Nghiên cứu thành phần hóa học cây mắt trâu (Micromelum hirsutum OLIV.)

Tạp chí Hóa học, T. 42 (2), Tr. 177 - 181, 2004 Nghiên cứu thành phần hóa học cây mắt trâu (Micromelum hirsutum OLIV.) Đến Tòa soạn 14-7-2003 Trịnh Thị Thủy1, Trần Văn Sung1, Guenter Adam2 1Viện Hóa học, Viện Khoa học v$ Công nghệ Việt Nam 2Leibniz Institute of Plant Biochemistry, Germany SUMMARY Two coumarins micromelin and magnolioside and three flavonoides have been isolated from the leaves of Micromelum hirsutum. Their structures have been determined on the basis of MS, 1H and 13C NMR spectroscopy. I - Mở đầu so sánh với các tài liệu đ\ công bố. 6' Cây Mắt trâu hay còn đ−ợc gọi là Lá méo, O H Mán chỉ, Chàm hôi hay Kim s−ơng (Micro- 1' melum hirsutum Oliv., Micromelum falcatum 5' H 5 4 Lour. hoặc Aulacia falcata Lour.) họ Cam quýt O 2' O 4' 3 3' 6 (Rutaceae), là loại cây nhỏ, mọc hoang khắp 2 CH3OO7 O miền rừng núi phía Bắc n−ớc ta nh− Hà Bắc, Cao 8 1 Bằng, Lạng Sơn, Thanh Hóa [1, 2]. Dân gian Việt 1 Nam dùng lá đắp lên viết th−ơng, vết loét hoặc sao vàng ngâm r−ợu xoa bóp chữa tê thấp, teo cơ. Một số nơi còn dùng lá hay rễ sắc uống, chữa OH HO 6' 4' kinh nguyệt không đều, sốt, đau nhức, tê thấp. 5' O Các nghiên cứu tr−ớc đây cho thấy các loài HO 2’ 3' 2' 1' Micromelium có chứa nhiều indol ancaloit, OH cacbazol ancaloit, flavonoit và 6,8-prenyl O 6 cumarin. Song, cho đến năm 1999 ch−a thấy có nghiên cứu về thành phần hóa học lá cây này [3]. CH3OO7 O Tiến hành nghiên cứu lá cây Mắt trâu thu hái tại V−ờn Quốc gia Cúc Ph−ơng, chúng tôi đ\ phân 2 lập và xác định đ−ợc cấu trúc hóa học của hai II - Thực Nghiệm hợp chất cumarin là micromelin (1), magnoliosit (2) và ba hợp chất flavonoit (3 - 5). Cấu trúc hóa Phổ cộng h−ởng từ hạt nhân đo trên máy học của các chất tách ra đ−ợc xác định bằng các VARIAN GEMINI-300 ở 300,24 MHz (1H) và ph−ơng pháp phổ nh− phổ khối (MS), phổ cộng 75,5 MHz (13C) và máy VARIAN UNITY-500 ở h−ởng từ proton, cacbon 13 (1H-, 13C-NMR) và 499,84 MHz (1H) và 125,5 MHz (13C) tại CHLB 177 Đức. Tetramethylsilan (TMS) dùng làm chất Magnoliosit (2): Chất vô định hình, màu trắng. 1 25 O chuẩn cho phổ H và tín hiệu dung môi dùng Hàm l−ợng 0,0018%. [α]D = 0 (pyridin, c 1,0). 13 MeOH làm chuẩn ở phổ C. Độ dịch chuyển hóa học (δ) UV λ max (logε): 320 (3,94), 224 (3,90). EI-MS đ−ợc tính theo ppm so với TMS hoặc dung môi (70 eV) m/z (%): 192 [M-glc]+(100), 177 (30), CDCl3 và pyridin-d5, hằng số t−ơng tác (J) tính 164 (10), 149 (12). ESI-MS (positive ions): 377 bằng Hz. Phổ tử ngoại đ−ợc ghi trên máy [M+Na]+ (100), 193 [M+H-Glc]+; ESI-MS UVIKON 940 CHLB Đức, sử dụng metanol (negative ions): 399 [M+Cl]- (12), 191 [M-H- tuyệt đối làm dung môi. Phổ khối EI-MS ghi trên Glc]- (100). máy ADM 402, 70 eV, CHLB Đức. Độ quay cực Chất 5,7-dihidroxy-3,6,4'-trimetoxyflavon (3): [α]D ghi trên máy JASCO Digital Polarimeter Ver. o O 100,19. Sắc ký lớp mỏng phân tích đ−ợc tiến Tinh thể hình kim màu vàng, đnc 173 C -175 C hành trên bản mỏng nhôm silicagel Merck 60F (EtOAc/MeOH). Hàm l−ợng 0,0592%. HR- 245 MS (70 eV) m/z (%): 344,0892 [M]+ (100) tráng sẵn, độ dày 0,2 mm. Silicagel cỡ hạt 0,040 + (C18H16O7), 329 [M-15] (100), 311 (5), 301 (8), - 0,063 mm đ−ợc dùng cho SKC. 1 286 (14), 271 (4), 135 (6). H-NMR (CDCl3, Xử lý mẫu thực vật v ph−ơng pháp chiết 300 MHz, δ ppm): 8,12 (2H, d, J = 9,0 Hz, H- 2' và H-6'), 7,04 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-3' và H- Mẫu cây Mắt trâu đ−ợc thu hái ở rừng Quốc 5'), 6,40 (1H, s, H-8); 13C-NMR (CDCl , 75,5 agia Cúc Ph−ơng vào tháng 12 năm 1996. Tên 3 δ cây do TS Trần Đình Đại xác định, tiêu bản số MHz, ppm): 178,9, 161,8, 153,3, 155,6, VN 53 (31/1/1996, Yên Châu, Sơn La) đ−ợc l−u 155,5, 148,2, 138,7, 130,0 (2C), 127,0, 122,7, tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện 114,2 (2C), 105,4, 98,7, 61,8, 60,1, 55,4, 50,7. Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 1,09 kg lá Chất 5,7-dihidroxy-3,6,8,4'-tetrametoxyflavon (4): o O khô đ−ợc ngâm chiết với dung dịch MeOH/H2O Tinh thể hình kim màu vàng, đnc 171 C -172 C (95 : 5). Dịch chiết đ−ợc loại bớt dung môi d−ới (EtOAc/MeOH). Hàm l−ợng 0,0592%. HR-MS + áp suất giảm, sau đó chiết lần l−ợt với n-hexan, (70 eV) m/z (%): 374 [M] (45) (C19H18O8), EtOAc và n-butanol. Loại dung môi thu đ−ợc 359 [M-15]+ (100), 341 (8), 331 (5), 316 (5), 18 g, 32 g và 23 g các cặn dịch chiết t−ơng ứng. 301 (3), 273 (4), 197 (5), 169 (4), 135 (7). 1H- Cặn dịch chiết EtOAc đ−ợc phân tách bằng NMR (CDCl3, 300 MHz, δ ppm): 8,14 (2H, d, J SKC trên silicagel, dung môi giải hấp = 9,0 Hz, H-2' và H-6'), 7,04 (2H, d, J = 9,0 13 CHCl3/MeOH (8 : 2) và cuối cùng tăng độ phân Hz, H-3' và H-5'); C-NMR (CDCl3, 75,5 cực bằng cách thêm n−ớc [CHCl3/MeOH/H2O MHz, δ ppm): 179,3, 161,8, 155,8, 148,8, (65 : 35 : 5)] thu đ−ợc 15 phân đoạn. Tinh chế tiếp 148,0, 144,9, 138,4, 130,5, 130,1 (2C), 127,2, phân đoạn 1 bằng SKC nhanh trên silicagel, 122,8, 114,2 (2C), 105,0, 61,7, 60,9, 60,0, dung môi n-hexan / etyl axetat và kết tinh lại thu 55,4. đ−ợc chất 1, 3, 4 và 5 sạch. Phân đoạn 15 đ−ợc Chất 7-hidroxy-3,5,6,8,4'-pentametoxyflavon (5): tinh chế tiếp bằng SKC nhanh trên silicagel, Tinh thể hình kim màu trắng, đnc 296oC -298OC dung môi giải hấp MeOH/EtOAc/H O (2 : 12 : 1) 2 (EtOAc/MeOH). Hàm l−ợng 0,0010%. EI-MS thu đ−ợc 22 mg chất 2 sạch. (70 eV) m/z (%): 388 (80), 387 [M-H]+ (5), 373 Micromelin (1): Tinh thể hình kim, màu trắng, [M-15]+ (100), 358 [M-30]+ (5), 343 [M-45]+ điểm nóng chảy (đnc): 214oC - 216OC (EtOAc/ (8), 315 (5), 211 (8), 194 (5), 135 (10). 1H-NMR MeOH). Hàm l−ợng: 0,0076% (so với nguyên (CDCl3, 300 MHz, δ ppm): 8,16 (2H, d, J = 9,0 liệu khô). Rf = 0,22, dung môi n-hexan/EtOAc Hz, H-2' và H-6'), 7,05 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-3' và 22 O MeOH 13 (60 : 40). [α]D = -72 (CHCl3, c 0,5). UV λ max H-5'), 12,4 (s, OH). C-NMR (CDCl3, 75,5 (logε): 320 (3,95), 224 (3,96). Phổ khối EI-MS MHz, δ ppm): 179,3, 161,9, 156,1, 152,9, 149,2, (70 eV) m/z (%): 288 [M]+ (100), 229 (45), 213 144,9, 138,6, 136,1, 132,9, 130,3 (2C), 122,9, (35), 203 (15), 186 (16). 107,5 (2C), 62,1, 61,7, 61,1, 60,1, 55,4. 178 III - Kết quả v+ thảo luận đ−ợc cấu trúc của chất 1 là (1'R*,4'R*,5'R*)-4'- (7-metoxy-2-oxo-2H-1-benzopyran-6-yl)-1'-metyl Dịch chiết metanol 95% của lá cây sau khi -3',6'-dioxabixyclo[3.1.0] hexan-2'-one. Chất này loại dung môi d−ới áp suất giảm đ−ợc phân bố lần đầu tiên đ\ đ−ợc phân lập từ lá cây lần l−ợt trong các dung môi n-hexan, etyl axetat Micromelum minutum và có tên là micromelin và n-butanol. Cất loại dung môi thu đ−ợc các hay micromelumin. Micromelin có hoạt tính cặn dịch chiết t−ơng ứng. Từ cặn dịch chiết etyl kháng khối u cao. Từ micromelin các tác giả úc axetat bằng sắc ký cột (SKC) th−ờng, SKC đ\ tổng hợp đ−ợc dẫn xuất isomicromelin [4]. nhanh (flash chromatography) và sắc ký lớp Phổ khối ion hóa bụi điện tử (ESI-MS) của mỏng điều chế trên silicagel với các hệ dung + môi thích hợp đ\ phân lập đ−ợc năm hợp chất chất 2 cho pic m/z 377 [M+Na] , 193 [M+H- + - 1, 2, 3, 4 và 5. Glc] (positive ions) và 399 [M+Cl] (negative ions). Phổ khối EI-MS có pic cơ bản tại m/z 192 Phổ tử ngoại của chất 1 và chất 2 cho thấy [M-162]+ (100), gợi ý cho thấy chất 2 có thể phân tử có nhân thơm qua cực đại hấp thụ gắn với glucose. Điều này đ−ợc khẳng định qua MeOH λ max (log ε): 320 (3,95), 224 nm (3,96). Phổ các tín hiệu của nhóm metylenoxy δ 62,2 (C-6') khối va chạm electron (EI-MS) cho biết trọng và 4 nhóm CH của glucose (δ 71,0, 74,6, 78,4 và + 1 l−ợng phân tử của chất 1 là 288 [M] . Phổ H- 79,1) ở phổ 13C và APT-NMR. Phổ 1H-NMR có NMR có cặp dublet có hằng số t−ơng tác (J = dublet δ 5,79 (J = 7,1 Hz, H-1') của proton anome 9,6 Hz) của hai proton cạnh nhau ở δ 6,32 và và các proton của glucose δ 4,19-4,53 (H-2'- H-6'). 7,67 (d, H-3 và H-4). Hai singulet δ 7,38 (H-5) Chất 2 có phần cumarin phù hợp với chất 1 đ−ợc và 6,88 (H-8), cho thấy C-6 và C-7 của cumarin thể hiện qua cặp dublet có hằng số t−ơng tác của có nhóm thế. Điều này đ−ợc khẳng định qua tín hai proton cạnh nhau δ 6,32 (d, J = 9,6 Hz, H-3) hiệu đơn của nhóm metyl ở δ 1,68 (Me-1'), và 7,66 (d, J = 9,3 Hz, H-4). Hai singulet δ 7,50 metoxy δ 3,89 (MeO-7) và đ−ợc thấy rõ hơn qua (H-5), 7,03 (H-8) và nhóm metoxy δ 3,89 (MeO- tín hiệu đơn của proton cạnh oxi ở δ 5,56 (H-4'), 7) cho thấy C-6 và C-7 của nhân cumarin bị thế. 4,05 (H-5'). Phổ 13C-, APT-NMR có tín hiệu của Phổ 13C và APT-NMR cho biết chất 2 có 16 hai nhóm CH ở δ 77,2 (C-4'), 63,5 (C-5'). Hai phổ nguyên tử cacbon, trong đó có 10 cacbon bậc này cũng cho biết chất 1 có 15 nguyên tử một, bậc ba và sáu cacbon bậc 2, bậc 4. Qua cacbon, trong đó có một nhóm CH3, bảy nhóm phân tích và so sánh với số liệu phổ đ\ công bố CH; 7 cacbon bậc bốn, trong đó có hai nhóm trong tài liệu [6] đ\ xác định đ−ợc cấu trúc của cacbonyl có c−ờng độ tín hiệu thấp ở vùng chất 2 là 6-O--D-glucopyranosit-7-metoxy-2H- tr−ờng thấp δ 172,3 (C-2') và 159,9 (C-2). Qua 1-benzopyran-2-on. Chất này lần đầu tiên đ−ợc phân tích số liệu phổ (bảng 1) và so sánh với số tách ra từ cây Magnolia macrophyla và có tên là liệu đ\ công bố trong tài liệu [4, 5] đ\ xác định magnoliosit [6]. Bảng 1: Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của chất 1, 2 [giá trị δ (ppm), J (Hz)] Vị trí 1, dung môi CDCl3 2, dung môi Py-d5 δH δC δH δC (300 MHz) (75,5 MHz) (500 MHz) (125,5 MHz) 2 159,9 161,1 3 6,32 d (9,6) 114,2 6,32 d (9,6) 109,8 4 7,67 d (9,6) 142,9 7,66 d (9,6) 143,7 5 7,38 s 127,6 7,50 s 114,0 6 120,2 147,0 7 160,4 151,2 179 8 6,88 s 99,8 7,03 s 101,8 9 156,6 150,0 10 112,4 112,9 1' 57,2 5,79 d (7,1) 104,1 2' 172,3 4,19 m 74,6 3' 4,39 m 79,1 4' 5,56 s 77,2 4,38 m 71,0 5' 4,05 s 63,5 4,38 m 78.4 6'a 4,53 dd 62,2 (12,1 và 2,2) 6'b 4,39 m CH3 1,68 s 11,2 OCH3 3,89 s 56,4 3,71 s 56,2 2' 3' OCH3 1 8 1' 4' HO O OCH3 HO 9 O 2 C OMe 7 A B 6' 5' 4 6 10 3 CH3O OCH3 CH3O 5 OCH3 OH O OR O 4:4R: R==HH 33 5:5R: R==CHCH3 Chất 3, 4 và 5 đều hấp thụ UV và có màu Phổ EI-MS của chất 4 có pic ion phân tử vàng đậm với thuốc thử vanilin/H2SO4, gợi ý cho m/z 374 (45) cho thấy flavonoit có hai nhóm thấy đây có thể là các flavonoit. Phổ 1H-NMR hidroxy và 4 nhóm metoxy. Pic cơ bản m/z 359 của ba chất đều có hai cặp dublet của hai cặp [M-15]+(100) và một số mảnh m/z 197 [A + proton thơm δ 8,1 (2H, d, J = 9 Hz, H-2'; H-6') COMe]+ (5), m/z 169 [A]+, 135 [C + CO]+ cho và 7,0 (2H, d, J = 9 Hz, H-3'; H-5'). Phổ 13C- thấy vòng A có hai nhóm hidroxy, hai nhóm NMR có hai tín hiệu đúp của bốn cacbon thơm metoxy và chỉ có một nhóm metoxy ở vòng C. ở δ 130 (CH ì 2) và 114 (CH ì 2), cho thấy Qua phân tích và so sánh với số liệu phổ đ\ vòng C có nhóm thế ở vị trí C-4'. Phổ khối phân công bố trong các tài liệu [8] và [9], đ\ xác giải cao (HR-EI-MS) cho công thức phân tử của định đ−ợc cấu trúc của chất 4 là 5,7-dihidroxy- chất 3 là C18H16O7 (m/z 344,0892); một số pic cơ 3,6,8,4'-tetrametoxyflavon. Chất này lần đầu + + bản m/z 329 [M-Me] (100), 311 [M-Me-H2O] tiên đ\ đ−ợc tách ra từ cây Ambrosia grayi [10]. và 135 cho thấy flavonoit có hai nhóm hidroxy Phổ 1H- 13C- và APT-NMR của chất 5 phù và ba nhóm metoxy [8]. Pic cơ bản m/z 329 [M- + hợp với chất 4 nh−ng có hơn một nhóm 15] (100) cho thấy vòng A có hai nhóm metoxy, đ−ợc thấy rõ qua pic ion phân tử m/z hidroxy, một nhóm metoxy và chỉ có một nhóm 388 ở phổ EI-MS. Qua phân tích phổ, so sánh metoxy ở vòng C, nh− vậy có một nhóm metoxy 1 với chất 4 và số liệu đ\ công bố trong tài liệu ở C-3. Phổ H-NMR có singulet của proton thơm [8, 10], đ\ xác định đ−ợc cấu trúc của chất 5 là δ 6,40 (H-8). Qua phân tích và so sánh với số 7-hidroxy-3,5,6,8,4'-pentametoxyflavon. liệu phổ đ\ công bố trong tài liệu [7], đ\ xác định đ−ợc cấu trúc của chất 3 là 5,7-dihidroxy- Chúng tôi xin chân th$nh cám ơn TS J. 3,6,4'-trimetoxyflavon. Schmidt (IPB, Halle/Saale, Germany) về việc 180 đo phổ khối, TS Trần Đình Đại (Viện Sinh thái P. 1025 - 1030 (1985). v$ T$i nguyên sinh vật, Viện Khoa học v$ Công 5. John A. Lamberton, J. R. Price, and A. H. nghệ Việt Nam) về việc xác định mẫu thực vật. Redclife. Australian Journal of Chemistry, Vol. 20, P. 973 (1967). T+i liệu tham khảo 6. M. Victor Plouvier, M. Lucien Plantefol. C. 1. Võ Văn Chi. Từ điển Cây thuốc Việt Nam, R. Hebd. Seances Acad. Sci. Ser. D 266, P. Nhà xuất Y học, Tp Hồ Chí Minh, Tr. 726 1526 (1968). (1999). 7. Christine A. Williams, Jeffrey B. Harbone, 2. Đỗ Tất Lợi. Những Cây thuốc và Vị thuốc Hans Geiger, and J. Robin S. Hoult. Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ Phytochemistry, Vol. 51, P. 417 - 423 (1999). thuật Hà Nội, Tr. 589 - 590 (1991). 8. Yong-Long Liu and A. Mabry. Phytochemis- 3. Christine Kamperdick, Nguyen Minh Phuong, try, Vol. 21, P. 209 - 214 (1982). Tran Van Sung, Juergen Schmidt, and 9. F. Tomas, F. Ferreres, and A. Guirado. Guenter Adam. Phytochemistry, Vol. 52, P. Phytochemistry, Vol. 18, P. 185 (1979). 1671 - 1676 (1999). 10. Herz W. Anderson, H. Wagner, G. Maver, 4. John A. Lamberton and Trevor C. Morton. G. Flore, and Farkas. Tetrahedron Letters, Australia Journal of Chemistry, Vol. 38, P. 2571 (1973). 181