Nghiên cứu tạo Interleukin-2 tái tổ hợp dùng cho điều trị bệnh ung thư

viÖn khoa häc vµ c«ng nghÖ viÖt nam viÖn c«ng nghÖ sinh häc B¸o c¸o tæng kÕt ®Ò tµi khoa häc cÊp nhµ n−íc Nghiªn cøu t¹o interleukin-2 t¸i tæ hîp dïng cho ®iÒu trÞ bÖnh ung th− M∙ sè KC 04.33 Chñ nhiÖm ®Ò tµi: PGs, ts. tr−¬ng nam h¶i 6702 24/12/2007 hµ néi - 2007 B¸o c¸o tæng kÕt §Ò tµi ®éc lËp cÊp Nhµ n−íc M∙ sè: KC. 04. 33 Nghiªn cøu t¹o interleukin-2 t¸i tæ hîp dïng cho ®iÒu trÞ bÖnh ung th− Chñ nhiÖm §Ò tµi: PGS. TS. Tr−¬ng nam h¶i 01 / 2005 – 06 / 2007 Bé Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖn Khoa häc vµ C«ng nghÖ ViÖt Nam ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc BỘ KHOA HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC --------ÂÂÂ-------- Báo cáo tổng kết Khoa học và Kỹ thuật Đề tài  NGHIÊN CỨU TẠO INTERLEUKIN-2 TÁI TỔ HỢP DÙNG CHO ĐIỀU TRỊ UNG THƯ Mã số:   KC. 04. 33  Chủ nhiệm đề tài:   PGS. TS. TRƯƠNG NAM HẢI  Cơ quan chủ trì:   Viện Công nghệ sinh học  Cơ quan chủ quản:    Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam  Thời gian thực hiện:     01/2005 ‐ 06/2007  Hà Nội - 2007 Bản báo cáo viết xong ngày 15 / 12/ 2007. Tài liệu này được chuẩn bị trên cơ sở kết quả thực hiện Đề tài cấp Nhà nước, mã số KC. 04. 33. Mọi sao chép phải được sự đồng ý của Viện Công nghệ sinh học. BK H C N V .C N SH B K H C N V .C N SH VKHCNVN V.CNSH Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33 Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 2 Lêi c¶m ¬n Chủ nhiệm đề tài KC. 04.33 xin chân thành cảm ơn các cán bộ nghiên cứu thuộc 3 cơ quan nghiên cứu khoa học là (i) Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (ii) Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQGHN, Bộ Giáo dục và Đào tạo và (iii) Viện Kiểm định Quốc gia Vacxin và Sinh phẩm y tế, Bộ Y tế đã tham gia thực hiện đề tài. Chủ nhiệm đề tài KC. 04.33 xin chân thành cám ơn Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Trường Đại học khoa học tự nhiên và Viện Kiểm định Quốc gia Vacxin và Sinh phẩm y tế đã ủng hộ và tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị và kinh phí cho các tập thể cán bộ chủ trì và tham gia thực hiện đề tài này. Chủ nhiệm và tập thể cán bộ nghiên cứu thực hiện đề tài xin chân thành cảm ơn Vụ Quản lý Khoa học và Công nghệ các ngành KT-KT của Bộ Khoa học và Công nghệ và Ban chủ nhiệm chương trình KC. 04 đã tạo điều kiện thuận lợi về kinh phí và quản lý trong suốt thời gian thực hiện đề tài. CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI PGS. TS. TRƯƠNG NAM HẢI Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33 Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 3 MỤC LỤC DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI CHỦ TRÌ THỰC HIỆN ..................................................8 DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA THỰC HIỆN VÀ CƠ QUAN PHỐI HỢP......9 BÀI TÓM TẮT ......................................................................................................................11 LỜI MỞ ĐẦU ........................................................................................................................15 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC ... 17 1.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở NƯỚC NGOÀI .........................................................17 1.1.1. Ung thư và các liệu pháp chữa trị ung thư.............................................................17 1.1.2 Ung thư thận và u hắc tố.........................................................................................18 1.1.3 Các liệu pháp chữa trị ung thư................................................................................19 1.1.4. Interleukin-2 và ứng dụng trong điều trị ung thư ..................................................19 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC ............................................................23 CHƯƠNG 2. LỰA CHỌN ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........26 2.1. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI ...........................................................................................26 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CẦN THỰC HIỆN ........................................................26 2.2.1 Tạo dòng gen IL-2 ..................................................................................................26 2.2.2 Tạo đột biến điểm của gen IL-2 .............................................................................26 2.2.3. Biểu hiện gen IL-2 trong các hệ biểu hiện khác nhau ...........................................27 2.2.4. Nghiên cứu và tối ưu điều kiện lên men cho các chủng vi sinh vật tái tổ hợp mang gen IL-2 .................................................................................................................27 2.2.5. Tách chiết, tinh chế IL-2 từ dịch lên men và nghiên cứu tính chất của IL-2. .......27 2.2.6. Đánh giá chất lượng IL-2 ......................................................................................27 2.3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................29 2.3.1. Vật liệu ..................................................................................................................29 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................30 CHƯƠNG 3. NHỮNG NỘI DUNG VÀ KẾT QUẢ Đà THỰC HIỆN ............................47 3.1. KẾT QUẢ TẠO DÒNG GEN IL-2..............................................................................47 3.1.1. Tách chiết RNA tổng số từ người và tổng hợp cDNA mã hóa gen IL-2...............47 3.1.2. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pCR 2.1-TA ........................................48 3.1.3. Xác định trình tự nucleotide của gen IL-2.............................................................49 3.1.4. Kết luận .................................................................................................................50 3.2. KẾT QUẢ TẠO ĐỘT BIẾN GEN IL-2.......................................................................51 3.2.1. Tạo đột biến điểm làm mất điểm glycosyl hóa và thay thế Cys125 bằng Ser125....51 3.2.2. Gây hồi biến Ser25 thành Leu25..............................................................................54 3.2.3. Kết luận .................................................................................................................58 3.3. KẾT QUẢ BIỂU HIỆN IL-2 TRONG CÁC HỆ BIỂU HIỆN KHÁC NHAU............59 3.3.1. Biểu hiện gen lai Trx-rhIL2MN trong tế bào vi khuẩn E. coli ..............................59 3.3.2. Biểu hiện gen lai Trx-rhIL2MN trong nấm men P. pastoris.................................63 3.3.3. Biểu hiện gen rhIL2 ở dạng riêng lẻ trong nấm men P. pastoris ..........................65 3.3.4. Kết luận .................................................................................................................68 Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33 Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 4 3.4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN CÁC CHỦNG VI SINH VẬT TÁI TỔ HỢP MANG GEN IL-2 Ở BÌNH TAM GIÁC VÀ TRONG HỆ THỐNG LÊN MEN 5L, 14L...............................................................................................69 3.4.1. Kết quả lên men tổng hợp IL-2 tái tổ hợp trong bình tam giác .............................69 3.4.2. Kết quả lên men sản xuất IL-2 tái tổ hợp trong hệ thống Bioflo 110 dung tích 5, 14L. ...73 3.4.3. Kết luận .................................................................................................................74 3.5. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT, TINH CHẾ IL-2 TỪ DỊCH LÊN MEN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT ..............................................................................................................75 3.5.1. Tách chiết và tinh chế IL-2 bằng sắc ký ái lực......................................................75 3.5.2. Cắt protein lai bằng Enterokinase và lọc IL-2 qua cột sắc ký ái lực và kiểm tra khả năng bắt cặp đặc hiệu của IL-2 bằng Western blot..............................................76 3.5.3. Kết luận .................................................................................................................77 3.6. KẾT QUẢ BƯỚC ĐẦU VỀ BẢO QUẢN MẪU IL-2 ................................................78 3.7. THỬ NGHIỆM IL-2 TÁI TỔ HỢP TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO NUÔI CẤY CTLL-2 ....79 3.7.1. Điều kiện tối ưu để nhân và bảo quản dòng tế bào CTLL-2 .................................79 3.7.2. Xác định hoạt tính sinh học của các mẫu rhIL2MN biểu hiện trong E. coli BL21 .......80 3.7.3. Xác định hoạt tính sinh học của mẫu rhIL2 biểu hiện trong P. pastoris ...............82 3.7.4. Kết luận. ................................................................................................................83 3.8. THỬ NGHIỆM IL-2 TÁI TỔ HỢP TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO ĐỘNG VẬT...........84 3.8.1. Kết quả nghiên cứu................................................................................................84 3.8.2. Kết luận .................................................................................................................97 3.9. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG IL-2 ...............................................................98 3.9.1. Hiệu giá của sản phẩm IL-2 ..................................................................................98 3.9.2. Tính vô trùng của sản phẩm IL-2 ..........................................................................98 3.9.3. Tính an toàn của sản phẩm IL-2 ............................................................................98 3.9.4. Chất gây sốt của sản phẩm IL-2 ............................................................................98 3.9.5. Tính chất lý hóa của sản phẩm ..............................................................................99 3.9.6. Kết luận .................................................................................................................99 CHƯƠNG 4. TỔNG QUÁT HOÁ VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ THU ĐƯỢC................. 100 4.1. KẾT QUẢ VỀ KHOA HỌC ......................................................................................100 4.2. TỔNG HỢP CÁC SẢN PHẨM ĐẠT ĐƯỢC SO VỚI ĐĂNG KÝ..........................102 4.3. TRÌNH ĐỘ CÔNG NGHỆ.........................................................................................104 4.4. KHẢ NĂNG ÁP DỤNG ............................................................................................104 4.5. ĐÀO TẠO ..................................................................................................................105 4.6. HỢP TÁC QUỐC TẾ .................................................................................................105 4.7. TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KINH PHÍ ..........................................................................106 4.8. DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ .......................................................106 4.9. HẠN CHẾ CỦA ĐỀ TÀI ...........................................................................................107 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................110 5.1. KẾT LUẬN ................................................................................................................110 5.2. ĐỀ NGHỊ ....................................................................................................................111 TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................................112 Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33 Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 5 MỤC LỤC CÁC HÌNH Hình 1. Sự phát triển của tế bào ung thư ..................................................................................18 Hình 2. Cấu trúc không gian của Interleukin-2 ........................................................................20 Hình 3. Sự tác động của ProleukinRIL-2 lên tế bào ung thư.....................................................23 Hình 4. Tóm tắt các nội dung nghiên cứu theo sơ đồ ...............................................................28 Hình 5. Điện di các RNA tổng số tách từ mẫu mô lách người Việt Nam ................................47 Hình 6. Sản phẩm PCR nhân gen IL-2 .....................................................................................48 Hình 7. Kết quả cắt kiểm tra DNA các plasmid bằng enzyme EcoR I. ...................................48 Hình 8. Kết quả so sánh trình tự IL-2 nhận được với trình tự trên ngân hàng gen quốc tế NCBI......49 Hình 9. So sánh trình tự amino acid đã được dịch mã của gen IL-2 nhận được.......................50 Protein_IL-2) và trình tự amino acid đã đăng kí trên ngân hàng dữ liệu gen............................50 quốc tế với số đăng ký NP_000577...........................................................................................50 Hình 10. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% ...........................................................52 Hình 11. Kết quả cắt kiểm tra DNA plasmid các dòng biến nạp bằng Not I và Nco I .............53 Hình 12. Kết quả đọc trình tự nucleotide của dòng số 4 chứa gen rhIL2.................................54 Hình 13. Cấu trúc của hai plasmid pTZ600 và pTZ900 ...........................................................56 Hình 14. Sơ đồ mô tả quá trình tạo đột biến điểm định hướng tạo gen Trx-rhIL2-MN...........57 Hình 15. Kết quả đọc trình tự gen đã hồi biến (phải) so với gen chưa hồi biến (trái) ..............58 Hình 16. Điện di SDS-PAGE protein Trx-rhIL2MN trên gel polyacrylamide 12,5% .............60 Hình 17. Western blot với kháng thể kháng hIL-2 ...................................................................61 Hình 18. Điện di protein rhIL2 dạng tan và không tan trên gel polyacrylamide 12,5%...........61 Hình 19. Ảnh phổ MS/MS của mảnh peptide 634,4 dalton mang điện tích +2 của Trx được nhận dạng. A – phổ TOF MS, B – phổ MS/MS. .......................................................................62 Hình 20. Ảnh phổ TOF MS và MS/MS của mảnh peptide 874,6 dalton mang điện tích 2+ của IL-2 được nhận dạng. A – phổ TOF MS, B – phổ MS/MS. ..........................................63 Hình 21. Các peptide nhận dạng được qua khối phổ từ băng protein.......................................63 có kích thước 32 kDa.................................................................................................................63 Hình 22. Ảnh biểu hiện gen Trx-rhIL2MN. .............................................................................64 Hình 23. Ảnh Western Blot với kháng thể kháng IL-2.............................................................64 Hình 24. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% ...........................................................66 Hình 25. Điện di SDS-PAGE sản phẩm biểu hiện rhIL2 trong nấm men P. pastoris .............67 Hình 26. Ảnh Western Blot với kháng thể kháng IL-2.............................................................67 Hình 27. Ảnh hưởng của IPTG tới sự biểu hiện của protein rhIL2MN...................................70 Hình 28. Ảnh hưởng của nồng độ Amp tới sự biểu hiện của protein .......................................71 Hình 29. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy ................................................................71 Hình 30. Khảo sát thời gian thu mẫu biểu hiện .......................................................................72 Hình 31. Quá trình phát triển của chủng E. coli Bl21 và sinh tổng hợp Interleukin-2. ............73 Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33 Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 6 Hình 32. Điện di protein tái tổ hợp Trx-rhIL2-MN trên polyacryamide gel 12,5%...............73 Hình 33. Điện di protein tinh sạch lần 1 .................................................................................755 Hình 34. Điện di protein tinh sạch lần 2 .................................................................................755 Hình 35. Điện di sản phẩm protein cắt bằng enterokinase trên gel polyacrylamide 12,5% ...766 Hình 36. Mẫu Trx-rhIL2MN giữ ở dạng đông khô sau các khoảng thời gian..........................78 bảo quản khác nhau ...................................................................................................................78 Hình 37. Hình ảnh tế bào CTLL-2 nuôi cấy in vitro ................................................................79 Hình 38. Xác định và so sánh hoạt tính của các mẫu IL-2 thử nghiệm....................................81 Hình 39. Đồ thị minh hoạ sự phát triển của tế bào CTLL-2 dưới tác động..............................82 của các IL-2 khác nhau (rhIL2: VN, TQ1: Trung Quốc, US: Mỹ)............................................82 Hình 40. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bình thường (Chụp dưới kính lúp) .................85 Hình 41. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bị ung thư .......................................................86 Hình 42. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bình thường ....................................................86 Hình 43. Niêm mạc đại tràng chuột nhắt trắng bị ung thư .......................................................87 Hình 44. Tiêu bản hiển vi mô học lông nhung ruột chuột nhắt trắng bình thường: .................87 Hình 45. Tiêu bản hiển vi mô bệnh học lông nhung ruột chuột nhắt trắng bị ung thư dưới tác động của AOM: ...................................................................................................................88 Hình 46. Tế bào biểu mô niêm mạc bị giải biệt hóa, đang chuyển dạng..................................88 thành ung thư, có nhân lớn và tăng sắc do bắt màu kiềm đậm (PĐ: 100 x 10) .........................88 Hình 47. Tế bào mô liên kết ở lõi lông nhung bị giải biệt hóa, phân bố lộn xộn, đang chuyển dạng thành ung thư, có nhân lớn và tăng sắc (PĐ: 100 x 10) .......................................89 Hình 48. Chuột nhắt trắng Swiss khoẻ mạnh (a) và mang u báng Sarcoma 180......................90 sau 12 ngày cấy truyền (b).........................................................................................................90 Hình 49. Ảnh minh họa sinh khối tế bào ung thư Sarcoma 180:.............................................91 Hình 50. Sự giảm sinh khối u báng Sarcoma 180 dưới tác động của IL2 tái tổ hợp................92 Hình 51. Biểu đồ so sánh tỷ số phát triển u giữa các lô thí nghiệm .........................................92 Hình 52. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 ở lô đối chứng (x1000) ......................................93 Hình 53. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 ở lô tiêm chế phẩm IL2.VN ...............................93 Hình 54. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 dưới tác động của chế phẩm IL2.TQ .................94 Hình 55. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 bình thường dưới kính .......................................94 hiển vi điện tử truyền qua (x10.000). ........................................................................................94 Hình 56. Tế bào ung thư báng Sarcoma 180 dưới tác động của IL2 VN (x10.000).................95 Tế bào chết theo kiểu hoại thư...................................................................................................95 Hình 57. Tế bào u báng Sarcoma 180 dưới tác động của IL2 TQ (x10.000) ...........................95 Hình 58. Đồ thị biểu diễn thời gian sống thêm của các lô chuột thí nghiệm............................96 Báo cáo Tổng kết Khoa học và Kỹ thuật đề tài KC.04.33 Thời gian thực hiện: 01/2005 – 06/2007 7 MỤC LỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Danh sách những người chủ trì thực hiện......................................................................8 Bảng 2. Kết quả tinh chế IL-2 tái tổ hợp từ dịch thô ................................................................77 Bảng 3. Dữ liệu kiểm tra hoạt tính của các mẫu rhIL-2MN tái tổ hợp .....................................80 Bảng 4. Đơn vị hoạt tính