Nghiên cứu quy trình lưu trữ Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas Lour.) in vitro bằng phương pháp hạt nhân tạo

674 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH LƢU TRỮ HÀ THỦ Ô TRẮNG (Streptocaulon juventas Lour.) IN VITRO BẰNG PHƢƠNG PHÁP HẠT NHÂN TẠO Lê Phan Đình Quí, Nguyễn Phạm Tuấn, Nguyễn Công Kha, Nguyễn Hoài Vững, Nguyễn Ngọc Giàu, Lâm Bảo Nhƣ Phƣơng, Nguyễn Thị Thu Trang Trung tâm Công nghệ Sinh học Tỉnh An Giang TÓM TẮT Nghiên cứu ―Nghiên cứu quy trình lƣu trữ Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas lour.) in vitro bằng phƣơng pháp hạt nhân tạo‖ được tiến hành nhằm mục tiêu bảo tồn cây dược liệu quý hiếm bằng phương pháp tạo hạt nhân tạo góp phần lưu giữ được các giống dược liệu tiềm năng. Kết quả thực hiện đạt được như sau: môi trường tạo hạt nhân tạo thích hợp với Hà thủ ô trắng là Na-Algiante; giá thể thích hợp cho sự nảy mầm của hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng là môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L BA. Hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng có khả năng nảy mầm và phát triển sau 2, 3 và 4 tháng lưu trữ. Kết quả nghiên cứu cho thấy, hạt nhân tạo cũng là một công cụ thích hợp cho mở rộng sản xuất quy mô lớn phục vụ thương mại, do tiết kiệm chi phí, không gian, môi trường và thời gian, dễ dàng xử lý, gieo trồng và vận chuyển so với phương pháp truyền thống. Từ khóa: Hà thủ ô trắng, hạt nhân tạo, lưu trữ, MS, nẩy mầm. 1. GIỚI THIỆU Hiện nay, với sự tiến bộ của công nghệ nuôi cấy in vitro, tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ phôi vô tính đã mở rộng phạm vi ứng dụng mới cho việc tạo hạt nhân tạo (Gray et al., 1991) [1]. Hạt nhân tạo được xem là phương pháp hiệu quả rút ngắn thời gian trong một số cây trồng quan trọng về mặt thương mại, nhiều tiềm năng cho sản xuất quy mô lớn với chi phí thấp để thay thế cho hạt thật. Một hạt nhân tạo được tạo thành tương tự như hạt giống thật bao gồm một phôi soma (giai đoạn hình tim hoặc hình thuỷ lôi) được bao quanh bởi một lớp phôi nhũ nhân tạo. Thuận lợi của hạt nhân tạo đó là tạo dòng vô tính tạo ra các hạt giống tương tự nhau có đặc tính như cây mẹ; góp phần bảo tồn được những loài thực vật quý hiếm đảm bảo duy trì sự đa dạng sinh học và tạo sự đồng bộ hơn trong thu hoạch các loại cây nông nghiệp quan trọng. Ngoài ra, dễ dàng xử lý, có tiềm năng lưu trữ lâu dài và giảm chi phí sản xuất nhân giống (Rihan et al., 2011) [2]. Ngày nay, hạt nhân tạo hình viên nang với lớp vỏ gel không chỉ chứa phôi soma mà có thể là chồi nách, chồi ngọn hoặc thân và rễ. Các lớp bảo vệ mẫu cấy tránh bị tổn thương trong quá trình xử lý và cho phép nảy mầm, chuyển đổi mà không gây sự biến đổi (Pennycooke et al., 2001) [3]. Chúng giống như hạt thật và nảy mầm thành cây con dưới điều kiện thích hợp. Công nghệ nuôi cấy in vitro đã ứng dụng thành công hạt nhân tạo trên nhiều loại thực vật như cây Ngũ trảo, nho, cỏ mực, gừng, cam,Từ lâu, cây dược liệu có khả năng hỗ trợ điều trị bệnh trên nưới, tuy nhiên cây dược liệu ngày càng khai thác quá mức các giống quý hiếm. Vì thế dẫn đến sự cạn kiệt nguồn tài nguyên, một số giống dược liệu bản địa đứng trước tình trạng báo động, một số loài đã được đưa vào sách đỏ Việt Nam. Trước tình hình báo động khẩn cấp, cần một hướng giải quyết mang tính bền vững, lâu dài bảo tồn các giống dược liệu của địa phương. Xuất phát từ thực tế đó, nghiên cứu ―Nghiên cứu quy trình lƣu trữ Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas Lour.) in vitro bằng phƣơng pháp hạt nhân tạo‖ được thực hiện. 675 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas (Lour.) được lưu giữ tại Trung tâm Công nghệ Sinh học An Giang. Hóa chất: Sodium alginate, ethanol 70%, BA, NAA ,. Dụng cụ và thiết bị: Nồi hấp khử trùng, cân phân tích, micropippet, tủ cấy, dụng cụ và thiết bị cần thiết khác. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường hạt nhân tạo * Mục tiêu: Xác định môi trường thích hợp tạo vỏ hạt nhân tạo. * Tiến hành: Cắt đoạn mẫu thành từng đốt riêng lẻ, cho tất cả các mẫu vừa cắt xong vào dung dịch Na- Alginate (đối chứng, bổ sung MS, ½ MS và ¼ MS), sau đó khuấy nhẹ đều. Dùng pipette nhựa hút từng giọt dung dịch trên, mỗi giọt chứa duy nhất 1 mẫu cây. Sau đó nhỏ vào dung dịch 100 mM CaCl2.2H2O, chuyển qua máy lắc lắc đều trong vòng 30 phút. Khi hạt nhân tạo đã hình thành gạn bỏ nước và rửa sạch hạt bằng nước cất vô trùng 2 – 3 lần để loại bỏ dung dịch CaCl2.2H2O còn bám trên bề mặt. Nghiệm thức lặp lại: 3 lần/giống. Số bình mỗi nghiệm thức: 3 bình/giống Số hạt trong mỗi bình: 4 hạt; Tổng số bình: 12/giống; Tổng số hạt: 48/giống Trữ lạnh 4oC, trong bóng tối. * Chỉ tiêu khảo sát: Tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo trên môi trường MS. * Thời gian thí nghiệm: Sau 2 tuần, 4 tuần lưu trữ cấy chuyển vào môi trường MS xem tỉ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo. 2.2.2. Khảo sát sự nảy mầm của hạt nhân tạo trên các giá thể khác nhau * Mục tiêu: Xác định giá thể cho hạt nhân tạo nảy mầm tốt. * Tiến hành: Cắt đoạn mẫu thành từng đốt riêng lẻ, cho tất cả các mẫu vừa cắt xong vào dung dịch Na- Alginate + môi trường tối ưu từ nội dung 2.2.1 và khuấy nhẹ đều. Dùng pipette nhựa hút từng giọt dung dịch trên, mỗi giọt chứa duy nhất 1 mẫu cây. Sau đó nhỏ vào dung dịch 100 mM CaCl2.2H2O, chuyển qua máy lắc lắc đều trong vòng 30 phút. Khi hạt nhân tạo đã hình thành gạn bỏ nước và rửa sạch hạt bằng nước cất vô trùng 2 - 3 lần để loại bỏ dung dịch CaCl2.2H2O còn bám trên bề mặt. Nghiệm thức lặp lại: 3 lần/giống; Số bình mỗi nghiệm thức: 3 bình/giống Số hạt trong mỗi bình: 4 hạt; Tổng số bình: 12/giống; Tổng số hạt: 48/giống; Trữ lạnh 4oC, trong bóng tối * Chỉ tiêu khảo sát: Tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo trên các giá thể khác nhau. * Thời gian thí nghiệm: Sau 2 tuần, 4 tuần lưu trữ cấy chuyển lên các giá thể khác nhau xem tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo. 2.2.3. Khảo sát thời gian thích hợp cho lưu trữ hạt nhân tạo * Mục tiêu: Xác định thời gian tối ưu để lưu trữ hạt nhân tạo. * Tiến hành: Môi trường tạo hạt nhân bằng Na-Alginate, sau đó hạt được trữ lạnh ở 4oC trong bóng tối. Sau thời gian lưu trữ, hạt nhân tạo được cấy lên giá thể để khảo sát sự nảy mầm sau thời gian lưu trữ. 676 Thực hiện và lưu trữ 9 bình, mỗi bình 10 hạt. Sau thời gian lưu trữ lấy ra 3 bình để cấy chuyển sang môi trường thạch MS + 0,5 mg/L BA để khảo sát tỉ lệ nảy mầm của hạt. Nghiệm thức lặp lại: 3 lần/giống; Số hạt trong mỗi bình: 10 hạt Tổng số bình: 3 bình; Tổng số hạt: 30 hạt; Trữ lạnh 4oC, trong bóng tối * Chỉ tiêu khảo sát: Tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo sau thời gian lưu trữ. * Thời gian thí nghiệm: Làm theo định kỳ sau mỗi 2, 3, 4 tháng tồn trữ cấy chuyền lên giá thể thích hợp xem tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo. 2.3. Phƣơng pháp thống kê Các số liệu thí nghiệm được xử lý và thống kê bằng phần mềm Ecxel và Statgraphics plus 16.0. Kiểm tra sự khác biệt giữa trung bình các nghiệm thức theo phép thử LSD và Duncan. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng hạt nhân tạo Mục tiêu chính của nghiên cứu hạt nhân tạo là tạo ra cấu trúc hạt giống hạt truyền thống và có các đặc điểm dễ xử lý, lưu trữ, tăng khả năng sống sót và mức độ nảy mầm (Ara et al., 2000) [4]. Sau 2 tuần lưu trữ hầu hết các hạt đều nảy mầm, các chồi hình thành phát triển khá tốt, tỷ lệ nảy mầm của hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng đạt tỷ lệ khá cao trên 90% và không khác biệt giữa các nghiệm thức. Nghiệm thức 1 chỉ có Na- Alginate các hạt sau khi nảy mầm có số chồi cao đạt trung bình 7,33 và khác biệt không ý nghĩa đối với nghiệm thức 4 có Na-Alginate bổ sung ¼ MS đạt trung bình 7,0 chồi. Nghiệm thức 2 có Na-Alginate bổ sung MS và nghiệm thức 3 có Na-Alginate bổ sung ½ MS có số chồi trung bình lần lượt là 5,67 và 6,33 thấp hơn so với nghiệm thức 1 và 2 (Bảng 3). Bảng 3. Ảnh hưởng môi trường tạo hạt nhân tạo đối với Hà thủ ô trắng Nghiệm thức Môi trƣờng Sau 2 tuần lƣu trữ Sau 4 tuần lƣu trữ Tỷ lệ nảy mầm (%) Số chồi Tỷ lệ nảy mầm (%) Số chồi 1 Na-Alginate 100 a 7,33 a 100 a 7,33 a 2 Na-Alginate + MS 91,67 a 5,67 b 91,67 a 5,00 b 3 Na-Alginate + ½ MS 100 a 6,33 ab 50,00 b 3,33 c 4 Na-Alginate + ¼ MS 100 a 7,0 a 41,67 b 2,33 c Các giá trị có mũ có cùng mẫu tự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%. Hình 1. Sự nảy mầm của hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng đối với các môi trường tạo hạt khác nhau sau 2 tuần lưu trữ: (a) Alginate; (b) Alginate + MS; (c) Alginate + ½ MS; (d) Alginate + ¼ MS 677 Hình 2. Sự nảy mầm của hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng đối với các môi trường tạo hạt khác nhau sau 4 tuần lưu trữ: (a) Alginate; (b) Alginate+MS; (c) Alginate+½ MS; (d) Alginate+¼ MS. Sau 4 tuần lưu trữ, kết quả cho thấy môi trường tạo hạt ảnh hưởng đến khả năng nảy mầm của hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng sau lưu trữ, tốc độ nảy mầm của các hạt chậm hơn so với sau 2 tuần lưu trữ, tỷ lệ chết tăng. Nghiệm thức 1 có Na-Alginate có tỷ lệ nảy mầm đạt 100%, khác biệt không ý nghĩa so với nghiệm thức 2 có Na-Algiante bổ sung MS tỷ lệ nảy mầm đạt 91,67%. Nghiệm thức 3 và 4 cho thấy khả năng nảy mầm của hạt bị giảm sau thời gian lưu trữ lần lượt đạt tỷ lệ là 50,0% và 41,67% khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức 1 và 2. Đối với số chồi hình thành sau khi nảy mầm của hạt nhân tạo, nghiệm thức 1 có số chồi trung bình đạt 7,33 và khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại. Số chồi ở các nghiệm thức giảm dần từ nghiệm thức 2 trung bình là 5,00 chồi, nghiệm thức 3 đạt trung bình 3,33 chồi và nghiệm thức 4 đạt trung bình 2,33 chồi (Hình 1 và 2). Nhiều nghiên cứu cho thấy môi trường Na-Alginate phù hợp cho sự tạo hạt nhân tạo đối với nhiều loại cây như Ba gạc bốn lá (Rauvolfia tetraphylla L.) (Faisal et al., 2006) [5], lựu (Punica granatum L.) (Naik and Chand, 2006) [6], ngải cứu (Artemisia vulgaris) (Sujatha and Kumari, 2008) [7]. Như vậy, môi trường Na-Alginate thích hợp cho sự tạo hạt nhân tạo của Hà thủ ô trắng. 3.2. Khảo sát sự nảy mầm của hạt nhân tạo trên các giá thể khác nhau Việc bổ sung chất điều hòa sinh trưởng và chất dinh dưỡng cho hạt là một yếu tố cần thiết cho sự thành công của kỹ thuật tạo hạt nhân tạo, tăng khả năng nảy mầm và sống sót cho hạt (Rihan et al., 2017) [8]. Các hormone kích thích tăng có tác dụng đến sự nảy mầm hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng. Sau 2 tuần lưu trữ tỷ lệ nảy mầm của các hạt khá cao trên 90% và không khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê. Tuy nhiên, sự khác biệt ở số chồi tạo ra của các hạt sau khi nảy mầm, nghiệm thức 2 có giá thể là môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L BA giúp cho hạt nảy mầm tốt, tạo nhiều chồi cao, to khỏe hơn với trung bình là 6,0 chồi và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Kế đến là nghiệm thức 1 có giá thể chỉ là môi trường MS tạo số chồi trung bình 4,67 chồi, khác biệt có ý nghĩa so với nghiệm thức 3 và 4 (Bảng 4). Đối với nghiệm thức 3 có giá thể là môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L NAA và nghiệm thức 4 có giá thể là môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L BA và 0,5 mg/L NAA tác dụng kích thích chồi nhiều bằng nghiệm thức 2, các hạt khi nảy mầm trên các giá thể này vẫn xanh tươi, phát triển tuy nhiên có hiện tượng phát triển thành các cụm mô sẹo (callus), chỉ một số ít hạt tạo chồi do đó số chồi trung bình tạo ra ở nghiệm thức 3 và 4 thấp hơn so với nghiệm thức 1 và 2 và khác biệt có ý nghĩa thống kê. Tương tự, sau 4 tuần lưu trữ các hạt nhân tạo vẫn có khả năng phát triển tốt ở nghiệm thức 2 có giá thể là môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L BA đạt số chồi trung bình 6,33 chồi và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Như vậy, nghiệm thức 2 là giá thể có môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L BA thích hợp cho sự nảy mầm và phát triển của hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng. 678 Bảng 4. Ảnh hưởng các giá thể khác nhau lên sự nảy mầm hạt Hà thủ ô trắng. Nghiệm thức Môi trƣờng Sau 2 tuần lƣu trữ Sau 4 tuần lƣu trữ Tỷ lệ nảy mầm (%) Số chồi Tỷ lệ nảy mầm (%) Số chồi 1 MS 91,67 a 4,67 b 75,00 a 3,67 b 2 MS + 0,5mg/L BA 100 a 6,0 a 91,67 a 6,33 a 3 MS + 0,5 mg/L NAA 100 a 1,33 d 66,67 a 1,33 c 4 MS + 0,5 mg/L BA + 0,5 mg/L NAA 100 a 2,67 c 91,67 a 2,67 bc Các giá trị có mũ có cùng mẫu tự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%. Hình 3. Sự nảy mầm của hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng trên các loại giá thể khác nhau sau 2 tuần lưu trữ: (a) MS; (b) MS + 0,5 mg/L BA; (c) MS + 0,5 mg/L NAA; (d) MS + 0,5 mg/L BA + 0,5 mg/L NAA. Hình 4. Sự nảy mầm của hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng trên các loại giá thể khác nhau sau 4 tuần lưu trữ: a(a) MS; (b) MS + 0,5 mg/L BA; (c) MS + 0,5 mg/L NAA; (d) MS + 0,5 mg/L BA + 0,5 mg/L NAA. 3.3. Khảo sát thời gian thích hợp cho lƣu trữ hạt nhân tạo Thời gian lưu trữ hạt là yếu quan trọng ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt sau thời gian lưu trữ. Các hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng cho thấy vẫn có khả năng nảy mầm tối đa sau 4 tháng lưu trữ ở nhiệt độ 4oC trong bóng tối (Bảng 5 và Hình 5). Sau 2 tháng lưu trữ khả năng nảy mầm của hạt đã giảm hơn so với các nội dung thực hiện sau 4 tuần lưu trữ, tỷ lệ nảy mầm của hạt đạt 73,33%, số chồi trung bình tạo thành đạt 13,67 chồi và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với sau 3 và 4 tháng lưu trữ. Sau 3 tháng lưu trữ khả năng nảy mầm của hạt giảm đáng kể xuống còn 40% và số chồi trung bình đạt 6,67 chồi. Cuối cùng, sau 4 tháng lưu trữ khả năng nảy mầm của hạt Hà thủ ô trắng giảm chỉ còn 13,33% và số chồi tạo thành rất ít chỉ có 1,33 chồi, thấp nhất so với sau 2 tháng và 3 tháng lưu trữ và khác biệt có ý nghĩa thống kê. Theo nghiên cứu đối với hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng cho thấy thời gian lưu trữ lâu hơn so với nghiên cứu của Ray và Bhattacharya (2008) [9] thực hiện trên cây Ba gạc (Rauvolvia serpentine) chỉ hơn 3 tháng lưu trữ ở 4oC. Ngày nay có rất ít nghiên cứu về bảo quản hạt nhân tạo và kỹ thuật cần phải có nhiều nghiên cứu hơn nữa vì tiềm năng to lớn của hạt nhân tạo như dễ dàng lưu trữ nguồn gen và tiết kiệm được chi phí (Rihan et al., 2017) [8]. 679 Bảng 5. Ảnh hưởng thời gian lưu trữ lên sự nảy mầm hạt Hà thủ ô trắng Nghiệm thức Thời gian lƣu trữ Tỷ lệ nảy mầm Số chồi 1 2 tháng 73,33 a 13,67 a 2 3 tháng 40,00 b 6,67 b 3 4 tháng 13,33 c 1,33 c Các giá trị có mũ có cùng mẫu tự khác biệt không có ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95%. Hình 5. Sự nảy mầm hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng sau thời gian lưu trữ: (a) 2 tháng; (b) 3 tháng; (c) 4 tháng 4. KẾT LUẬN – Môi trường tạo hạt nhân tạo thích hợp với Hà thủ ô trắng là Na-Algiante sau 2 và 4 tuần lưu trữ tỷ lệ hạt nảy mầm là 100% và số chồi trung bình tạo thành là 7,33. – Giá thể thích hợp cho sự nảy mầm của hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng là môi trường MS bổ sung 0,5 mg/L BA sau 2 và 4 tuần lưu trữ tỷ lệ hạt nảy mầm là 100% và 91,67%; số chồi trung bình tạo thành là 6,0 và 6,33. – Hạt nhân tạo các loại dược liệu có khả năng nảy mầm và phát triển sau thời gian lưu trữ. Hạt nhân tạo Hà thủ ô trắng sau 2, 3 và 4 tháng lưu trữ với tỷ lệ hạt nảy mầm tương ứng là 73,33; 40,0 và 13,33%; số chồi trung bình tạo thành tương ứng là 13,67; 6,67 và 1,33. 5. LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn các thành viên của Trung tâm Công nghệ sinh học tỉnh An Giang và Sở Khoa học và Công nghệ An Giang đã tạo điều kiện và hỗ trợ để thực hiện nghiên cứu này. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Gray, D.J.; Purohit, A.; Triglano, R.N. (1991) Somatic embryogenesis and development of synthetic seed technology. Crit. Rev. Plant Sci. 10, 33–61. [2] Rihan, H.Z.; Al-Issawi, M.; Burchett, S.; Fuller, M.P. (2011) Encapsulation of cauliflower (Brassica oleracea var botrytis) microshoots as artificial seeds and their conversion and growth in commercial substrates. Plant Cell Tissue Organ Cult., 107, 243–250. [3] Pennycooke, J.C.; Towill, L.E. (2001) Medium alterations improve regrowth of sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) shoot tips cryopreserved by vitrification and encapsulation- dehydration. Cryoletters, 22, 381–389. [4] Ara, H.; Jaiswal, U.; Jaiswal, V (2000) Synthetic seed: Prospects and limitation. Curr. Sci, 78: 1438–1444. 680 [5] Faisal, M.; Ahmad, N.; Anis, M (2006) In vitro plant regeneration from alginateencapsulated microcuttings of Rauvolfia tetraphylla L. Am. Eurasian J.1: 1–6. [6] Naik, S.K.; Chand, P.K (2006) Nutrient-alginate encapsulation of in vitro nodal segments of pomegranate (Punica granatum L.) for germplasm distribution and exchange. Sci. Hortic, 108, 247–252. [7] Sujatha, G.; Kumari, B.D.R (2008) Micropropagation, encapsulation and growth of Artemisia vulgaris node explants for germplasm preservation. S.Afr.J.Bot, 74, 93–100. [8] Hail Z. Rihan, Fakhriya Kareem, Mohammed E. El-Mahrouk and Michael P. Fuller (2017) Artificial seeds (principle, aspects and applications). Agronomy, 15, 71-86. [9] Ray, A. and Bhattacharya, S (2008) Storage and plant regeneration from encapsulated shoot tips of Rauvolfia serpentine—An effective way of conservation and mass propagation. S. Afr. J. Bot. 74: 776–779.