Nghiên cứu một số thành phần hóa thực vật và khả năng ức chế enzyme thủy phân tinh bột từ cám các loại gạo màu

1092 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA THỰC VẬT VÀ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME THỦY PH N TINH BỘT TỪ CÁM CÁC LOẠI GẠO MÀU Nguyễn Ngọc Hồng, Phan Thị Tuyết Ngân Trường Đại học Công nghệ TP.HCM TÓM TẮT Gạo màu có chứa sắc tố và chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học tập trung ở lớp cám. Trong nghiên cứu này một số thành phần hóa thực vật như hợp chất flavonoid, polyphenol, anthocyanin của dịch chiết ethanol từ cám ba loại gạo lứt đỏ, lứt tím và nếp than đã được xác định. Kết quả định lượng các hợp chất này cho thấy dịch chiết ethanol từ cám gạo nếp than có anthocyanin và polyphenol là cao nhất. Các dịch chiết ethanol của cám gạo được đánh giá khả năng ức chế enzyme α-amylase, đây là enzyme quan trọng trong thủy phân tinh bột có trong đường tiêu hóa của động vật. Kết quả nghiên cứu cho thấy cả ba loại dịch chiết ethanol của ba loại gạo đều có hoạt tính ức chế hai enzyme này. Những kết quả thu được trong nghiên cứu chứng minh cám gạo lứt đỏ và lứt tím có tiềm năng chống tăng đường huyết nên có thể được ứng dụng cho thú bị bệnh tiểu đường, đặc biệt cho chó mèo. Từ khóa: Cám gạo màu, cám gạo nếp than, chống tăng đường huyết, polyphenol, ức chế α-amylase. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tiểu đường (Diabetes mellitus) là một bệnh rối loạn chuyển hóa đặc trưng bởi nồng độ glucose máu tăng thường xuyên và mãn tính do tụy sản xuất thiếu hoặc do giảm tác dụng của insulin. Giống như con người, tiểu đường cũng là căn bệnh phổ biến đối với các loài động vật, đặc biệt thường thấy ở mèo và cho . Nguyên nhân gây bệnh tuýp 2 thường gặp ở thú nuôi bị thừa cân, béo phì là do cách chăm sóc và chế độ ăn uống của vật nuôi chưa hợp lý. Để phòng bệnh cũng như hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường trên vật nuôi cần có chế độ ăn uống hợp lý, an toàn để tránh nguy cơ thừa cân, béo phì dẫn đến bệnh tiểu đường [[1], [8]]. Thành phần chất có hoạt tính trong cám gạo bao gồm các thành phần kém phân cực như γ-oryzanol, tocotrienol, tocopherol và thành phần phân cực như polyphenol quyết định đặc tính sinh học của gạo [[7], [4]]. Những nghiên cứu gần đây cho thấy các sắc tố từ gạo màu có khả năng chống oxy hóa, ức chế enzyme thủy phân tinh bột [[11]] và ngăn chặn sự kháng insulin cảm ứng bởi fructose trên chuột [[2]]. Mặc dù có nhiều nghiên cứu khác nhau về hoạt tính sinh học của cám gạo lứt, gạo màu nhưng việc so sánh thành phần các hoạt chất và tác dụng ức chế enzyme thủy phân tinh bột trong đường tiêu hóa vật nuôi giúp chống tăng đường huyết của các dịch chiết từ cám các loại gạo nếp than, gạo đỏ và gạo tím chưa thấy các tài liệu nào công bố trước đó. Mục đích của nghiên cứu là so sánh lượng polyphenol, flavonoid, anthocyanin cũng như so sánh hoạt tính ức chế enzyme α-amylase của các dịch chiết ethanol từ cám của ba loại gạo là gạo nếp than (black sticky rice) và gạo tím (black rice hoặc purple rice) và gạo đỏ (red rice). 1093 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu và hóa chất nghiên cứu Gạo lứt nếp than, gạo lứt tím và gạo lứt đỏ (được trồng tại khu vực phía nam Việt Nam) được thu mua tại siêu thị ở quận Bình Thạnh, TPHCM. Cả ba loại gạo lứt này được giã và rây để thu cám cho mỗi loại. Cám gạo (sấy ở nhiệt độ 50oC đến khối lượng không đổi) được chiết với dung môi ethanol 70% theo tỉ lệ nguyên liệu: dung môi là 1:15 (w/v) ở nhiệt độ phòng (29 ± 1oC). Dịch chiết ethanol của ba loại gạo sau 24h được lọc và được loại dung môi bằng máy cô quay chân không để thu được cao chiết cồn của từng loại. α-amylase (Himedia), Folin-Ciocalteu (Darmstadt), gallic acid, rutin (Seelze), dinitrosalicylic acid (Sigma) và một số các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phân tích. 2.2 Xác định hàm lƣợng cao chiết Dịch chiết ethanol từ cám các loại gạo được loại dung môi và được xác định khối lượng cao thô thu được. Hàm lượng cao khô được xác định bằng công thức: % cao thô = W1 W2 x 100 Với W1: khối lượng của cao chiết sau khi loại dung môi; W2: Khối lượng của cám gạo trước khi chiết 2.3 Phƣơng pháp định lƣợng phenol tổng Hàm lượng phenol tổng số của cao chiết ethanol được xác định bằng phương pháp so màu quang phổ sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu theo Singleton & Rossi [[9]]. Hàm lượng phenolic tổng số được tính toán dựa vào đường chuẩn acid gallic. Kết quả được biểu diễn bằng số mg acid galic (GAE)/g cao chiết khô. 2.4 Phƣơng pháp định lƣợng flavonoid tổng Hàm lượng flavonoid được xác định theo phương pháp của Woisky and Salatino (1998) bằng phương pháp đo quang phổ [[10]]. Hàm lượng flavonoid được tính toán dựa vào đường chuẩn rutin. Kết quả được biểu diễn bằng số mg rutin (RE)/g cao chiết khô. 2.5 Phƣơng pháp định lƣợng anthocyanin tổng Định lượng anthocyanin tổng được xác dịnh bằng phương pháp pH vi sai theo phương pháp được đề nghị bởi Hosseinian và cộng sự (2008). Hàm lượng anthocyanin tổng được tính bằng số mg malvidin-3-O- glucoside/g cao chiết khô [[3]]. 2.6 Phƣơng pháp ức chế enzyme α-amylase Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase được thực hiện theo phương pháp của Kazeem và cộng sự (2013) [[5]]. Các dịch chiết gạo (250µl) được ủ với enzyme α-amylase (từ malt) trong đệm phosphat pH 6,9 (0,5 mg/ml) được ủ ở 37oC trong 10 phút sau đó thêm 1% tinh bột (250µl) và ủ tiếp trong thời gian 5‟. Phản ứng tạo màu cho dung dịch bằng cách thêm dinitrosalicylic acid (500µl) để ở nước sôi trong 5 phút. Dung dịch được để nguội ở nhiệt độ phòng và thêm vào 5 ml nước cất sau đó đem đo quang phổ ở bước sóng 540nm. Mẫu trắng được chuẩn bị tương tự nhưng thay dịch chiết cám gạo bằng nước cất. Hoạt tính ức chế (%) = Atrắng - Amẫu Atrắng x 100% 1094 2.7 Xử lý số liệu Tất cả các số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft® Excel® 2013 và phần mềm SAS (r) 9.4 TS Level 1M1 với trắc nghiệm Tukey. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Hàm lƣợng cao chiết của các dịch chiết cám gạo Hàm lượng cao chiết của ba loại dịch chiết cám gạo đỏ, cám gạo nếp than và cám gạo tím trong dung môi cồn 70% được trình bày trong bảng 1 cho thấy dịch chiết ethanol từ cám gạo đỏ có hàm lượng thấp nhất (9,93%) trong khi gạo tím có hàm lượng là 13,83 % và hàm lượng cao chiết khô từ cám gạo nếp than thu được nhiều nhất so với cao khô từ hai loại cám còn lại. Có thể thành phần chất màu tím đen trong cám gạo nếp than nhiều nên hàm lượng cao chiết từ cám loại gạo này là cao nhất. Bảng 1: Hàm lượng cao chiết của cám ba loại gạo màu Dịch chiết ethanol từ cám Hàm lƣợng cao chiết ( ) Gạo tím 13,83 ± 0,30 b Gạo đỏ 9,93± 0,25 c Gạo nếp than 16,82 ± 0,20 a Kết quả thể hiện trên bảng là trung bình ± SD (n=3). Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có giá trị thống kê (p <0.01) 3.2 Hàm lƣợng flavonoid tổng, polyphenol tổng và anthocyanin của các dịch chiết ethanol từ cám các loại gạo Hàm lượng flavonoid tổng, anthocyanin và polyphenol tổng của dịch chiết các loại cám gạo được trình bày trong bảng 2. Trong ba loại dịch chiết cám gạo thì cám gạo đỏ có hàm lượng flavonoid tổng cao hơn hai loại cao chiết còn lại, gấp 2,28 lần so với dịch chiết cám gạo nếp than. Tuy nhiên, lượng anthocyanin của dịch chiết cám gạo nếp than (7,37 ± 0,12 mg malvidin/g cao chiết khô) lại cao hơn 8,47 lần so với gạo đỏ (0,87 ± 1,61 mg malvidin/g cao chiết khô). Hàm lượng polyphenol của dịch chiết cám gạo tím và nếp than đều cao hơn cám gạo đỏ với giá trị lần lượt là 9,28 ± 0,15 và 9,68 ± 0,15 mg malvidin/g cao chiết khô. Cám gạo thường được loại bỏ khi xát gạo và được dùng cho heo, gia cầm sử dụng. Cám từ gạo màu có các thành phần hoạt chất kém phân cực giống như cám gạo thông thường (khi xát kỹ tạo gạo trắng) nhưng có thêm hợp chất phenolic mà thường chỉ xuất hiện trong trái cây và một số loại rau. Như vậy, trong nghiên cứu này cho thấy dịch chiết cám gạo tím, gạo đỏ và nếp than đều chứa một lượng lớn các hợp chất polyphenol, đặc biệt dịch chiết cám gạo nếp than chứa một lượng lớn sắc tố anthocyanin cao hơn hai loại còn lại. 1095 Bảng 2: Hàm lượng flavonoid, polyphenol và anthocyanin tổng của các dịch chiết ethanol các loại gạo Dịch chiết cám Flavonoid tổng (mg RE/g cao chiết khô) Polyphenol tổng (mg GAE/g cao chiết khô Anthocyanin (mg malvidin/g cao chiết khô Gạo tím 4,46 ± 0,25 b 9,28 ± 0,15 b 4,29 ± 0,15 b Gạo đỏ 4,83± 0,07 a 6,13 ± 0,51 c 0,87 ± 1,61 c Gạo nếp than 2,12 ± 0,22 c 9,68 ± 0,15 a 7,37 ± 0,12 a Kết quả thể hiện trên bảng là trung bình ± SD (n=3). Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có giá trị thống kê (p <0.05) Hình 1. Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase của của dịch chiết cám gạo nếp than, gạo đỏ và gạo tím 3.3 Hoạt tính ức chế α-enzyme α-amylase Kết quả ức chế α-amylase của cám các dịch chiết ethanol từ các loại gạo cho kết quả được trình bày trong hình 1 cho thấy dịch chiết cám gạo tím và gạo nếp than ở nồng độ 1,5-3,75 mg/ml có hoạt tính ức chế α- amylase gần tương đương nhau. Dịch chiết cám gạo đỏ có sự ức chế enzyme α-amylase là 68,1% ở nồng độ 4.5 mg/ml trong khi ở cám gạo nếp than là 77,95%. Như vậy, thông qua nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme α-amylase thì dịch chiết cám gạo tím và gạo nếp than thể hiện hoạt tính cao hơn so với dịch chiết gạo đỏ. Hoạt tính ức chế α-amylase có thể là do sự quyết định của thành phần polyphenol tổng cao hơn đã được trình bày trong bảng 2. Một trong nhiều phương pháp để hạn chế chứng tăng đường huyết hoặc bệnh tiểu đường là cần ức chế enzyme α-amylase và/hoặc α-glucosidase thủy phân tinh bột thành đường. Enzyme α-amylase được tiết ra bởi tuyến tụy tiết vào ruột non giúp thủy phân carbohydrat thành oligosaccharide và cuối cùng thành glucose vào máu giúp tạo năng lượng cho tế bào. Sự ức chế α-amylase làm chậm quá trình tiêu hóa và hấp thu carbohydrat nên hạn chế được sự tăng đường huyết nên có thể hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường [[6]]. Như vậy, qua thử nghiệm hoạt tính sinh học ức chế enzyme α-amylase cho thấy dịch chiết cám gạo tím, gạo đỏ và nếp than đều có hoạt tính, đặc biệt dịch chiết ethanol từ gạo nếp than mạnh hơn so với hai dịch chiết còn lại. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng trong gạo đỏ, nếp than và tím có các hợp chất anthocyanin và các hợp chất phenol khác giúp thể hiện nhiều hoạt tính sinh học, đặc biệt là cám gạo tím và cám nếp than trong nghiên cứu này thể hiện giá trị hoạt tính cao thông qua hàm lượng polyphenol tổng và anthocyanin cao được trình bày trong bảng 1. Dịch chiết cám gạo đỏ, nếp than và gạo tím chứa hai hợp 1096 chất anthocyanin quan trọng là cyanidin 3-glucoside (C3G) and peonidin 3-glucoside (P3G) có vai trò trong việc ngăn ngừa các bệnh về đường tim mạch và ung thư do có tiềm năng quét các gốc tự do gây độc cho tế bào trong cơ thể [[1]]. Trong bảng 1 cho thấy dịch chiết cám gạo đỏ, nếp than và gạo tím đều có hàm lượng polyphenol khá cao. Có thể những thành phần anthocyanin, flavonoid, polyphenol góp phần quan trọng cho hoạt tính ức chế enzyme α-amylase nên có thể góp phần chống tăng đường huyết giúp ngăn ngừa bệnh đái tháo đường. Như vậy, có thể các hợp chất phenol hiện diện trong cám gạo có màu (đỏ, tím hoặc đen) có hiệu quả ức chế enzyme thủy phân đường góp phần chống tăng đường huyết sau bữa ăn nên có thể hỗ trợ ngăn ngừa đái tháo đường trên động vật nuôi. Từ những nghiên cứu ở đây đề xuất hướng trích ly dịch chất màu hoặc trực tiếp bổ sung cám gạo màu vào thức ăn cho thú cưng như chó và mèo giúp hỗ trợ ngăn ngừa bệnh tiểu đường trên vật nuôi. 4. KẾT LUẬN Từ những kết quả nghiên cứu ở trên có thể thấy là dịch chiết ethanol từ cám gạo tím, gạo đỏ và nếp than có hoạt tính ức chế enzyme α-amylase có thể là các thành phần hợp chất phenol trong gạo màu đóng vai trò quyết định. Những kết quả thu được trong nghiên cứu chứng minh cám gạo màu thu từ gạo màu được trồng ở Việt Nam có tiềm năng chống tăng đường huyết nên có thể bổ sung vào thức ăn của vật nuôi, đặc biệt là thú cưng giúp ngăn ngừa chứng tăng đường huyết sau bữa ăn nên có thể phòng ngừa và hỗ trợ điều trị tiểu đường tuýp 2. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Charlotte Bjørnvad (2015), Lifestyle and diabetes mellitus in cats and dogs, Acta Vet Scand. 2015; 57(Suppl 1): K4 [2] Guo, H.; Ling, W.; Wang, Q.; Hu, Y.; Xia, M.; Feng, X.; Xia, X. (2007): Effect of anthocyanin- rich extract from black rice (Oryza sativa L. indica) on hyperlipidemia and insulin resistance in fructose-fed rats. Plant Foods for Human Nutr. 63, 1-6. [3] Hosseinian FS., Li W., Beta T. (2008): Measurement of anthocyanins and other phytochemicals in purple wheat, Food Chem. 109, 916-24 [4] Hudson, E.A., Dinh, P. A. Kokubun, T., Simmonds, M. S. Gescher, A. (2000): Characterization of potentially chemopreventive phenols in extracts of brown rice that inhibit the growth of human breast and colon cancer cells, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev . [5] Kazeem M I, Adamson J O and Oqunwande I A (2013): Modes of Inhibition of -Amylase and - Glucosidase by Aqueous Extract of Morindalucida Benth Leaf, Bio. Med. Res. Int., doi, 1-6. [6] Prashant Agarwal, Ritika Gupta (2016): Alpha-amylase inhibition can treat diabetes mellitus, Research and Reviews Journal of Medical and Health Sciences 5(4), 1-8. [7] Purushothama, P. L. Raina, K. Hariharan, (1995): Effect of long term feeding of rice bran oil upon lipids and lipoproteins in rats, Mol Cell Biochem, 146, 63–92 [8] Reusch C. Feline diabetes mellitus. In: Ettinger SJ, Feldman EC, eds. Textbook of Veterinary Internal Medicine. 7th ed. St. Louis, MO: Saunders; 2010:1796–1816. [9] Singleton V.L., Rossi J.A. (1965). Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdice phosphotungstic acid reagents”, Am. J. Enol. Vitic 16, pp.144-158. 1097 [10] Woisky R, Salatino A. (1998): Analysis of propolis: some parameters and procedures for chemical quality control. J. Apic. Res. 37, pp. 99-105. [11] Yao, Y.; Sang, W.; Zhou, M.; Ren, G. (2010): Antioxidant and α-glucosidase inhibitory activity of colored grains in China. J. Agric. Food Chem. 58, 770-774.