Salichornia brachiata. Bảng 1. Đường kính vòng kháng khuẩn của MoEE đối với vi khuẩn chỉ thị (mm) Vi sinh vật MoEE (100 mg/ml) Ciprofloxacin (500 µg/ml) S. dublin 9,8 ± 0,6 12,2 ± 0,8 S. enteritidis 8,5 ± 0,0 13,2 ± 0,3 S. typhimurium 8,2 ± 0,8 13,2 ± 0,3 S. typhii NA 12,2 ± 0,3 S. boydii 9,2 ± 0,8 0,00 S. sonnei NA 14,2 ± 0,3 S. flexneri 9,3 ± 0,8 13,3 ± 0,5 ETEC 10,8 ± 1,0 13,2 ± 0,3 E.coli 9,5 ± 0,5 13,2 ± 0,3 E coli O157:H7 NA 13,2 ± 0,3 E. coli 0208 NA 13,0 ± 0,3 V.alginolyticus 8,3 ± 0,3 14,2 ± 0,3 V.cholerae 8,7 ± 0,3 12,3 ± 0,3 V.harveyi 10,0 ± 0,5 13,0 ± 0,5 V.parahaemolyticus 8,5 ± 0,0 12,2 ± 0,3 NA: no activity Từ các kết quả so sánh trên có thể nhận thấy MoEE ở nồng độ 100 mg/ml có phổ kháng khuẩn khá rộng và cũng có hoạt tính kháng khuẩn khá cao. Các chủng vi khuẩn chỉ thị sử dụng trong đánh giá kháng khuẩn là các nhóm vi khuẩn gây tiêu chảy điển hình, trong đó S. enteritidis gây viêm dạ dày ruột, S. typhii và S. typhimurium gây sốt thương hàn, E. Coli gây tiêu chảy, các vi khuẩn thuộc nhóm Shigella sp. gây 718 bệnh lỵ trực trùng, V. cholerae gây bệnh dịch tả. Do đó, cao chiết ethanol từ lá cây chùm ngây có khả năng ức chế các chủng vi khuẩn này nên có tiềm năng trong việc điều trị bệnh tiêu chảy. 3.3. Kết quả xác định chỉ số MIC của cao chiết ethanol Kết quả xác định chỉ số MIC của cao chiết MoEE thực hiện bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch được trình bày trong bảng 2. Qua bảng 2 nhận thấy rằng giá trị MIC của MoEE đối với 11 chủng khảo sát biến động từ 12,5 mg/ml đến 50 mg/ml khi khảo sát bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch. Giá trị MIC của cao chiết ethanol của M. oleifera khác nhau tùy theo từng chủng vi khuẩn khảo sát. Đối với nhóm E. coli, giá trị MIC của MEE biến thiên từ nồng độ 12,5 mg/ml đến 25 mg/ml, trong đó giá trị MIC thấp nhất đối với chủng ETEC là 12,5 mg/ml. Đối với nhóm Salmonella spp. và Shigella spp., giá trị MIC được xác định từ 25 mg/ml đến 50 mg/ml trong đó giá trị MIC cao nhất đối với hai chủng S. typhimurium. Riêng đối với nhóm Vibrio spp., giá trị MIC của MoEE biến thiên từ 12,5 mg/ml đến 50 mg/ml. Như vậy, kết quả khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu của MEE bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch đối với 15 chủng vi sinh vật cho thấy rằng có 4/11 chủng vi khuẩn khảo sát bị ức chế bởi MoEE ở nồng độ 50 mg/ml; 5/11 chủng khảo sát bị ức chế ở nồng độ 25 mg/ml; 2/11 chủng bị ức chế ở nồng độ 12,5 mg/ml. Điều này chứng tỏ rằng, giá trị MIC thấp nhất ức chế được vi sinh vật của cao ethanol 70% là 12,5 mg/ml và cao nhất là 50 mg/ml khi đánh giá bằng phương pháp khuếch tán trên giếng thạch. Bảng 2. Giá trị MIC của cao chiết ethanol từ lá chùm ngây STT Chủng Giá trị MIC (mg/ml) 1 E. coli 25 2 ETEC 12,5 3 S. dublin 25 4 S. enteritidis 25 5 S. typhimurium 50 6 S. boydii 25 7 S. flexneri 25 8 V. alginolyticus 50 9 V. cholerae 50 10 V. harveyi 12,5 11 V. parahaemolyticus 50 3.4. Kết quả xác định thành phần hóa học của các loại cao chiết ethanol từ lá chùm ngây Kết quả định tính thành phần hóa học của MoEE cho thấy rằng trong dung môi EtOH 70% có khả năng tách chiết được rất nhiều hợp chất từ lá cây chùm ngây bao gồm các hợp chất thông thường và cả những hợp chất có hoạt tính sinh học. Các hợp chất được tìm thấy trong cao chiết cồn 70% của lá cây chùm ngây có sự hiện diện của hầu hết các nhóm carbohydrate (thử nghiệm Molisch, Fehling và Barfoed đều dương tính) đồng thời có sự hiện diện của amino acid. Trong cao MoEE có sự hiện diện của nhiều nhóm các hợp 719 chất có hoạt tính sinh học bao gồm các loại hợp chất trong nhóm alkaloid, saponin, cardiac glycoside, flavonoid, tannin, nhóm steroid (Bảng 4). Bảng 4. Thành phần hóa học của cao chiết từ lá chùm ngây Nhóm hợp chất Thử nghiệm Kết quả Carbohydate Thử nghiệm Molisch Thử nghiệm Fehling Thử nghiệm Barfoed + + + Alkaloid Thử nghiệm Mayer Thử nghiệm Dragendorff Thử nghiệm Hager Thử nghiệm Wagner + + + + Saponin Thử nghiệm xà phòng + Cardiac Glycoside Thử nghiệm Legal Thử nghiệm Keller Killiani + + Anthraquinone Glycoside Thử nghiệm Bontrager - Flavonoid Thử nghiệm Alkaline Thử nghiệm Shinoda Thử nghiệm Ferric chloride + + + Phenolics Thử nghiệm Chì acetate Thử nghiệm Gelatin + + Tannin Thử nghiệm Ferric chloride Thử nghiệm Chì acetate + + Steroid Thử nghiệm Salkowski Thử nghiệm Libermann Burchard + + Amino Acid Thử nghiệm Ninhydrin + (+): Dương tính; (-): Âm tính Hoạt tính kháng khuẩn của thực vật nói chung và của cao chiết chùm ngây nói riêng là do chúng có các thành phần flavonoid, hợp chất phenol, tannin và triterpenoid quyết định, Từ những kết quả định tính trên có thể kết luận rằng cao chiết chùm ngây từ EtOH 70% có hoạt tính kháng khuẩn cao đối với các chủng vi khuẩn chỉ thị. Do đó, lá cây chùm ngây là loại thảo dược có hoạt tính sinh học cao và sẽ tạo tiền đề cho những nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học của chùm ngây. 720 4. KẾT LUẬN Cao chiết ethanol 70% từ lá Chùm ngây (Moringa oleifera) ở nồng độ 100 mg/ml cho hoạt tính kháng khuẩn đối với 11/15 chủng vi khuẩn chỉ thị. Trong cao này có sự hiện diện của carbohydrate, alkaloid, saponin, cardiac glycoside, flavonoid, tannin, steroid và amino acid. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Aibinu, I.E., Akinsulire, O.R., Adenipekun, T. and Odugbemi, T.A.T. (2007) In vitro antimicrobial activity of crude extracts from plants Bryophyllum pinnatum and Kalanchoe crenata. Afr J Trad Compl Alter Med 4:338-344. [2] Jayaveera, K.N., Yoganandham, R.K., Govindarajula, Y., Kumanan, R. (2010) Phytochemical screenings, antibacterial activity and physical chemical constants of ethanolic extract of Euphorbia thymifolia Linn. Int J Pharm Pharm Sci 2:81–82. [3] Milosevic, T., Solujic, S., Sukdolak, S. (2007) In vitro study of ethanolic extract of Hypericum perforatum L. on growth and sporulation of some bacteria and fungi. Turk J Biol 31:237–241. [4] Sen, A., Batra, A. (2012) Evaluation of antibacterial activity of different solvent extracts of medical plants: Melia azedarach L. Int J Curr Pharm Res 4:67–73.