Nghiên cứu Tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người

- 27 - 2.1. THIẾT KẾ NGHIÊN CỨU Nghiên cứu này được thiết kế theo kiểu nghiên cứu thực nghiệm, mô tả, có đối chứng. Do hạn chế về kinh phí nên ở nội dung 3 của nghiên cứu cỡ mẫu được sử dụng là 3 con chuột cho mỗi lô thí nghiệm (tổng cộng có 4 lô thí nghiệm). 2.2. VẬT LIỆU 2.2.1. Mẫu vật 2.2.1.1. Tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người Nguồn tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Tế bào gốc. 2.2.1.2. Chuột Mus musculus var. Albino Chuột nhắt trắng Mus musculus var. Albino khỏe mạnh và sạch bệnh 2 tuần tuổi được mua tại viện Pasteur TP. HCM được dùng để thu dịch chiết tụy. 2.2.1.3. Chuột đái tháo đường được gây tạo bằng streptozotocin Chuột đái tháo đường được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Tế bào gốc. 2.2.2. Hóa chất 2.2.2.1. Dung dịch đệm rửa tế bào Dung dịch PBS (không có ion Ca2+, Mg2+) Bảng 2.1. Công thức pha dung dịch PBS Thành phần Hàm lượng (g) KCl 0,2 KH2PO4 0,2 Na2HPO4.12H2O 0,29384 NaCl 0,8 Nước cất 2 lần Bổ sung vừa đủ 1000 ml Chuẩn pH =7,4, hấp vô trùng 1210C, 1atm, 30 phút. Công thức pha dung dịch PBS/gentamycin: bổ sung 150 μl gentamycin vào 100 ml dung dịch PBS. Bảo quản trong tủ mát 40C. Phạm Lê Bửu Trúc - 28 - 2.2.2.2. Dung dịch tách tế bào - Trypsin/EDTA 0,25 % Trypsin được dùng với nồng độ 0,25%, EDTA được dùng với nồng độ 0,02%, nhưng để tiện bảo quản pha với nồng độ 1%. - Bột Trypsin 0,25 g - EDTA 0,093 g - PBS 100 ml - Khử trùng: lọc qua màng lọc vô trùng 0,2 µm - Bảo quản ở 40C, sử dụng tối đa trong 3 tuần 2.2.2.3. Môi trường nuôi tế bào gốc trung mô máu cuống rốn - IMDM (I7633, Sigma) - 10% FBS (10082-139, Gibco) - Bảo quản ở 40C, sử dụng trong 1 tháng 2.2.2.4. Môi trường biệt hóa tế bào gốc trung mô Môi trường L-DMEM - L-DMEM (D5523, Sigma) - 1 mM 2-mercaptoetanol (M7522, Sigma) - 10 mM nicotinamide (N0636, Sigma) - 10 % FBS (10082-139, Gibco) - Bảo quản ở 40C, sử dụng trong 1 tháng Môi trường H-DMEM - H-DMEM (D5648, Sigma) - 1 mM 2-mercaptoetanol (M7522, Sigma) - 10 mM nicotinamide (N0636, Sigma) - 10 % FBS (10082-139, Gibco) - Bảo quản ở 40C, sử dụng trong 1 tháng Môi trường L-DMEM bổ sung dịch chiết mô tụy - L-DMEM (D5523, Sigma) - 10 % FBS (10082-139, Gibco) - Dịch chiết mô tụy Phạm Lê Bửu Trúc - 29 - - Bảo quản ở 40C, sử dụng trong 1 tháng 2.2.2.5. Thuốc nhuộm Thuốc nhuộm DTZ Dung dịch stock DTZ - 10 mg DTZ (D5130, Sigma) - Hòa tan trong 10 ml DMSO (Merck) Dung dịch nhuộm (pH 7,8) - Hòa tan dung dịch stock tỉ lệ 1/10 trong PBS - Lọc lại bằng phin lọc 0,2 µm Trypan blue 0,4% Trypan blue là thuốc nhuộm dùng để phân biệt tế bào (hoặc mô) chết và sống thông qua sự bắt màu xanh của tế bào (hoặc mô) chết. - Trypan blue (Merk) 0,4 g - PBS 100 ml Hòa tan và lọc bằng giấy lọc Whatman 2.2.2.6. Thuốc mê Ketamine Thành phần: Ketamine hydrochloride, liều dùng đối với chuột là 80mg/kg thể trọng, bảo quản ở 15÷300 C, tránh ánh sáng. 2.2.3. Dụng cụ - Thiết bị 2.2.3.1. Dụng cụ Bảng 2.2. Danh sách dụng cụ sử dụng trong đề tài STT Tên dụng cụ Hãng sản xuất Nước sản xuất 1 Becher (50ml, 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml) Schott Đức Phạm Lê Bửu Trúc - 30 - 2 Erlen (50ml, 100ml) Schott Đức 3 Bình Duran (50ml, 100ml, 250ml) Schott Đức 4 Phin lọc vô trùng 0,2 µm Minisart Hoa Kỳ 5 Túi thu nhận máu Singapore 6 Đĩa 4 giếng Nunc Đan Mạch 7 Bình Flask 25cm2 Nunc Đan Mạch 8 Ống ly tâm 15 ml Corning Hoa Kỳ 9 Kim tiêm Vikimco Việt Nam 10 Pipet pasteur Assistant Đức 11 Eppendorf 1500µl Kartell Spa Pháp 12 Đầu tip 1000µl, 100 µl 13 Micropipette 100-1000 µl, 10-100 µl, 5-50 µl Nychiro Nhật 14 Bình định mức 1000 ml Schott Đức 15 Buồng đếm hồng cầu Neubauer Đức 16 Lamelle Neubauer Đức 17 Que thử đái tháo đường Accu-Check ® Active Roche Đức Phạm Lê Bửu Trúc - 31 - 2.2.3.2.Thiết bị Bảng 2.3. Danh sách các thiết bị sử dụng trong đề tài STT Tên dụng cụ Hãng sản xuất Nước sản xuất 1 Buồng thao tác vô trùng Sanyo Nhật 2 Tủ lạnh Sanyo Nhật 3 Máy ly tâm Hettich Đức 4 Máy Vortex VX100 Labnet Đức 5 Tủ nuôi cấy mô và tế bào Sanyo Nhật 6 Kính hiển vi đảo ngược Narishage Nhật 7 Máy khuấy từ Stuart Đức 8 Tủ ấm Memmert Đức 9 Máy hấp khử trùng Daihan Hàn Quốc 10 Máy chuẩn pH Stuart Đức 11 Glucose test metter Accu-Check® Active Roche Ai-len Phạm Lê Bửu Trúc - 32 - 2.3. PHƯƠNG PHÁP 2.3.1. Phương pháp cấy chuyền và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô máu cuống rốn Nguyên tắc Cấy chuyền cung cấp không gian và chất dinh dưỡng cho tế bào gốc trung mô tăng sinh và phát triển đạt hiệu quả cao. Quá trình thực hiện - Đổ bỏ môi trường cũ trong bình Roux nuôi tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người - Rửa tế bào bằng PBS - Bổ sung 1÷2ml Trypsin/EDTA 0,25 %/Roux - Đặt trong tủ ấm 370C, 5 % CO2 từ 2÷3 phút - Lắc nhẹ bình Roux - Thêm 12ml môi trường nuôi cấy IMDM 10%FBS - Chia đều dịch huyền phù tế bào cho 3 Roux - Nuôi trong tủ ấm 370C, 5 % CO2 Đánh giá kết quả Các tế bào không nhiễm khuẩn và nấm, hình dạng tương tự nguyên bào sợi. 2.3.2. Phương pháp thu dịch chiết tụy chuột Nguyên tắc Dựa vào lực cơ học và sự hình thành tinh thể đá ở nhiệt độ âm để phá vỡ màng tế bào thu dịch chiết. Phạm Lê Bửu Trúc - 33 - Quá trình thực hiện Thu tụy chuột - Khử trùng dụng cụ thiết bị - Giết chuột bằng cách kéo giãn đốt sống cổ - Cắt ngang vùng da chuột 1 đường. Dùng kẹp vô trùng kéo ngược vùng da chuột lên đầu để lộ nội quan chuột - Kéo ruột chuột qua phía bên trái để lộ tụy - Dùng kẹp tách phần tụy dính với lách và ruột, thu tụy - Cho tụy vào eppendorf chứa sẵn PBS pha 10% FBS Thu dịch chiết tụy - Cắt nhuyễn tụy chuột - Bổ sung dung dịch PBS 10% FBS vào becher chứa tụy chuột cắt nhuyễn tùy theo nồng độ mong muốn - Khuấy từ 200 vòng/phút trong 30 phút ở 36,50C - Đông lạnh nhanh mẫu ở -800C, để qua đêm - Giải đông mẫu - Li tâm 3000 vòng /phút trong 10 phút. Cho dịch nổi thu được vào một eppendorf sạch khác - Tiếp tục li tâm 12000 vòng/phút trong 20 phút - Thu dịch chiết tụy chuột - Bổ sung dịch chiết tụy chuột vào môi trường L-DMEM để được các nồng độ cần khảo sát: 100 µg/ml, 200 µg/ml, 300 µg/ml, 400 µg/ml, 500 µg/ml và 600 µg/ml - Vô trùng dịch chiết bằng cách lọc qua màng lọc 0,2µm - Môi trường có bổ sung dịch chiết được trữ lạnh 40C [Hình 10, phụ lục 1] Đánh giá kết quả Dịch chiết tụy được xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford. Phạm Lê Bửu Trúc - 34 - 2.3.3. Phương pháp Bradford Nguyên tắc Phương pháp Bradford dựa trên trạng thái cân bằng giữa các dạng Coomasie Blue G. Dưới điều kiện axit, thuốc nhuộm bền nhất với dạng màu đỏ 2 proton. Tuy nhiên, khi kết hợp với protein, thuốc nhuộm bền ở dạng màu xanh không có proton và hấp thụ mạnh ở bước sóng 595nm. Quá trình thực hiện Tiến hành pha các nồng độ albumin làm đường chuẩn protein: - Pha dung dịch albumin nồng độ 0,1mg/ml - Cho các thành phần theo thứ tự như trong bảng 2.4 Bảng 2.4. Các thành phần của phương pháp Bradford Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Nước cất (ml) 1 1 0.9 0.9 0.8 0.8 0.7 0.7 0.6 0.6 0.5 0.5 Albumin 0,1mg/ml(ml) 0 0 0.1 0.1 0.2 0.2 0.3 0.3 0.4 0.4 0.5 0.5 Nồng độ protein µg/ml 0 0 10 10 20 20 30 30 40 40 50 50 Thuốc nhuộm Bradford(ml) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 - Cho 1 ml mẫu dịch chiết vào ống nghiệm và bổ sung 5ml thuốc nhuộm - Lắc đều. Thời gian ủ cho phản ứng bắt màu là 30 phút - Khởi động máy đo OD 30 phút. Tiến hành đo OD - Đo giá trị của mẫu chứng không (mẫu có nồng độ protein 0 µg/ml ) và set ref (re- zero) Phạm Lê Bửu Trúc - 35 - - Lần lượt cho dung dịch albumin có nồng độ chuẩn từ thấp lên cao. Đo giá trị OD. Xây dựng đường chuẩn giá trị OD theo nồng độ protein. - Cho mẫu dịch chiết đã bổ sung thuốc nhuộm vào đo giá trị OD - Gióng giá trị OD mẫu dịch chiết vào đường chuẩn, từ đó suy ra giá trị nồng độ protein trong mẫu dịch chiết. 2.3.4. Biệt hóa tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người thành tế bào tiết insulin Nguyên tắc Loại bỏ các tác nhân biệt hóa không định hướng. Cảm ứng tế bào gốc biệt hóa thành dạng tế bào mong muốn bằng các tác nhân biệt hóa thích hợp. Quá trình thực hiện 2.3.4.1. Biệt hóa tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người thành tế bào tiết insulin bằng dịch chiết tụy chuột Tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người được thử nghiệm biệt hóa bằng dịch chiết tụy với các nồng độ 100 µg/ml, 200 µg/ml, 300 µg/ml, 400 µg/ml, 500 µg/ml và 600 µg/ml. Mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người được duy trì bằng môi trường L- DMEM mà không bổ sung dịch chiết tụy chuột trong 14 ngày được sử dụng làm mẫu đối chứng âm. Thu tiểu đảo tụy, nhuộm với DTZ dùng làm đối chứng dương. Các bước tiến hành - Bỏ môi trường cũ trong đĩa 4 giếng chứa tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người - Rửa tế bào 2 lần bằng PBS - Bổ sung môi trường biệt hóa - Nuôi trong tủ ấm 370C, 5% CO2 - Thay môi trường sau mỗi 2 ngày trong 14 ngày Phạm Lê Bửu Trúc - 36 - 2.3.4.2. Biệt hóa tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người thành tế bào tiết insulin bằng hóa chất Tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người được thử nghiệm biệt hóa thành tế bào tiết insulin bằng hóa chất theo quy trình thuận và theo quy trình nghịch. Ở quy trình thuận, tế bào được tiền cảm ứng trong môi trường L-DMEM có nồng độ đường thấp (1g/L) sau đó được cảm ứng trong môi trường H-DMEM có nồng độ đường cao (4,5g/L). Ở quy trình nghịch, tế bào được tiền cảm ứng trong môi trường H-DMEM có nồng độ đường cao (4,5g/L) sau đó được cảm ứng trong môi trường L-DMEM có nồng độ đường thấp (1g/L). Tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người được nuôi trong môi trường H- DMEM và L-DMEM không bổ sung Nicotinamide, beta-mercaptoethanol làm đối chứng âm. Thu tiểu đảo tụy, nhuộm với DTZ dùng làm đối chứng dương. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. + Biệt hóa theo quy trình thuận - Bỏ môi trường cũ trong đĩa 4 giếng chứa tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người - Rửa tế bào 2 lần bằng PBS - Bổ sung môi trường L-DMEM biệt hóa - Nuôi trong tủ ấm 370C, 5% CO2 trong 2 ngày - Thay môi trường L-DMEM biệt hóa bằng môi trường H-DMEM biệt hóa - Nuôi trong tủ ấm 370C, 5% CO2 thay môi trường sau mỗi 2 ngày trong 12 ngày Phạm Lê Bửu Trúc - 37 - + Biệt hóa theo quy trình nghịch - Bỏ môi trường cũ trong đĩa 4 giếng chứa tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người - Rửa tế bào 2 lần bằng PBS - Bổ sung môi trường H-DMEM biệt hóa - Nuôi trong tủ ấm 370C, 5% CO2 trong 2 ngày - Thay môi trường H-DMEM biệt hóa bằng môi trường L-DMEM biệt hóa - Nuôi trong tủ ấm 370C, 5% CO2 thay môi trường sau mỗi 2 ngày trong 12 ngày Đánh giá kết quả Kết quả được đánh giá thông qua sự thay đổi hình dạng và khả năng bắt màu với thuốc nhuộm DTZ của các tế bào được biệt hóa. 2.3.5. Phương pháp xác định tế bào tiết insulin bằng cách nhuộm với DTZ DTZ kết hợp với phân tử Kẽm (Zn ) trong cấu trúc hexamer của insulin tạo phức đỏ [Hình 11, phụ lục 1]. Các bước tiến hành: - Đổ hết môi trường trong bình nuôi tế bào ra ngoài - Bổ sung dung dịch thuốc nhuộm vào bình - Ủ bình trong tủ nuôi 370C, trong 15÷30 phút - Quan sát sự xuất hiện màu của các cụm tế bào dưới kính hiển vi đảo ngược 2.3.6. Phương pháp đếm số lượng cụm tế bào trong môi trường nuôi cấy Trạng thái bám dính được đánh giá bằng khả năng cố định trên bề mặt bình Roux. Khi di chuyển bình Roux các tế bào bám này không trôi nổi theo dòng môi trường lay động. Để đếm số lượng cụm tế bào bám dính trong môi trường nuôi cấy, tiến hành đếm số lượng cụm tế bào bám dính vào bề mặt nuôi trong 10 thị trường khác nhau được chọn ngẫu nhiên ở độ phóng đại 10X của kính hiển vi đảo ngược. Kết quả sau khi đếm sẽ được tính trung bình cộng [Hình 12, phụ lục 1]. Phạm Lê Bửu Trúc - 38 - 2.3.7. Thử nghiệm điều trị đái tháo đường bằng cách cấy ghép tế bào lên mô hình chuột 2.3.7.1. Phương pháp nhuộm với Trypan blue và đếm số lượng tế bào bằng buồng đếm hồng cầu Nguyên tắc Phương pháp này sử dụng Trypan blue nhuộm tế bào để phân biệt tế bào sống và tế bào chết. Trypan blue là một loại thuốc nhuộm màu xanh dương chỉ có thể đi xuyên qua màng tế bào chết. Do vậy, khi dịch tế bào được hòa với Trypan blue, những tế bào sống có kích thước nhỏ, tròn, màng còn nguyên vẹn sẽ không hấp thu được thuốc nhuộm Trypan blue nên khúc xạ ánh sáng. Những tế bào chết, màng bị vỡ, sẽ hấp thu được thuốc nhuộm nên phồng lên, lớn hơn và có màu xanh sẫm. Sử dụng buồng đếm Neubauer (Đức) để đếm số lượng tế bào. Sử dụng vật kính 10X. Quy trình tiến hành − Rửa sạch buồng đếm Neubauer và lamelle bằng nước cất, bằng cồn rồi đem sấy khô − Đặt 1 miếng lamelle lên trên buồng đếm và ép dính nó vào buồng đếm − Lấy 10 µl dịch huyền phù tế bào cho vào 1 giếng trong đĩa 96 giếng, bổ sung 10 µl Trypan blue 0,4% vào giếng đó, hòa đều bằng micropipette, rồi hút dịch tế bào này cho vào buồng đếm − Đếm số tế bào sống có trong 5 ô lớn ở vùng trung tâm của buồng đếm. Mỗi mẫu thực hiện đếm 3 lần Phạm Lê Bửu Trúc - 39 - Đánh giá kết quả Số lượng tế bào sống có trong mẫu được xác định bằng giá trị trung bình của các lần đếm trên và được tính theo công thức: Trong đó: V1, V2, V3 là số tế bào sống của lần đếm 1, 2, 3 V là số tế bào sống có trong mẫu. Buồng đếm gồm 9 vùng lớn. Vùng giữa gồm 25 ô lớn. Mỗi ô lớn gồm 16 ô nhỏ hơn. Mỗi vùng có thể tích là 1 x 1 x 0,1 = 0,1 mm 3 = 10-4 ml. Công thức tính mật độ tế bào: 2.3.7.2. Phương pháp ghép tế bào gốc trung mô máu cuống rốn và tế bào tiết insulin lên chuột đái tháo đường Tiến hành thí nghiệm trên 4 lô chuột: lô chuột bình thường (BT), lô chuột đái tháo đường tiêm PBS (ĐC), lô chuột đái tháo đường được ghép bào gốc trung mô (TM), lô chuột đái tháo đường ghép tế bào tiết insulin (TI). Mỗi lô gồm 3 con chuột Mus musculus var. Albino từ 8÷10 tuần tuổi, cùng giới tính, cân nặng từ 20÷25g. Các lô chuột được nuôi cùng điều kiện chăm sóc, dinh dưỡng. Cảm ứng gây bệnh đái tháo đường bằng cách tiêm STZ liều 50mg/kg/ngày trong 5 ngày liên tiếp và khảo sát nồng độ đường huyết trong 20 ngày tiếp theo. Phạm Lê Bửu Trúc - 40 - Các con chuột đái tháo đường được chọn dùng trong thử nghiệm ghép tế bào điều trị đái tháo đường là những con chuột vẫn giữ được mức đường huyết cao (>126mg/dL) sau 20 ngày kể từ ngày tiêm liều STZ cuối cùng. Tách tế bào bằng trypsin/EDTA 25%, ly tâm 1500 vòng/phút trong 5 phút thu nhận tế bào. Ghép 5 x 106 tế bào gốc trung mô hoặc 5 x 106 tế bào tiết insulin lên chuột đái tháo đường ở vùng tụy nằm dưới mỏm lách sát dạ dày chuột. Tiến hành khảo sát đường huyết, cân nặng, sức sống cách mỗi 3 ngày liên tục trong 30 ngày. Sau 30 ngày, tiến hành thu máu toàn phần để khảo sát sự tồn tại của insulin trong máu bằng phương pháp HPLC. Giải phẩu chuột thu nhận tụy để khảo sát sự hư hại cũng như sự phục hồi đảo tụy thông qua việc đếm số tế bào đảo tụy bắt màu với DTZ. Phương pháp ghép tế bào tiếp cận tụy − Chuột được làm sạch lông ở vùng hông cách đùi trái 1,5 cm về phía dạ dày − Gây mê chuột bằng ketamine với liều 80 mg/kg bằng cách tiêm xoang bụng − Sau 15 phút chuột bắt đầu mê, tiến hành xác định vị trí tuỵ chuột − Sát trùng bằng cồn 70o ở vị trí mổ − Chuyển 0,1 ml dịch tế bào vào ống syrine 1 ml – 26G − Dùng kéo cắt nhẹ một đường khoảng 3 mm để thấy được vị trí mỏm lách nằm sát với dạ dày chuột − Tiêm dịch tế bào nhẹ nhàng vào tuỵ phía dưới lách theo hướng chếch 30o so với mặt bụng, đầu kim hướng song song về phía lách − Rút kim ra một cách nhẹ nhàng và sát trùng vết mổ bằng iodoform Trong khi ghép, có rất ít máu chảy ra từ vết mổ và hầu như không cần phải dùng chỉ khâu. Không thấy có tình trạng xuất huyết nội tạng do đâm trúng phải các phần nội quan khác bên trong ổ bụng của chuột. Sau khi ghép chuột dần hồi phục, ăn uống bình thường [Hình 13, phụ lục 1]. Phạm Lê Bửu Trúc - 41 - Quy trình đo đường huyết − Trước khi đo đường huyết chuột, cho chuột nhịn đói 6 giờ − Sau đó, đặt chuột vào một ống Falcon − Xác định tĩnh mạch đuôi − Dùng kim 1ml chích vào tĩnh mạch, tạo một lỗ nhỏ cho máu chảy ra − Dùng giấy mềm thấm bỏ giọt máu đầu tránh các tác nhân dính trên đầu kim khi chích vào tĩnh mạch, gây ảnh hưởng đến mức độ chính xác của kết quả − Nhận giọt máu thứ hai và sử dụng máy đo đường huyết để xác định mức đường huyết ở chuột Quy trình chăm sóc chuột − Thay chuồng: đối với các chuồng thực nghiệm và đối chứng thì cách 1 ngày thay chuồng 1 lần, mạc cưa phải được ray sạch hết bụi và hấp khử trùng trước khi sử dụng. Mục đích hạn chế thấp nhất khả năng nhiễm bệnh của chuột thí nghiệm − Các chuồng nuôi khác thì ít nhất cách 2 ngày thay chuồng 1 lần, mạc cưa cũng phải được ray sạch bụi và dị vật trước khi sử dụng − Nước uống: Chỉ đổ tối đa 2/3 chai nước, cho uống nước máy, phải thay nước hàng ngày − Thức ăn: Ngày cho ăn 2 lần. Sáng: trong khoảng 8h đến 10h và chiều: trong khoảng 2h đến 4h. Mỗi lần chỉ cho 2g thức ăn/con chuột Phạm Lê Bửu Trúc - 42 - 2.3.7.3. Kiểm tra sự hiện diện của insulin trong huyết thanh bằng phương pháp HPLC Nguyên tắc Phương pháp HPLC là phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Dung dịch hợp chất được bơm qua cột sắc ký với áp suất cao trong các hệ dung môi phù hợp cho việc phân tách chất trong dung dịch mẫu. Các hợp chất lần lượt ra khỏi cột sắc ký được đầu dò xác nhận và hiển thị tín hiệu lên sắc ký đồ. Với độ chính xác cao, phương pháp HPLC cho phép phân tích các hợp chất trong mẫu và có thể thu nhận các hợp chất này với thiết bị thích hợp. Quy trình tiến hành Chuẩn bị dung dịch A (H2O 0,1% TFA), dung dịch B (Acetonitrile 0,1% TFA). Sử dụng máy sắc kí HPLC Agilent 1100 Series. Nạp dung dịch mẫu vào cột Agilent Zorbax Extend - C18. Với chương trình giải ly như sau: − Phút đầu tiên giải ly bằng dung dịch A − 30 phút sau, giải ly với nồng độ dung dịch B tăng từ 0% - 40% − 5 phút tiếp theo giải ly với nồng độ dung dịch B tăng từ 40% - 100% − 5 phút tiếp theo, giải ly với dung dịch B giữ nguyên mức 100% − 5 phút tiếp theo, giải ly với nồng độ dung dịch B giảm từ 100% - 0% − Tổng thời gian giải ly cột là 46 phút, tốc độ giải ly 1ml/phút Đánh giá kết quả Những con chuột bình thường và những con chuột có khả năng phục hồi sau khi ghép thì trong huyết thanh sẽ có insulin, còn những con chuột bị bệnh đái tháo đường và không phục hồi sau khi ghép thì sẽ không hiện diện insulin trong huyết thanh. Phạm Lê Bửu Trúc - 43 - 2.3.7.4. Phương pháp tách mô tụy thành các tế bào đơn Thu nhận mô tụy Tụy chuột nằm ở xoang bụng gần gan, lách và dạ dày. Tụy tạng có màu hồng nhạt, có chia thùy hình răng cưa, một đầu đính vào đoạn ruột tá. − Giết chuột bằng cách kéo dãn đốt sống cổ − Sát trùng vùng bụng chuột bằng cồn 700 − Dùng kéo cắt ngang lớp da bụng một đường, dùng kẹp kéo ngược lớp da về phía đầu để lộ phần nội quan − Cắt mô tụy, thao tác cần khéo léo để tránh lẫn các mạch máu − Bảo quản mô tụy vừa thu nhận trong dung dịch PBS-gentamycine Tách mô tụy thu được thành các tế bào đơn bằng màng lọc tế bào động vật Màng lọc tế bào động vật thường có đường kính từ 70 ÷ 100 μm. Với kích thước lỗ như thế này chỉ cho một tế bào lọt qua. Nên màng lọc tế bào được sử dụng để phân tách tế bào đơn rất hiệu quả [Hình 14, phụ lục 1]. − Mô tụy được rửa qua dung dịch PBS – gentamycine, lặp lại 3 lần − Đặt mô trong bercher, dùng kéo nhỏ cắt thật nhuyễn mô − Lấy màng lọc tế bào đặt lên trên một bercher khác, đổ toàn bộ phần mô đã cắt nhuyễn vào trong màng lọc − Sau đó, dùng pittong của syringe 10 ml chà xát lên trên mô, những tế bào nào có kích thước nhỏ hơn đường kính lỗ lọc sẽ lọt qua − Thu nhận dịch tế bào, nhuộm tế bào với DTZ − Đếm số tế bào bắt màu với thuốc nhuộm DTZ 2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel. Phạm