Nghiên cứu tổng hợp đồng phân đối quang L-nateglinid

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 159 NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG L-NATEGLINID Phan Thanh Dũng*, Kyeong Ho Kim** TÓM TẮT Mục tiêu: Tổng hợp hợp chất đối quang L-nateglinid để làm chất đối chiếu, phục vụ cho công tác kiểm tra độ tinh khiết quang học của D-nateglinid, một dược chất được sử dụng trong điều trị bệnh đái tháo đường týp 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Xây dựng qui trình tổng hợp L-nateglinid từ L-phenylalanin và acid trans-4-isopropyl cyclohexylcarbonyl clorid. Sản phẩm tổng hợp sau đó được tinh chế bằng cách hòa tan trong methanol, loại tạp trong môi trường acid và kiềm, và kết tinh trong n-heptan. Độ tinh khiết của L- nateglinid được kiểm tra bằng cách đo điểm chảy, phổ IR, phổ 13C-NMR, năng suất quay cực, HPLC sử dụng cột sắc ký pha đảo và cột pha tĩnh bất đối. Kết quả: Đã tổng hợp được L-nateglinid với hiệu suất 26,2%, độ tinh khiết quang học 99,8%. Kết luận: Sản phẩm tổng hợp L-nateglinid có độ tinh khiết quang học cao, có thể được sử dụng làm chất đối chiếu để kiểm tra tạp đồng phân của D-nateglinid. Từ khóa: Natelinde, L-nateglinid, tiểu đường týp 2. ABSTRACT STUDY ON THE PREPARATION OF L-NATEGLINIDE Phan Thanh Dung, Kyeong Ho Kim * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 159 - 163 Objectives: The L-enantiomer can be introduced during the synthetic process, the bulk drug substance of nateglinide often contains minor amounts of the L-enantiomer as an impurity. This work presents a synthesis method of L-enantiomer for using as reference in monitoring the purity of the bulk drug substance in order to keep content of the L-enantiomer below approved limit. Method: The L-nateglinide was synthesized and determined by the chiral HPLC, achiral HPLC, optical rotation, NMR spectroscopy, infrared spectroscopy, and melting point measurement. Results: L-nateglinide was synthesized from reaction of trans-4-isopropyl cyclohexylcarbonyl chloride acid with L-phenylalanine. Purification of L-nateglinide by dissolving in methanol and then adjusting acid-base conditions to remove impurity. The product was finally crystallized from n-heptan. Conclusion: L-nateglinide was successfully synthesized with enantiopurity of 99.8%, yield of 26.2% Keywords: nateglinide, L-nateglinde, type 2 diabetes mellitus. ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay khoảng 73% thuốc sử dụng trên thế giới là dạng đồng phân quang học, trong đó khoảng 65% thuốc thuộc dạng đối quang(7). Trong công nghiệp Dược, việc sử dụng các nguyên liệu là đồng phân quang học ngày càng được quan tâm và phát triển rất mạnh bởi vì các đối quang thường khác nhau rõ rệt về tác dụng dược lý và độc tính(2,6). Nateglinid là một dẫn xuất của acid amin có tác dụng hạ đường huyết bằng cách kích thích bài tiết insulin từ tuyến tụy. Nateglinid được sử dụng cho những bệnh nhân đái tháo đường týp 2. Nateglinid có 2 đồng phân quang học, trong đó đồng phân D-nateglinid được sử dụng trong điều trị lâm sàng do có hiệu lực mạnh hơn đồng phân L-nateglinid. Trong quá trình tổng hợp **Khoa Dược Đại học Y Dược TP. HCM. **Đại học Quốc Gia Kangwon, South Korea. Tác giả liên lạc: TS. Phan Thanh Dũng ĐT: (84)-983-957-158; Email: dungpharm@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 160 nguyên liệu D-nateglinid, tạp đồng phân L- nateglinid cần phải được kiểm soát chặt chẽ(4,10). Hiện nay, chất đối chiếu L-nateglinid chưa được thương mại hóa. Vì vậy đề tài “Nghiên cứu tổng hợp đồng phân đối quang L-nateglinid” được thực hiện để làm chất đối chiếu L-nateglinid, phục vụ cho công tác kiểm tra độ tinh khiết quang học của D-nateglinid. Hình 1. Cấu trúc hóa học của (A) D-nateglinid và (B) L-nateglinid ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hóa chất dung môi Tất cả dung môi hóa chất đều đạt tiêu chuẩn phân tích: Nateglinid (99.8%): (Korea), cloroform-d 99.8 % D chứa 0.05% TMS (USA), L- phenylalanin, trans-4-isopropyl- cyclohexylcarbonyl clorid, acid trifluoroacetic (TFA., 99%), n-hexan, methanol, ethanol, acetonitril, KH2PO4, triethanolamin, NaOH, KOH, HCl, H3PO4, n-heptan (Japan). Trang thiết bị Hệ thống HPLC LC-10 ADvp Shimadzu, Cột sắc ký: Chiralcel AD-H (5 µm, 250 × 4.6 mm I.D) (Japan). Hệ thống HPLC Jasco PU-980, Cột sắc ký: RS tech ODS C18 (5 µm, 250 × 4.6 mm), Optimapak. Brucker DPX-400 (400.13 MHZ, Brucker, Germany), FTS 3000 MX Excalibur, USA, Fisher Scientific, Malaysia. Phương pháp nghiên cứu Điều chế và tinh khiết hóa L-nateglinide(9) l-phenylalanin NH2 O OH Cl + trans-4-isopropylcyclohexylcarbonylchlorid * C NH O CH HO2C H H3C H3C L-nateglinid - L-nateglinid sau khi tổng hợp được hòa tan trong methanol và kết tinh trong các môi trường acid và kiềm, sau cùng kết tinh trong n-heptan ở nhiệt độ sôi sau đó làm lạnh và lọc sẽ thu được L-nateglinid tinh khiết. Kiểm tra độ tinh khiết của L- nateglinid Đo điểm nóng chảy Đo trên máy Fisher Scientific, Malaysia. Microscope Cover Glass, Fisher brand. Đo phổ IR Trộn mẫu với KBr dập viên và đo trên máy FTS 3000 MX Excalibur, USA ở bước sóng từ 4000-400 cm−1, độ phân giải 4 cm−1. Phổ được xử lý bằng phần mềm Merlin, Version 1.3. Đo phổ 13 C-NMR Pha dung dịch có nồng độ 10 mg/mL trong dung môi là hỗn hợp cloroform-d 99.8% chứa 0.05% TMS. Đo trên máy Bruker DPX-400 (400.13 MHZ, Bruker, Germany) . A B KOH 10% pH: 13,7-14.8, t0= 150C HCl 35% Khuấy 66 0C qua đêm Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 161 HPLC phân tích L-nateglinide trên cột pha đảo(5) Cột sắc ký: RS tech ODS C18 (5 µm, 250 × 4.6 mm), Optimapak. Pha động: acetonitril -10 mM đệm KH2PO4 (pH 3.0) (70: 30, v/ v). Nhiệt độ cột phân tích: 20oC. Tốc độ dòng: 1 mL/phút, thể tích bơm mẫu: 20 µL, Bước sóng phát hiện: UV 210 nm. Kiểm tra độ tinh khiết quang hoạt của L- nateglinid HPLC phân tích L-nateglinid trên cột bất đối(8,11): Cột sắc ký: Chiralcel AD-H (5 µm, 250 × 4.6 mm I.D.), (Japan). Pha động: n- hexane-ethanol- TFA (75: 25: 0.1, v/ v/ v). Nhiệt độ cột phân tích: 20 oC. Tốc độ dòng: 1 mL/phút, thể tích bơm mẫu: 20 µL. Bước sóng phát hiện: UV 210 nm. Đo năng suất quay cực Đo trên máy HORIBA-SEPA 300, Japan. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết quả điều chế và tinh khiết hóa L-nateglinid Bảng 1. Kết quả điều chế và tinh khiết hóa L-nateglinid. Khối lượng (g) Tinh khiết (%) (HPLC) Hiệu suất (%) 0.56 99.78 26,2 % tinh khiết tính theo HPLC: %100 )()( )(% × −+− = enantiomerSSdinhenantiomerRSdinh enantiomerSdinhHPLC Kiểm tra độ tinh khiết của L-enantiomer Đo điểm nóng chảy: D-nateglinid: tnc: 139°C, L-nateglinid: tnc : 138.5°C. Nhiệt độ nóng chảy của L-nateglinid trùng với nhiệt độ nóng chảy của nateglinid. Sơ đồ 1: Điều chế L- nateglinid. + 0,13 g NaOH, + 3,7 g H2O + 8,34 ml MeOH + (HCl: H2O, 0,14 ml, 0,17 ml) Khuấy từ 10 phút 1,06 g L- nateglinid Dung dịch + từng giọt (HCl: H2O, 0,14 ml, 0,17 ml) ở 10-15oC, khuấy 30 phút Kết tủa Rửa với 8,3 ml H2O Sản phẩm thô Hòa tan với 21,7 ml MeOH + 25 ml H2O. Khuấy 20 phút. - Lọc, rửa tủa Hổn dịch + 16,7 ml n-heptane,đun sôi 1.5 h Làm lạnh, lọc, sấy ở 50oC 0,56 g L- nateglinid Sơ đồ 2: Tinh khiết hóa L- nateglinid. Lọc, Rửa với 4,2 ml MeOH :H2O (2:1) + 2,277 g trans-4-isopropyl- cyclohexylcarbonylchloride 1.5 h + 13,03 g H2O để yên 1.5 h 2.4 g L- phenylalanin + 15,5 g H2O, + 9,39 g KOH 10 % Dung dịch + 7,04 g acetone Hỗn hợp phản ứng + 7.18 g KOH 10 % - Duy trì pH từ 13.7-14.3 - Làm lạnh và duy trì ở 15 0C Sản phẩm acetyl hóa + 2,73 g H2O + 2,38 g acetone, 2,6 g HCl 35 % Trầm hiện kết tinh - Khuấy ở 66oC qua đêm 1,1 g Tinh thể L- nateglinid Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 162 Đo phổ IR Hình 3. Phổ IR của L-nateglinid và nateglinid Phổ IR của L-nateglinid tương tự phổ IR của D-nateglinid. Đo phổ 13C-NMR Hình 4. Phổ 13C-NMR của D-nateglinid, L- nateglinid, 400 MHZ. Phổ 13C-NMR của L-nateglinid và D- nateglinid tương tự nhau Bảng 2. Các đỉnh đặc trưng của D-nateglinid và L- nateglinid trong phổ 13C-NMR TT D- nateglinid δ (ppm) L-nateglinid δ (ppm) TT Nateglinid δ (ppm) L-nateglinid δ (ppm) 1 19,653 19,657 12 76,685 76,679 2 28,807 28,808 13 77,003 76,996 3 28,903 28,903 14 77,204 77,197 4 29,342 29,348 15 77,320 77,313 5 29,676 29,675 16 125,970 126,993 6 32,690 32,691 17 128,398 128,419 7 37,263 37,249 18 129,423 129,415 8 43,133 43,134 19 135,979 135,953 9 45,402 45,394 20 173,515 173,570 10 50,588 50,627 21 176,417 176,458 11 52,804 52,834 Kiểm tra độ tinh khiết (tạp chất liên quan) của L-nateglinid bằng HPLC trên cột pha đảo Hình 5. Sắc ký đồ : A. Mẫu trắng, B. 100 μg/mL nateglinid, C. 100 μg/mL L-nateglinid. Cột sắc ký: RS tech ODS C18 (5 μm, 250 × 4.6 mm), Optimapak. Độ tinh khiết sắc ký trên cột pha đảo là 99,78%. Kiểm tra độ tinh khiết quang học của L- nateglinid bằng phương pháp HPLC trên cột bất đối Bảng 3. Độ tinh khiết quang hoạt của L-nateglinid Khối lượng (g) Tinh khiết (%) (HPLC) Hiệu suất (%) 0,56 99,8 26,2 Hình 6. Sắc ký đồ : A. Mẫu trắng, B. 100 μg/mL D- nateglinid, C. 100 μg/mL L-nateglinid. D. L- nateglinid /L-nateglinid. Cột sắc ký:: AD-H column (5 μm, 250 × 4.6 mm). Độ tinh khiết sắc ký trên cột bất đối là 99.8%. Đo năng suất quay cực: D-nateglinid [ ] 020 4.9−=Dα (C= 1 mol /MeOH), L-nateglinid [ ] 020 4.9+=Dα (C= 1 mol/MeOH). A. L- nateglinid B. nateglinid (cm-1) A. L- nateglinid B. D-nateglinid B. D-nateglinid A. Mẫu trắng C. L-nateglinid B. D-nateglinid A. Mẫu trắng C. L-nateglinid D. L-nataglinid/nateglinid Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 163 KẾT LUẬN Bằng phản ứng amid hóa giữa L- phenylalanin và acid trans-4-isopropyl- cyclohexylcarbonyl clorid trong điều kiện môi trường kiềm và nhiệt độ dưới 15 0C đã điều chế được L-nateglinid, sau khi tinh chế loại tạp L- nateglinid được kiểm tra độ tinh khiết bằng các kỹ thuật hiện đại và mẫu L-nateglinid đạt độ tinh khiết quang học cao 99,78%, hiệu suất tổng hợp 26,2% cho phép làm chất đối chiếu để kiểm tạp đồng phân của nateglinid. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Collins A.N., Sheldrake G.N., Crosby J.C., In Industry, John Wiley, New York, (1994). 2. Drayer D.E., Pharmacodynamic and pharmacokinetic differences between drug enantiomers in humans: An overview. Clin. Pharmacol. Theor (1986), 40, 125. 3. ICH Harmonised Tripartite Guideline, International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, “Validation of Analytical Procedure Text and Methodology Q2 (R1)”, November 2005. 4. Keilson L., Mather S., Walter Y.H., Subramanian S., Mcleod J.F., Synergistic Effects of Nateglinide and Meal Administration on Insulin Secretion in Patients with Type 2 Diabetes Mellitus. J. Clin. Endocrinol. Metab (2000), 85, 1081. 5. Maddi S., Keshetty S., Mohan Ega C., Yamasani M.R., Scriba G.K., Development and validation of a stereoselective HPLC method for the determination of the in vitro transport of nateglinide enantiomers in rat intestine. J Sep Sci., 30 (12) (2007), 1875-1880 6. Maier N.M., Lindner W., Stereoselective Chromatographic Methods for Drug Analysis. Chirality in drug research, 2006. 7. Miller S., Office of New Drug Quality Assessment Center for Drug Evaluation and Research, FDA, 2006. 8. Qi M., Wang P., Sun Y., Li Y., Determination of the L- Enantiomer of Nateglinide in a Bulk Drug Substance by Chiral Reversed-Phase Liquid Chromatography. J. Liq. Chromatogr. Related Technol (2003), 26, 1839 9. Takahashi, United States Patent, Patent No: US 7,208,622 B2, Date of Patent: Apr 2007, 24. 10. Whitelaw D.C., Clark P.M., Smith J.M., Nattrass M., Effects of the new oral hypoglycaemic agent nateglinide on insulin secretion in Type 2 diabetes mellitus. Diabetes Med., (2000).17, 225 11. Yang G., Yin J., Li Z., Liu H., Cai L., Wang D., Chen Y., Chiral Separation of Nateglinide and its L Enantiomer on a Molecularly Imprinted Polymer-Based Stationary Phase. Chromatographia (2004), 59, 705-708.