Nghiên cứu thu nhận lipase trên bã đậu nành bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt từ chủng Rhizopus

Chương 1 GIỚI THIỆU Lipase là một trong những loại enzyme có giá trị thương mại rất cao bởi vì nó có khả năng xúc tác cho nhiều loại phản ứng đặc hiệu khác nhau. Cho đến ngày nay, loại enzyme này vẫn được xem là chất xúc tác linh động nhất. Tuy nhiên, phương pháp nuôi cấy để thu nhận lipase chủ yếu là phương pháp truyền thống – phương pháp nuôi cấy bề sâu. Ở Việt Nam, công nghệ enzyme chưa thật sự phát triển mạnh, nhưng nhu cầu về enzyme là rất lớn. Do đó, việc nghiên cứu và phát triển sản xuất enzyme tại Việt Nam là điều rất cần thiết. Hiện nay, phương pháp nuôi cấy bề mặt trên môi trường rắn đang dần thể hiện những ưu điểm so với phương pháp truyền thống khi thu nhận một số sản phẩm sinh học và trong đó có chế phẩm lipase từ vi sinh vật. Những ưu điểm như năng suất sinh tổng hợp enzyme cao, công nghệ đơn giản và chi phí đầu tư thấp đã làm cho phương pháp này rất thích hợp để phát triển tại Việt Nam. Vì vậy, việc nghiên cứu thu nhận lipase trên môi trường bã đậu nành bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt là mục tiêu cấp thiết của đề tài khoa học này. Chúng tôi muốn tận dụng nguồn phế liệu bã đậu nành để sản xuất ra một nguồn lợi lớn – chế phẩm lipase hoạt tính cao và ứng dụng phương pháp này vào quy mô sản xuất công nghiệp. Chương 2 Tổng quan Lipase và Phương pháp nuôi cấy bề mặt 2.1. ENZYME LIPASE 2.1.1. Giới thiệu Lipase (triacylglycerol acylhydrolase, EC 3.1.1.3) là enzyme tham gia quá trình xúc tác cho phản ứng thủy phân thuận nghịch triacylglycerol ở điều kiện bình thường. Lipase khác với enzyme esterase ở điểm chỉ thủy phân cơ chất không tan trong nước và hoạt tính được tăng cường khi ở bề mặt phân chia pha cơ chất – nước (interfacial activation). Vì vậy hoạt tính tối ưu của lipase chỉ được thể hiện trong hệ nhũ tương, khi đó thì diện tích bề mặt tiếp xúc giữa cơ chất và enzyme sẽ tăng lên rất nhiều. Ngoài ra, không những xúc tác cho hệ nhũ tương bình thường (dầu trong nước) lipase còn hoạt động mạnh ở những hệ nhũ là nước trong dầu và dầu hòa tan trong dung môi hữu cơ. Hơn thế nữa, lipase rất linh hoạt vì có thể xúc tác cho phản ứng chuyển hóa ester và tổng hợp ester đặc hiệu về cấu hình không gian với sự đa dạng về cơ chất phản ứng. Những tiến bộ quan trọng gần đây đã nghiên cứu về cấu trúc của tinh thể lipase để giúp chúng ta tìm hiểu sâu hơn về cơ chế xúc tác, hoạt tính bề mặt, tính đặc hiệu và bản chất của trung tâm hoạt động. Do đó việc ứng dụng lipase ngày càng trở nên đa dạng và đầy tiềm năng. 2.1.2. Nguồn thu nhận lipase 2.1.2.1. Lipase từ động vật [4-8] Lipase thu nhận từ những cơ quan, mô của một số loài động vật hữu nhũ đã được nghiên cứu rất nhiều, nhưng toàn diện hơn cả là lipase có nguồn gốc từ con người và một số lipase từ tuyến tụy. Những enzyme tuyến tụy này được tiết ra ở tá tràng xúc tác cho sự thủy phân triacylglycerol. Lipase tuyến tụy có thể thủy phân hoàn toàn triacylglycerol thành acid béo và glycerol. Bản chất của chúng là những glycoprotein, phân tử lượng 50kDa, không có hoặc ít hoạt tính đối với phospholipid và được hoạt hóa ở bề mặt phân chia pha dầu nước, nhưng lại bị ức chế bởi muối mật. Lipase của động vật hữu nhũ bền ở pH thấp, được hoạt hóa bởi muối mật và đặc hiệu tại vị trí sn-3 của cơ chất. Lipoprotein lipase người có chức năng thủy phân triacylglycerol trong chylomicron. Để có hoạt tính thì enzyme này kết hợp với apolipoprotein C-II để tạo thành dimer và được hoạt hóa bởi heparin. Tuy nhiên, lipase trong gan thực hiện chức năng chuyển hóa lipoprotein nhưng không liên kết với apoC-II. Lipase có trong sữa mẹ được hoạt hóa bởi muối mật để giúp trẻ sơ sinh tiêu hóa chất béo có trong sữa. 2.1.2.2. Lipase từ thực vật [9] Lipase từ thực vật không được chú ý nhiều so với những nguồn thu nhận khác. Tuy nhiên, gần đây loại enzyme này đã bắt đầu được quan tâm và nghiên cứu khá phổ biến. Trong đó, lipase từ những hạt có dầu là được quan tâm nhất. Những enzyme này nếu khác nhau từ nguồn nguyên liệu thu nhận thì tính đặc hiệu về cơ chất, pH tối ưu, khả năng phản ứng với sulfuhydryl, tính kỵ nước cũng khác nhau. Những enzym này có quan hệ mật thiết với triacylglycerol có trong bản thân hạt dầu đó và chỉ được tổng hợp trong quá trình nảy mầm của hạt. 2.1.2.3. Lipase từ vi sinh vật [10] Đây là nguồn enzyme được quan tâm và sản xuất nhiều nhất theo qui mô công nghiệp. Khác với thực vật và động vật, vi sinh vật được cấu tạo từ một tế bào, chính vì vậy mà nó có những ưu điểm hơn hẳn động vật và thực vật. Vi sinh vật có khả năng tổng hợp một lượng enzyme rất lớn trong một khoảng thời gian ngắn; hoạt tính của enzyme cao hơn hoạt tính của enzyme được tổng hợp từ động vật và thực vật; và ta hoàn toàn có thể điều khiển tốc độ sinh tổng hợp enzyme trong khi sản xuất. Lipase được thu nhận từ vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm men và nấm mốc là những enzyme ngoại bào có tính chất gần giống lipase tuyến tụy. Các loài nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp lipase như: Aspergillus spp., Mucor spp., Rhizopus spp., Penicillium spp., Geotrichum spp. Đối với nấm men gồm những loài: Torulopsis spp., Candida spp. Và vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp lipase bao gồm: Pseudomonas spp., Achromobacter spp., Staphylococcus spp. Bảng 2.1 – Các loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp lipase [10] 2.1.3. Cơ chế sinh tổng hợp lipase từ vi sinh vật [11-16] Giống như sự tổng hợp protein, lipase sẽ được hình thành khi trải qua các quá trình phiên mã, dịch mã và sau dịch mã. Tất cả các quá trình được thực hiện bên trong tế bào chất của vi sinh vật. Đầu tiên là sự phiên mã. Quá trình chỉ xảy ra khi đoạn gen tổng hợp nên lipase phải được hoạt hóa trước bằng chất cảm ứng. Chất này sẽ giúp giải phóng enzyme RNA polymerase thoát khỏi sự kìm hãm của chất ức chế bằng cách kết hợp với chính chất ức chế đó. Bản chất của chất cảm ứng chính là cơ chất chịu sự xúc tác của lipase. Kết thúc quá trình phiên mã diễn ra trong nhân tế bào sản phẩm sẽ là phân tử mRNA, nhưng phân tử này rất dễ bị thủy phân trong môi trường tế bào chất. Bên cạnh đó, những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy phân tử siRNA (short interference RNA) được hình thành trong quá trình phiên mã có tác động kìm hãm sự dịch mã hoặc thúc đẩy sự phân hủy những phân tử mRNA. Vì vậy số lượng enzyme được tổng hợp sẽ giảm đi đáng kể. Tiếp theo, quá trình dịch mã sẽ sử dụng tài liệu mã chứa trong phân tử mRNA để tạo thành mạch protein có thứ tự acid amin chính xác. Tuy nhiên, chuỗi polypeptide này rất dễ bị thủy phân bởi enzyme peptidase. Quá trình này cần một loại protein “chuyển giao” để tái sử dụng các acid amin của protein có cấu trúc gấp khúc (folded protein) mà không còn sử dụng được nữa. Khi những chuỗi polypeptide enzyme đã được tổng hợp khá nhiều thì những polypeptide ở gần nhau sẽ tương tác với nhau tạo thành cấu trúc gấp khúc làm cho khối enzyme trở nên không tan. Điều này đã làm cho enzyme mất đi hoạt tính sinh học. Quá trình này được điều khiển bởi chaperone, là một đoạn polypeptide có chức năng làm gấp khúc các enzyme trong nội bào trước khi những enzyme này được vận chuyển qua màng membrane. Đối với pre-pro-enzyme ngoại bào, là enzyme tổng hợp trong tế bào chất nhưng chưa có cấu trúc hoàn thiện, cấu trúc phân tử không được gấp khúc trong suốt quá trình vận chuyển qua màng membrane. Do đó, một số protein khác đã hỗ trợ enzyme ngoại bào này chống lại sự gấp khúc trong tế bào chất để không hình thành khối protein không tan và chống lại sự thủy phân nội bào. Hoạt tính của enzyme còn phụ thuộc vào cofactor là những ion kim loại. Sự cung cấp không đủ những ion này trong tế bào chất sẽ làm giảm đi hoạt tính của enzyme. Vì vậy phải đảm bảo nồng độ bão hòa các ion đối với enzyme phải thấp hơn nồng độ các ion đó trong tế bào chất. Đối với pre-pro-enzyme, khi không đủ cofactor để đảm bảo hoạt tính cũng như sự vận chuyển qua màng membrane thì một lượng enzyme này bị giữ lại trong tế bào chất làm ảnh hưởng hiệu suất sinh tổng hợp enzyme. Sau khi được vận chuyển qua màng membrane, enzyme ngoại bào vẫn có thể bị phân hủy bởi enzyme peptidase trong không gian chu chất. Trong giai đoạn này pro-enzyme, là enzyme ngoại bào trong không gian chu chất chưa có cấu trúc hoàn thiện, vẫn tiếp tục hoàn thiện cấu trúc của nó nhờ những phản ứng thủy phân. 2.1.4. Đặc điểm của lipase vi sinh vật [17,18] 2.1.4.1. Cấu trúc phân tử Lipase thu nhận từ vi sinh vật là nguồn enzyme đầy tiềm năng và được nghiên cứu một cách sâu rộng. Nhìn chung, lipase có cấu trúc a/b với vị trí trung tâm là lưới hỗn hợp b chứa bộ ba xúc tác và có cấu trúc xoắn ngăn cản cơ chất tiếp xúc trung tâm hoạt động. Rhizomucor miehei (Mucor miehei) sản xuất lipase ngoại bào có khả năng thủy phân rất nhiều cơ chất lipid khác nhau. Trong quá trình sinh tổng hợp, cấu trúc phân tử của enzyme được gắn thêm một đoạn peptide tín hiệu (signal peptide) và một đoạn propeptide bên cạnh mạch enzyme chính bao gồm 269 amino acid có phân tử lượng là 29.472 Dalton. Có hai dạng đồng phân của enzyme là dạng A (pI=3,9) và dạng B (pI=4,3) phụ thuộc mức độ deglycosylation trong quá trình sau dịch mã. Cấu trúc của lipase Rhizomucor miehei là cấu trúc dạng a/b gồm vùng lưới b trung tâm có tám dải b liên kết song song cuộn lên trên vùng xoắn lưỡng cực (N-terminal). Tất cả các cấu trúc xoắn đều nằm một bên lưới b. Ba liên kết disulfide trong phân tử lipase, Cys29-Cys268; Cys40-Cys43 và Cys235-Cys244 có tác dụng làm cho toàn bộ cấu trúc của enzyme được ổn định. Vùng trung tâm hoạt động của enzyme có chứa bộ ba xúc tác Ser144, His257 và Asp203 nhưng lại bị che phủ bởi phần không phân cực của cấu trúc xoắn lưỡng cực “lid”. “Lid” là một đoạn oligopeptide kỵ nước mà enzyme esterase không có. Chính vì điều này đã giúp lipase hấp phụ được trên bề mặt phân chia pha dầu-nước và sau đó diễn ra sự tái sắp xếp cấu trúc enzyme, đoạn phân tử “lid” sẽ cuộn vào trong để lộ vùng trung tâm hoạt động xúc tác thủy phân cơ chất. Vì thế, ta có thể nhận thấy rằng hoạt tính bề mặt của lipase chính là việc tạo thành cấu trúc bền vững trên bề mặt phân chia giữa hai pha dầu và nước. Lipase từ Geotrichum candidum cũng tồn tại dưới hai dạng đồng phân: dạng I (pI=4,56) và dạng II (pI= 4,46) có cùng chiều dài mạch là 544 amino acid, phân tử lượng 59.085 Dalton và có từ hai đến ba vị trí N-glycosylation tương ứng với từng dạng đồng phân. Tuy nhiên, lipase I và II được mã hóa bởi hai đoạn gen khác nhau. Cấu trúc của enzyme cũng có dạng a/b với lưới hỗn hợp b hình thành bởi 11 dải trong đó có 7 dải song song với nhau. Những cấu trúc cuộn xoắn liên kết với các dải đều nằm ở hai bên vùng lưới b. Hai liên kết disulfide được tìm thấy là Cys61-Cys105 và Cys276-Cys288. Bộ ba xúc tác là Ser217, His463 và Glu354 nằm trong vùng trung tâm hoạt động bị che khuất bởi hai cấu trúc xoắn a gần như song song với nhau. Một số cấu trúc phân tử của lipase thu nhận từ Candida rugosa, C. antarctica, Rhizopus delmar, Pseudomonas glumae và Ps. aeruginosa cũng được nghiên cứu. Song, sự khác biệt quan trọng về cấu trúc giữa lipase tuyến tụy và vi sinh vật chính là phần enzyme chứa đầu Carbon (C-terminal domain) được dùng để liên kết với colipase không có trong cấu trúc enzyme của vi sinh vật. Một điều cần phải lưu ý là không phải tất cả lipase đều có hoạt tính bề mặt. Ví dụ như lipase từ Pseudomonas aeruginosa thiếu cấu trúc xoắn “lid” bao phủ trung tâm hoạt động, do đó enzyme này không có hoạt tính bề mặt. Hình 2.1 – Cấu trúc tinh thể lipase Thermomyces lanuginose; lưới b, cấu trúc xoắn a, trung tâm hoạt động và đoạn phân tử “lid” được thể hiện tương ứng trong màu xanh, vàng, đỏ (sticks) và đỏ.  2.1.4.2. Hoạt tính bề mặt Nhờ vào kỹ thuật X quang mà cấu trúc tinh thể của một số lipase đã được xác định. Chúng ta biết rằng trong cấu trúc đó có một phân đoạn xoắn a, được gọi là “lid”, đã che lắp trung tâm hoạt động làm cho enzyme không thể có hoạt tính xúc tác trong dung dịch nước hoặc trong dung môi hữu cơ. Nhưng nếu trong dung dịch xuất hiện bề mặt phân chia pha giữa dầu và nước thì sự hấp phụ enzyme này lên bề mặt đó sẽ làm thay đổi hình dạng enzyme dẫn đến việc mở rộng cửa rào “lid” tạo điều kiện cho sự tiếp xúc cơ chất với trung tâm hoạt động. Hình 2.2 – Hoạt tính bề mặt của lipase: E, enzyme trong pha nước; Ea, enzyme hấp phụ trên bề mặt; Ea*, enzyme được hoạt hóa; S, cơ chất; Ea*S, phức enzyme cơ chất; Ea*Ac, acylenzyme; P1,P2 sản phẩm thủy phân. 2.1.4.3. Trung tâm hoạt động và cơ chế phản ứng thủy phân Trung tâm hoạt động của lipase là những phân tử acid amin có vị trí xác định trên toàn bộ cấu trúc phân tử enzyme, bao gồm bộ ba xúc tác Asp (có thể thay thế bằng Glu), His và Ser. Hình 2.3 – Trung tâm hoạt động lipase Thermomyces lanuginose, nguyên tử C màu xanh lá, O màu đỏ, N màu xanh dương, H màu trắng Phản ứng thủy phân được thực hiện nhờ bộ ba xúc tác Ser, His, Asp trải qua năm giai đoạn sau: Hình 2.4 – Cơ chế phản ứng thủy phân của lipase Enzyme kết hợp với cơ chất hình thành phức chất hoạt động. Nhóm chức hoạt động –OH của Serine tấn công vào gốc acyl của cơ chất tạo liên kết đồng hóa trị hình thành hợp chất trung gian. Giai đoạn này được hỗ trợ bởi hoạt tính xúc tác base của His trong bộ ba xúc tác. Tạo thành acyl enzyme và tách khỏi phản ứng oxy của liên kết ester (R1OH). Tách gốc acyl còn lại ra khỏi trung tâm hoạt động bởi nhóm chức hoạt động của His, có sự tham gia của phân tử nước và hình thành hợp chất trung gian có cấu trúc tứ diện. Giải phóng acid carboxylic (R2COOH). 2.1.4.4. Tính chất đặc hiệu Dựa vào tính đặc hiệu, lipase vi sinh vật có thể được phân thành ba nhóm. Nhóm đầu tiên bao gồm những enzyme không đặc hiệu với vị trí hoặc cấu trúc gốc acyl trên mạch triglyceride, ví dụ như lipase từ Candida cylindracea và Staphylococcus aureus. Nhóm thứ hai được xem là quan trọng nhất bao gồm những enzyme xúc tác đặc hiệu vị trí 1, 3 trên phân tử triacylglycerol, trong đó thông dụng là lipase từ Aspergillus niger, Rhizopus delemar, Mucor miehei và Pseudomonas fragi. Cuối cùng là nhóm thứ ba gồm những enzyme chỉ xúc tác đặc hiệu một số acid béo nhất định, ví dụ lipase từ Geotrichum candidum chỉ thủy phân acid béo mạch dài hoặc acid béo không no dạng cis-9. 2.1.4.5. Khả năng chịu nhiệt Khả năng chịu nhiệt của lipase có liên quan đến cấu trúc phân tử enzyme. Những yếu tố của môi trường như pH và ion kim loại sẽ ảnh hưởng và làm thay đổi cấu trúc của phân tử. Ngoài ra, sự đột biến gen trong quá trình hình thành đoạn “lid” cũng ảnh hưởng đáng kể đến khả năng chịu nhiệt của lipase. 2.1.4.6. Sự hoạt hóa enzyme Nguyên tố Ca có thể tăng cường hoạt tính thủy phân của lipase bằng cách hỗ trợ cho sự thay đổi hình dạng cấu trúc phân tử, tạo điều kiện dễ dàng cho sự hấp phụ enzyme và giảm lượng acid béo tạo thành trên bề mặt phân chia pha mà có thể gây ức chế phản ứng thủy phân. Sự hoạt hóa lipase ở tuyến tụy của người phụ thuộc rất nhiều vào cơ chất và sự có mặt của muối mật. Bên cạnh đó, sự ảnh hưởng Ca đến hoạt tính lipase vi sinh vật phụ thuộc loại enzyme và điều kiện thí nghiệm. Ví dụ, để tăng cường hoạt tính lipase C. rugosa ta có thể bổ sung muối Ca của acid béo tạo thành vào dung dịch đã được nhũ hóa nhưng chỉ đối với cơ chất là dầu olive không phải tributyrin. Tuy nhiên, Ca không có tác dụng đối với hệ nhũ tương nước trong dầu và nếu không sử dụng chất nhũ hóa thì Ca cũng không ảnh hưởng đến hoạt tính lipase C. rugosa nhưng lại tăng sự ức chế của acid mật. 2.1.4.7. Khả năng chịu lực cắt Phản ứng xúc tác bởi lipase được thực hiện trên bề mặt phân chia pha, do đó diện tích và “chất lượng” của vùng phản ứng có ảnh hưởng quan trọng đến tốc độ phản ứng. Kết hợp điều kiện khuấy trộn và sử dụng chất nhũ hóa sẽ làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất. Tuy nhiên, enzyme sẽ bị mất hoạt tính do cấu trúc không thể gấp khúc trên bề mặt phân chia pha khí-lỏng và lỏng-lỏng nếu sự chênh lêch lực liên kết giữa hai pha là rất lớn. Sự biến tính này tăng dần theo nhiệt độ và sự chuyển động hỗn loạn của dòng lưu chất. Nếu tốc độ khuấy trộn tăng thì sẽ tạo ra nhiều bọt khí trong hỗn hợp phản ứng, dẫn đến tốc độ biến tính của enzyme tăng lên. Việc bổ sung phụ gia polypropylene glycol vào trong hỗn hợp phản ứng sẽ làm giảm đáng kể sự biến tính enzyme. 2.1.5. Ứng dụng enzyme lipase [10] Lipase được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp chế biến dầu béo, thực phẩm, chất tẩy rửa, tổng hợp hóa chất và dược phẩm, sản xuất giấy và các loại mỹ phẩm. Ngoài ra, lipase còn được sử dụng để thúc đẩy phản ứng phân hủy chất thải dạng béo (fatty waste) và polyurethane. Một số những ứng dụng quan trọng của lipase được tổng hợp trong bảng 2.2. Phần lớn chế phẩm lipase được thu nhận từ vi khuẩn, nấm men và nấm mốc. Bảng 2.2– Ứng dụng của lipase trong công nghiệp [10] Ngành công nghiệp Phản ứng Sản phẩm hoặc ứng dụng Chất tẩy rửa Sữa và thực phẩm từ sữa Bánh kẹo Thức uống Nước sốt (Food Dressings) Thực phẩm dinh dưỡng Thịt cá Dầu béo Hóa chất Dược phẩm Mỹ phẩm Thuộc da Giấy Thủy phân chất béo Thủy phân chất béo sữa, làm chín phô mai, thay đổi thành phần bơ sữa Cải thiện mùi vị Tăng cường hương vị Cải thiện chất lượng Chuyển hóa ester Cải thiện mùi vị Chuyển hóa ester, thủy phân Phản ứng tổng hợp đặc hiệu Chuyển hóa ester, thủy phân Tổng hợp Thủy phân Thủy phân Loại vết dầu mỡ trên vải Tăng cường hợp chất tạo hương vị cho sữa, phô mai và bơ Kéo dài thời gian bảo quan Thức uống Mayonnaise, dressings, whippings Thực phẩm dinh dưỡng Sản phẩm thịt cá loại mỡ Bơ ca cao, margarine, acid béo, glycerol, mono và diglyceride Hợp chất vòng chiral, hóa chất Chất hỗ trợ tiêu hóa, trao đổi chất Chất nhũ hóa, chất làm ẩm Sa