Nghiên cứu thành phần alkaloid trong tâm sen (Nelumbo nucifera Gaertn nelumbonaceae)

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 606 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN ALKALOID TRONG TÂM SEN (NELUMBO NUCIFERA GAERTN NELUMBONACEAE) Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ*, Nguyễn Đức Tuấn**, Trần Hùng* TÓM TẮT Mở đầu: Sen (Nelumbo nucifera Gaertn.) họ Nelumbonaceae là một trong số ít các dược thảo mà tất cả các bộ phận đều là những vị thuốc quí. Việc nghiên cứu thành phần hóa học cây Sen đã được một số tác giả trên thế giới thực hiện. Tuy nhiên, tại Việt Nam chưa có nhiều công trình nghiên cứu kỹ và toàn diện về tâm Sen. Trong hướng nghiên cứu về thành phần và tác dụng sinh học của Sen ở các tỉnh phía Nam, bài báo này công bố về thành phần alkaloid của tâm Sen và phân lập alkaloid chính trong Sen để dùng làm chất chuẩn cho tiêu chuẩn hoá các dược liệu cũng như góp phần bổ sung cơ sở dữ liệu về thành phần hóa học cho cây Sen Việt Nam. Mục tiêu: Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của alkaloid trong tâm Sen. Phương pháp: Chiết cao chiết toàn phần và tách thành các phân đoạn đơn giản bằng phân bố giữa nuớc với các dung môi có độ phân cực khác nhau và theo pH. Phân lập chất tinh khiết bằng sắc ký cột chân không và sắc ký cột cổ điển... Cấu trúc các chất phân lập được xác định bằng phổ UV-Vis, MS, NMR. Kết quả: Tách được các phân đoạn đơn giản hơn (P, NP8, NP5) từ cao alkaloid toàn phần theo sự biến thiên pH. Đồng thời đã phân lập được alcaloid EN-1, EN-2 được xác định là neferin và nuciferin. Kết luận: Đề tài đã xác định được chất tinh khiết neferin và nuciferin tạo cơ sở cho việc định tính điểm chỉ và định lượng neferin trong tâm Sen ở các vùng miền và mùa thu hái khác nhau hay các chế phẩm chứa tâm Sen bằng kỹ thuật HPLC/PDA. Từ khóa: Nelumbo nucifera, Nelumbonaceae, Alkaloid, Neferin. ABSTRACT STUDY ON ALKALOIDAL CONSTITUENTS OF LOTUS EMBRYO (NELUMBO NUCIFERA GAERTN ) Do Chau Minh Vinh Tho, Nguyen Duc Tuan, Tran Hung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 606 - 611 Background: Lotus (or Sen in Vietnamese) - Nelumbo nucifera Gaertn., Nelumbonaceae is one of the few herbs that all components are valuable medicines. The studies on its chemical constituents have been conducted by numbers of authors in the world. However, in Vietnam there have not been many researchs on this plants. In the direction of chemical and pharmacological studies on lotus of south Vietnam, this paper will report the alkaloidal constituents and the isolation of the main alkaloid of Loti embryo. Objectives: Extraction, isolation and structure elucidation of alkaloids in Loti embryo. Methods: Alcoholic extract of embryo was subjected to liquid-liquid distribution based on the solubility of the substances in solution by pH. Simple fractions was separated by extraction, fractionation and isolation were carried out as common phytochemical methods. Structures of isolated compounds were deduced by means of UV, MS and NMR spectroscopy. Results: The content of alkaloid in crude ethanol extraction of Loti embryo was 0.99%. The simpler fractions (P, NP8, NP5) obtained by liquid-liquid distribution based gradient pH. Two alkaloids EN-1, EN-2 were isolated *Khoa Dược, Trường đại học Y Dược Cần Thơ **Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên hệ: PGS. TS. Trần Hùng ĐT: 0918057096 Email: tranhung@uphcm.edu.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 607 and identified as neferine and nuciferine. Conclusion: Two major alkaloids of Loti embryo. ie. neferine and nuciferine, was isolated and identified. These alkaloids could be used as markers for quality control and investigation of there pharmacological activities in further studies. Keywords: Nelumbo nucifera, enbryo, alkaloid, neferine, nuciferine, structure. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong kho tàng thực vật và cây thuốc Việt Nam, cây Sen (Nelumbo nucifera Gaertn. Nelumbonaceae) mọc ở ao, hồ có ở khắp mọi miền đất nước, là một trong số ít các dược thảo mà tất cả các bộ phận đều là những vị thuốc quí, có giá trị sinh học cao(2,5). Tuy nhiên, hiện nay việc sử dụng các chế phẩm bào chế từ tâm, lá Sen như thuốc viên uống, cao thuốc, các loại trà đều là dạng cao toàn phần, dịch chiết toàn phần. Do đó nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tiêu chuẩn hóa thành phần alkaloid chính có tác dụng sinh học trong tâm Sen Việt Nam sẽ góp phần nâng cao tiêu chuẩn chất lượng của dược liệu và các chế phẩm từ Sen cũng như thăm dò các tác dụng sinh học của chúng là việc làm cần thiết. NGUYÊN LIỆU- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu Tâm Sen (được sấy khô ở 40 0C và bảo quản ở nhiệt độ thấp) được thu mua từ cơ sở “Chế biến các sản phẩm từ Sen” tại Thị Trấn Mỹ Thọ, TP. Cao Lãnh. Mẫu được định danh và lưu tại bộ môn Dược liệu, khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM. Phương pháp nghiên cứu Phân tách các phân đoạn chiết bằng phân bố lỏng-lỏng, sắc kí cột chân không. Phân lập các chất bằng sắc kí cột cổ điển, sắc ký rây phân tử và kết tinh phân đoạn. Xác định phổ UV các chất phân lập được trên máy Hitachi L2000 detector DAD và phổ MS trên máy Quatro Micro API (Waters). KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Định tính bằng sắc ký lớp mỏng Qua thăm dò một số hệ dung môi cho sắc ký lớp mỏng, hệ dung môi DCM-MeOH-NH4OH (90:10:1) có khả năng tách tốt các alkaloid phân cực mạnh và trung bình của tâm Sen và hệ dung môi DCM-MeOH-NH4OH (95:5:1) tách tốt các alkaloid kém phân cực. Chiết cao chiết cồn toàn phần Cao cồn toàn phần của tâm Sen được chiết theo quy trình sau: UV365 UV254 Dragendorf f Hình 1. Sắc ký đồ alkaloid toàn phần của tâm sen Hdm: DCM-MeOH-NH4OH (90:10:1) Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 608 Tách phân đoạn P, NP, NP8 Từ phân đoạn NP ở trên, dịch CHCl3 được cô đến cắn, hòa vào H2SO4 2% điều chỉnh đến pH=5 bằng NH4OH 25%, chiết phân bố với CHCl3 đến khi hầu như không còn alkaloid qua lớp CHCl3. Dịch chiết được gộp lại thu được phân đoạn NP5. Tiếp tục kiềm hóa dịch pH=4-5 ở trên đến pH=7-8, chiết phân bố với CHCl3 đến khi hầu như không còn alkaloid qua lớp CHCl3. Dịch chiết được gộp lại thu được phân đoạn NP8. Kết quả tách các phân đoạn từ cao chiết cồn được minh hoạ trong Hình 2 TP P NP NP5 NP7 Hình 2. Sắc ký đồ các phân đoạn từ cao cồn Hdm: DCM-MeOH-NH4OH (90:10:1) Phân lập EN-1 Phần kết tinh thô I được hòa tan trong một lượng vừa đủ H2SO4 loãng, lọc và để kết tinh trong tủ lạnh. Tinh thể được lọc và rửa kỹ bằng nước lạnh đến khi dịch rửa trung tính, thu được tinh thể hình kim, màu trắng (EN-1). Tiến hành sắc ký lớp mỏng cho thấy EN-1 là một alkaloid phân cực trung bình và có hàm lượng cao nhất trong tâm Sen và EN-1 chỉ cho một vết trên đèn UV và thuốc thử Dragendorff cho thấy kết tinh thô I là tinh khiết trên TLC với EN-1. TP P NP NP5 NP7 TP P NPNP5 NP7 UV365 UV254 Dragendorff Điều chỉnh đến pH=7-8, Chiết với CHCl3 Bột tâm sen Cồn 70%, thu hồi cồn dưới áp suất giảm Dịch chiết đậm đ Thêm H2SO4 Dịch acid Dịch sau khi loại kết tinh Kết tinh thô I NH4OH đến pH=9, chiết với CHCl3 Dịch kiềm pH=7-8 Dịch chiết CHCl3 Chiết với NaOH Phân đoạn NP Phân đoạn P Dịch chiết pH=5 Phân đoạn NP5 Dịch kiềm Phân đoạn NP8 TP P NP NP5 NP7 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 609 Hình 4. SKĐ của EN-1 trên ba hệ dung môi khác nhau Phổ UV của EN-1 trong dung môi nước cho λmax 282nm nằm trong vùng hấp thu của alkaloid có khung bibenzylisoquinolein phù hợp với λmax của neferin mà tài liệu nước ngoài đã công bố(4). Phổ MS có đỉnh [M-Na]+ có m/z = 647, tương ứng với khối lượng phân tử 624 của neferin(4). 282 200 300 400 EN1-20ppm 0.0 0.5 1.0 Abs Hình 5. Phổ Uv-vis của EN-1 Hình 6. Phổ MS của EN-1 Phân lập EN-2 từ NP8 NP8 được cô dưới áp suất giảm để được dịch CHCl3 đậm đặc và phần kết tủa màu vàng. Dịch CHCl3 được cô tới cắn. Hòa tan cắn với lượng vừa đủ dung dịch H2SO4 2%. Dịch acid được loại tạp bằng ether dầu hỏa và kiềm hóa bằng amoniac tới pH 8-9. Chiết alkaloid từ dịch kiềm bằng chloroform và cô thu hồi dung môi thu được cắn. Hòa tan vào một lượng tối thiểu methanol và để kết tinh thu được hình lăng trụ (EN-2). Tiến hành SKLM cho EN-2 với ba hệ dung môi khác nhau, EN-2 chỉ cho một vết trên đèn UV và thuốc thử Dragendorff cho thấy EN-2 là một alkaloid kém phân cực và tinh khiết trên TLC. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 610 Hình 7. Sắc ký đồ kiểm tra EN-2 EN-2 có dạng tinh thể hình lăng trụ, không màu, không mùi, vị đắng. Nhiệt độ nóng chảy khoảng 163-164 0C, αD27 = -1450C = 0.67, EtOH), λmax (log ε EtOH) = 310 nm (3.83), 272 nm (4.32), 230 nm (4.36) (Hình 8). EN-2 có huỳnh quang xanh lục sáng dưới đèn UV254. Phổ khối ESI – MS positive của EN-2 cho mảnh [M +H]+ ở m/z = 296,01, mảnh [M + Na]+ có m/z = 317,93, mảnh [M – OCH3]+ có m/z = 264,96 và mảnh [M – (OCH3 + CH3)]+ có m/z = 249,91. Hình 8. Phổ UV của EN-2 Hình 9. Phổ MS của nuciferin Phổ 1H-NMR, 13C-NMR của EN-2 cho thấy phân tử có 21H, 19C trong đó có 3C bậc 1, 3C bậc hai, 6C bậc ba, 7C bậc 4. Chuyển dịch hoá học của carbon của EN-2 được so sánh với nuciferin, một trong những alkaloid chính của tâm Sen. EN-2 có chuyển dịch hoá học hoàn toàn phù hợp với chuyển dịch hoá học của nuciferin trong tài liệu(5,6). Qua các dữ liệu thu được có thể kết luận EN-2 là nuciferin (C19H21NO2) KẾT LUẬN Thành phần alkaloid của tâm Sen đã được khảo sát bằng sắc ký lớp mỏng. alkaloid chính trong đó đã được phân lập và xác định cấu trúc Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 611 là neferin và nuciferin. Các alkaloid này có thể sử dụng làm chất đánh dấu trong nghiên cứu tiêu chuẩn hoá tâm Sen và các chế phẩm có tâm Sen cũng như để khảo sát các tác dụng dược lý. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Chen Yi, Luo Shun-De, (2004), “Quantitative analysis of three main alkaloids in plumula nelumbinis and the study on characteristic chromatogram”, chin hosp pharm J, 24(4), pp. 205-208. 2. Đỗ Tất Lợi (2005), “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, Nhà xuất bản Y học, tr. 783- 786. 3. Giáo trình phương pháp nghiên cứu dược liệu (2009). Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược đại học Y- Dược TP.HCM. 4. Hiroshi Furukawa (1966), “On the Alkaloids of Nelumbo Nucifera gaertn. XII. Alkaloids of Loti Embryo”, Yakugaku Zasshi, 86(1), pp. 75-77. 5. Nguyễn Thị Nhung, Phạm Thanh Kỳ (1998), “Nghiên cứu thành phần hóa học trong lá Sen”, Tạp chí dược học, tháng 6 nǎm 1998, tr 13 - 18. 6. Trịnh Văn Lẩu, Trần Việt Hùng, Phạm Thanh Kỳ (2009), ‘Nghiên cứu chiết xuất phân lập và tinh khiết nuciferine, linarine, chlorogenic acid và Myricetine từ những cây thuốc để làm chuẩn”, Pharmaindochina VI năm 2009. Tr. 587-592.