Nghiên cứu xây dựng phương pháp chuẩn phân tích hoocmon clenbuterol trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký khối phổn (gc/ms)

Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ – 2008 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 1 BỘ CễNG THƯƠNG VIỆN CễNG NGHIỆP THỰC PHẨM ––––––––––––––––––––––––––––––– BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI R-D CẤP BỘ Tờn đề tài: “NGHIấN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP CHUẨN PHÂN TÍCH HOOCMON CLENBUTEROL TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC Kí KHỐI PHỔ (GC/MS” Chủ nhiệm Đề tài: PHẠM VĂN THÀNH 7313 23/4/2009 Hà Nội, 12-2008 Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ – 2008 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 2 Phần I: Tổng quan 1.1 Cơ sở pháp lý của đề tài : Đề tài thực hiện theo Hợp đồng nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ số 89.08.RD/HĐ-KHCN ký ngày 28 tháng 01 năm 2008 giữa Bộ Công Th−ơng và Viện Công nghiệp thực phẩm.(Phụ lục kèm theo). 1.2 Tính cấp thiết và mục tiêu nghiên cứu của đề tài.- Clenbuterol thuộc nhóm β- agonist, có công thức hóa học C12H18Cl2N2O đ−ợc sử dụng rộng rãi nh− là một chất tăng trọng, nó đ−ợc bổ sung vào thức ăn chăn nuôi (TĂCN) lợn, gà, bò....nhằm kích thích sinh tr−ởng, tăng tỷ lệ nạc, nhằm giảm chi phí thức ăn. Tuy nhiên, l−ợng Clenbuterol tồn d− trong vật nuôi có tác động xấu đến sức khoẻ con ng−ời nh−: làm rối loạn nhịp tim, run cơ, co thắt phế quản, phù nề, liệt cơ, tăng huyết áp. Các n−ớc Châu âu từ 1988 đã cấm đ−a Clenbuterol vào thức ăn chăn nuôi, Mỹ cấm năm 1991. ở Việt nam, từ năm 2002 theo quyết định số 54/QĐ-BNN của Bộ tr−ởng Bộ NN& PTNT ký ngày 20/06/2002 đã cấm sản xuất, nhập khẩu, l−u thông và sử dụng Clenbuterol trong sản xuất và kinh doanh thức ăn chăn nuôi. Mặc dù vậy, việc sử dụng Clenbuterol trộn vào thức ăn chăn nuôi ch−a phải đã hết do những mối “lợi” từ tác dụng của Clenbutarol đem lại. Những kết quả nghiên cứu của Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam cho thấy, trong 83 mẫu thức ăn hỗn hợp và đậm đặc của 12 công ty có 9 mẫu d−ơng tính ( chiém 10,8%). Kết quả thử nhanh trên 80 mẫu thịt có 05 mẫu d−ơng tính ( Chiếm 6,25%). Kết quả của Chi cục Thú y thành phố HCM cũng cho thấy, trong 334 mẫu khả nghi có tồn d− Clenbuterol cao thì có 52 mẫu d−ơng tính (chiếm 15.57%). Gần đây nhất, cuối năm 2006, đầu năm 2007 Cục Chăn nuôi đã cùng với các Sở NN-PTNN của 64 tỉnh, thành phố tổ chức lấy mẫu TĂCN tại các đại Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ – 2008 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 3 lý, các trang trại chăn nuôi và cơ sở sản xuất TĂCN để kiểm tra; đã nhận đựơc kết quả 114 mẫu phân tích có 19 mẫu d−ơng tính ( chiếm 6,4%). Rõ ràng, kiểm soát hàm l−ợng Clenbuterol trong thức ăn chăn nuôi và trong thực phẩm là việc phải làm th−ờng xuyên. Nhằm góp phần giải quyết yêu cầu cấp thiết của xã hội và công tác kiểm soát VSAT thực phẩm , chúng tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu xây dựng ph−ơng pháp chuẩn phân tích hocmon Clenbuterol trong thực phẩm bằng ph−ơng pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS) “. Mục tiêu của đề tài là : Xây dựng qui trình chuẩn để phân tích Clenbuterol trong các mẫu thực phẩm có độ chính xác cao bằng ph−ơng pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS). 1.3 Đối t−ợng, phạm vi và nội dung nghiên cứu. Từ đặc tính và mục đích sử dụng Clenbuterol, dễ dàng nhận thấy các sản phẩm thực phẩm có khả năng chứa d− l−ợng Clenbuterol không thể nào khác là thịt gia súc và các sản phẩm từ thịt. Tuy nhiên nguồn cung tạo d− l−ợng chất độc hại này lại xuất phát từ thức ăn chăn nuôi, vì vậy kiểm soát tận gốc để phòng ngừa và tránh rủi ro là rất cần thiết. Vì lý do đó, chúng tôi tiến hành xây dựng qui trình phân tích Clenbuterol bằng sắc ký khí khối phổ cho hai đối t−ợng là thức ăn chăn nuôi và thịt động vật. Những nội dung chính của đề tài nghiên cứu bao gồm : a. Nghiên cứu lựa chọn điều kiện tách, làm sạch và làm giàu mẫu Clenbuterol tách chiết từ mẫu. b. Xác định điều kỉện phân tích Clenbuterol trên máy GC/MS. c. Xác định hiệu suất thu hồi mẫu, khả năng phát hiện của ph−ơng pháp d. áp dung ph−ơng pháp đã xây dựng để khảo sát một số mẫu thịt và sản phẩm thực phẩm khác trên địa bàn Hà Nội; so sánh kết quả kiểm tra với một số phòng thí nghiệm khác. Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ – 2008 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 4 1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài n−ớc. 1.4.1 Nghiên cứu ứng dụng ph−ơng pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS). Sự kết hợp giữa ph−ơng pháp sắc ký và ph−ơng pháp khối phổ (GC/MS) tạo nên một ph−ơng pháp phân tích đặc biệt có hiệu quả trong lĩnh vực hoá phân tích. Hai thiết bị này có khả năng bổ sung và hỗ trợ cho nhau trong quá trình phân tích (GC: tách, MS: phát hiện), vì vậy ph−ơng pháp này đ−ợc sử dụng rất hữu hiệu cho quá trình khảo sát, định l−ợng các chất [13]. Hai kỹ thuật trên ghép nối với nhau có thể tách và định l−ợng các chất có nồng độ 10-8 gram hoặc nhỏ hơn nữa, đây là nồng độ rất khó phát hiện ở các ph−ơng pháp phân tích công cụ. Ngoài ra, với sự kết nối này, những mẫu không bền trong thời gian bảo quản cũng có thể đ−ợc phân tích một cách thuận lợi, đặc biệt là việc phân tích các hỗn hợp phức tạp. Nhờ đó, có thể tiết kiệm khá nhiều thời gian thực nghiệm vì phân lập mẫu theo nguyên tắc điều chế tr−ớc khi đ−a vào khối phổ do vậy giảm nhẹ yêu cầu kỹ thuật đối với các kỹ thuật viên. Sơ đồ hệ sắc ký khí khối phổ có thể mô tả tóm tắt nh− sau: Về cơ bản, thiết bị sắc ký sử dụng cột nhồi hoặc cột mao quản có thể ghép nối thiết bị khối phổ loại hội tụ chùm tia đơn hoặc kép [2], [17]. Có nhiều giải pháp kỹ thuật khác nhau để thực hiện việc ghép nối trong hệ thống. Với thiết bị hiện đại ngày nay toàn bộ dòng khí thoát ra (khí mang và mẫu) từ cột Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ – 2008 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 5 nhồi hoặc cột mao quản đ−ợc chuyển thẳng vào bộ phận chiết khí mang trung gian, sau đó đ−ợc đ−a trực tiếp vào nguồn ion hoá mẫu. Thiết bị chiết khí mang trung gian có thể có những cấu trúc khác nhau, nh−ng khi làm việc chúng phải tuân theo một nguyên lý chung là khuếch tán qua hệ thống lỗ xốp hoặc khếch tán trong một thiết bị tách khuếch tán phân tử. Sắc ký đồ đ−ợc ghi lại từ tín hiệu của dòng ion tổng cộng. Những sắc đồ thu đ−ợc từ tín hiệu dòng ion hoá và detector ion hoá ngọn lửa nói chung t−ơng tự nhau. Sắc ký khối phổ đã đ−ợc sử dụng rộng rãi, đặc biệt nó có thể giúp phát hiện các cấu tử trong hỗn hợp phức tạp. Nhiều cải tiến quan trọng đã đ−ợc áp dụng, đặc biệt trong phân tích các hợp chất sinh hoá. Ngoài ra các ch−ơng trình xử lý số liệu khi ghép nối với máy tính khiến quá trình phân tích trở nên đơn giản hơn và cho phép thu đ−ợc những kết quả đáng tin cậy. Phổ khối đ−ợc sử dụng nh− một detector đặc biệt, có độ nhạy cao. Trong tr−ờng hợp này, các thiết bị sẽ cho các giá trị số khối khác nhau và dòng ion đáp ứng đ−ợc tập hợp và ghi lại d−ới dạng một sắc đồ (phân mảnh khối). Quá trình này cho phép xác định đ−ợc cả các mẫu có nồng độ rất nhỏ (tới 10-10g). Về nguyên tắc hoạt động của detector khối phổ, khi cho một chất ở trạng thái khí va chạm với một dòng electron thì phân tử chất có thể bị tách ra một hoặc hai electron để trở thành các ion d−ơng mang điện tích 1 hoặc 2; cũng có thể quá trình va chạm này làm phân tử chất tiếp nhận thêm electron để trở thành ion âm, gọi là ion hoá phân tử. Khi va chạm mạnh hơn thì phân tử còn có thể bị phá vỡ ra thành nhiều phần khác nhau mang điện tích d−ơng hay âm. Sự phá vỡ này hoàn toàn phụ thuộc vào năng l−ợng va chạm, dẫn đến các cách phá vỡ phân tử khác nhau. Các ion này sẽ đ−ợc tách và đo khối l−ợng sau đó ghi trên sắc phổ đồ. Về kỹ thuật phân tích khối phổ phải tuân thủ các b−ớc gồm: Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ – 2008 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 6 Hoá khí chất mẫu: mẫu đ−ợc dẫn vào bình chứa, ở đó áp suất có thể giảm tới 10-6 mmHg, sau đó dòng khí này đ−ợc dẫn vào buồng ion hoá để sản ra các ion, l−ợng mẫu có thể ghi nhận đ−ợc rất nhỏ 10-13 g/giây. Ion hoá mẫu, có thể sử dụng các ph−ơng pháp: - Ion hoá nhờ các tia hay các phần tử mang năng l−ợng (electron, photon, hạt nhân). - Ion hoá nhờ điện tr−ờng mạnh. - Ion hoá nhờ sự phòng điện. - Ion hoá nhờ sự phòng điện. - Ion hoá nhờ sự đốt nóng (nguồn nhiệt Lazer). - Ion hoá nhờ t−ơng tác ion (ion hoá học). Trên thực tế hiện nay, ng−ời ta sử dụng ph−ơng pháp ion hoá qua sự va chạm electron. Ph−ơng pháp va chạm electron là dòng khí đ−ợc dẫn đi qua một dòng electron thẳng góc với nó, tuỳ thuộc năng l−ợng của dòng electron này lớn hay nhỏ mà các ion đ−ợc sản ra nhiều hay ít (nhìn chung năng l−ợng này khoảng 70ev). Tách các ion theo khối l−ợng, về nguyên tắc việc tách này dựa trên sự khác nhau về khối l−ợng của ion hơn là sự khác nhau về điện tích. Tr−ớc tiên ng−ời ta tăng tốc độ cho các ion, nhờ cho qua một điện tr−ờng mạnh, vận tốc của các ion đ−ợc tính theo công thức : m eUV 2= Trong đó : Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ – 2008 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 7 - e : Điện tích ion. - U : Thế tăng tốc. - m : Khối l−ợng. - V : Vận tốc. Tốc độ này ở trong máy phân tích đạt 100km/s. Sau khi tăng tốc, các ion đ−ợc bay qua một từ tr−ờng, đ−ờng bay của chúng sẽ bị lệch khác nhau do tác dụng của từ tr−ờng với bán kính lệch R đ−ợc tính theo công thức: m 2U R2 = ----- x------ e H2 Trong đó: - R : Bán kính lệch. - m: Khối l−ợng ion. - e: Điện tích ion. - H: C−ờng độ từ tr−ờng. Một −u điểm của sự kết hợp GC/MS là có thể đ−ợc áp dụng một cách hữu hiệu cho việc nghiên cứu và phân tích các chất đồng vị bền. Nhờ những −u điểm đó mà kỹ thuật phân tích GC/MS ngày càng đ−ợc ứng dụng rộng rãi, có thể kể ra một số ứng dụng phân tích sau: - Phân tích các hợp chất chứa nhóm sunfua: áp dụng trong việc kiểm soát ô nhiễm môi tr−ờng đặc biệt là ô nhiễm bẩn dầu trong n−ớc biển và ô nhiễm nguồn cung cấp thức ăn cho con ng−ời từ cá biển. Các hợp chất chứa sunfua có thể coi là th−ớc đo đánh giá sự ô nhiễm trong cá và cá hồi. Trong các nghiên cứu ng−ời ta nhận thấy C3H17 - naphtalen ở giá trị m/z 170 và C3H7 - banzothiophen ở giá trị m/z 176, alkyl benothiophen C10H10S m/z Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ – 2008 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 8 162 và alkyl naphtalen C12H12 m/z 160. Ng−ời ta cũng phát hiện ra 5 đồng phân của alkyl benzothiophen. - Phân tích các hợp chất hữu cơ có trong n−ớc ngầm: rất nhiều thực nghiệm đẫ đ−ợc tiến hành để phân tích l−ợng vết của các hợp chất hữu cơ tồn tại trong n−ớc. Khả năng ứng dụng của ph−ơng pháp sắc ký khí - khối phổ đối với việc định tính và định l−ợng các hợp chất hữu cơ độc hại trong các mẫu n−ớc thải sinh hoạt, n−ớc thải công nghiệp ngày càng nhiều. Tuy nhiên việc phân tích các hợp chất hữu cơ chứa trong n−ớc t−ơng đối khó khăn bởi chúng thay đổi rất nhanh và ở nồng độ rất nhỏ. Vì lý do đó đầu tiên ng−ời ta phải sử dụng khối phổ ký để cắt nhỏ các cấu tử, sau đó từ sắc ký khối phổ đồ này kết hợp với các ion mảnh đ−ợc thể hiện trên các pic, cùng số liệu thời gian l−u của cột để xác định thành phần và nồng độ của chúng. - Phân tích các cấu tử polyclorua: trong phân tích naphtalen clorua bằng sắc ký khí – khối phổ, ng−ời ta sử dụng ph−ơng pháp so sánh c−ờng độ pic (intensity matching method). Trong ph−ơng pháp này, các đồng phân tự nhiên của các thành phần chứa các nguyên tử clo hoặc brom trong phân tử cũng có thể đ−ợc xác định để khẳng định sự có mặt của hợp chất polyclorua - Phân tích nitrosamin: nitrosamin là một trong những chất gây ung th−, sự tồn tại của nó trong môi tr−ờng rất nguy hiểm đối với đời sống con ng−ời. Mức độ độc hại của nitrosamin rất cao, vì vậy nó thu hút đ−ợc sự chú ý của rất nhiều nhà khoa học. Có thể sử dụng nhiều ph−ơng pháp để xác định nitrosamin nh− GC, LC...Tuy nhiên đối với chất này thì GC/MS vẫn là ph−ơng pháp không thể thiếu vì sử dụng GC/MS ta có thể xác định đ−ợc cấu trúc hoá của các thành phần N- nitroso, đây là −u điểm lớn của ph−ơng pháp. Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ – 2008 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 9 - Ngoài các nghiên cứu, ứng dụng trên, hiện nay ph−ơng pháp GC/MS còn đ−ợc sử dụng rất nhiều trong phân tích d− l−ợng các chất bảo vệ thực vật, các chất kích thích, các hoá chất độc dễ bay hơi... ở trong n−ớc, việc tiếp cận với các kỹ thuật phân tích mới, đặc biệt là kỹ thuật sắc ký khá phổ biến từ khoảng những năm 90, đây là thời kỳ một số phòng thí nghiệm của các tr−ờng đại học, các Viện nghiên cứu đ−ợc trang bị các hệ thống sắc ký hiện đại. Với sắc ký khí khối phổ (GC/MS) tuy ch−a nhiều nh−ng bắt đầu có các nghiên cứu ứng dụng của các tr−ờng đại học nh− Đại học Khoa học Tự nhiên với nghiên cứu: “ Phân tích các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi trong n−ớc bằng ph−ơng pháp sắc ký khí khối phổ, dùng kỹ thuật lấy mẫu bay hơi”; “ Nghiên cứu xác định PANs trong khí thải nhà máy giấy Bãi Bằng”, của tác giả Phạm Hùng Việt và cộng sự; “Nghiên cứu xác định Chloramphenicol trong mẫu sinh học bằng ph−ơng pháp sắc ký khí – khối phổ”, của tác giả Vũ Công Sáu... tuy nhiên ch−a có công bố trong n−ớc nào về nghiên cứu ứng dụng GC/MS để xác định Clenbuterol trong thực phẩm. 1.4.2 Nghiên cứu xác định Clenbuterol. Clenbuterol, 4-amino – alpha- tert-butylaminomethyl – 3,5 – dichlorobenzyl alcohol, là một beta- agonist có công thức hóa học C12H18Cl2N2O; phân tử l−ợng 277,18 trong đó C: 52,00%, H: 6,54%, Cl: 25,58%, N: 10,11%, O: 5,77%. ở Việt Nam, hiện nay ph−ơng pháp xác định Clenbuterol chủ yếu dựa vào ph−ơng pháp Eliza, nh−ng ph−ơng pháp này cho độ tin cậy ch−a cao nên kết OH H NCl H2N Cl Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ – 2008 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 10 quả kiểm nghiệm đang còn gây nhiều tranh cãi. Để xác định hàm l−ợng Clenbuterol trong các mẫu TĂCN Bộ NN&PTNN đã phải gửi mẫu thử sang Singapore để kiểm tra. Việc làm này đã gây mất nhiều chi phí về tiền của và thời gian. Hiện nay, trên thế giới các ph−ơng pháp dùng phát hiện Clenbuterol gồm: ph−ơng pháp Eliza, Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), Sắc ký lỏng hiệu năng cao khối phổ (LC/MS), Sắc ký khí khối phổ (GC/MS )... trong các ph−ơng pháp nêu trên, ph−ơng pháp Eliza có −u điểm phát hiện nhanh, mang tính sàng lọc các mẫu thử nh−ng có độ tin cậy và độ chính xác không cao. Để định l−ợng chính xác hàm l−ợng Clebuterol, ng−ời ta th−ờng sử dụng ph−ơng pháp HPLC/MS hoặc GC/MS. Tuy nhiên ph−ơng pháp HPLC/MS có độ nhậy thấp hơn, chi phí đắt hơn so với ph−ơng pháp GC/MS; vì vậy xu h−ớng xác định d− l−ợng Clenbuterol bằng ph−ơng pháp GC/MS ngày càng đ−ợc quan tâm ở nhiều n−ớc. Theo các tạp chí phân tích chuyên ngành, những ph−ơng pháp phát hịên Clenbuterol và beta- agonists khác trong các mẫu sinh học đã đ−ợc công bố trên thế giới có thể thấy: những ph−ơng pháp này phát hiện ở nhiều mức độ khác nhau, từ ph−ơng pháp miễn dịch enzyme (EIA- enzyme immunoassays), sắc ký bản mỏng (TLC- thin layer chromatography) tới sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC- high performance liquid chromatography) và sắc ký khí khối phổ (GC/MS – gas chromatography- mass spectrometry) [9]. (Girault and Fourtillan, 1990; Blanchflower et. al., 1993; Wilson et. al., 1994; Kingston et al., 1995; Batjoens et al., 1996; Gigosos et al, 1996; Abou- Basha and Aboul- Enen, 1996; Sangiorgi and Curatolo, 1997). Do có sự trùng hợp về các phản ứng của beta- agonists và một số steroit, các ph−ơng pháp EIA và RIA (radio immunoassay) không xác định đầy đủ, chính xác sự hiện diện của các beta- agonists trong các mẫu sinh học; do đó cần thiết phải sử dụng ph−ơng pháp có tính đặc hiệu cao. HPLC và GC đáp ứng đ−ợc điều này nh−ng lại không xác Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ – 2008 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 11 định đ−ợc cấu trúc và các thông tin đầy đủ để khẳng định chắc chắn Clenbuterol. Khắc phục thiếu sót này, một kỹ thuật có độ nhạy, sự chọn lọc, phát hiện cao có thể khẳng định kết quả đó là ph−ơng pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS- gas chromatography- mass spectrometry). Việc nghiên cứu ứng dụng ph−ơng pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS) để phân tích và định l−ợng Clenbuterol đã đ−ợc nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm ngay từ khoảng những năm 1993 – 1996 (Blanchflower et al., 1993; Garcia- Regueiro et. al., 1993; Kingston et. al., 1995; Batijoens et. al., 1996). Ngoài ra cũng đã có những công bố về nghiên cứu ứng dụng GC-MS-MS để xác định Clenbuterol nh−ng ch−a nhiều. Một h−ớng khác là ứng dụng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) để xác định Clenbuterol cũng đã đ−ợc quan tâm. Tác giả E. Ciranni Signoretti, C. D’Arpino và F. Latorre đã nghiên cứu phát hiện Clen buterol trong n−ớc ngọt (Journal of Chromatography, 473; 301-304) [5]. ở Trung quốc, ít khi có việc vi phạm pháp luật khi sử dụng Clenbuterol vào thức ăn chăn nuôi vì th−ờng đ−ợc thay thế bằng Ractopamine. Tuy nhiên việc kiểm soát đồng thời cả Ractopamine và Clenbuterol trong thức ăn chăn nuôi đ−ợc các cơ quan chức năng của Chính phủ quản lý nghiêm ngặt. Việc phát hiện Clenbuterol và Ractopamine hyđrochlorie trong thức ăn chăn nuôi và thịt động vật đ−ợc sử dụng ph−ơng pháp HPLC với detector điện hoá (Turberg et. al., 1994), khả năng phát hiện là 1mg/kg. Năm 2005, Zhang và cộng sự đã phát triển ph−ơng pháp, sử dụng detector huỳnh quang để phát hiện Ractopamine trong thức ăn chăn nuôi. Với nghiên cứu này tác giả đã đ−a giới hạn phát hiện lên 0,5 mg/kg. Khi sử dụng kỹ thuật LC-UV để phát hiện Clenbuterol, Chang có thể tìm ra Clenbuterol ở giới hạn 0,05 mg/kg. Ngoài các nghiên cứu trên, một và tác giả trên thế giới còn sử dụng ph−ơng pháp Sắc ký khí – quang phổ hồng ngoại chuyển hoá fourier để khẳng định sự Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ – 2008 ------------------------------------------------------------------------------------------------ 12 có mặt của các beta- agonists trong mẫu (T.Visser, M J Vredenbreg and A.PJM Jong), các công bố này cho thấy khi sử dụng kỹ thuật này khả năng phát hiện các beta – agonists khá cao [22]. Ngoài các nghiên cứu lựa chọn các ph−ơng pháp để phát hiện Clenbuterol nói riêng, các beta- agonists nói chung, các nhà khoa học trên thế giới (Milagro Reig, Natalia Batlle, Jose Luis navarro, Fidel Toldra) cũng rất quan tâm đến các nghiên cứu làm ổn định chúng trong quá trình phân tích [16]. Chiết tách, xử lý và làm sạch mẫu luôn là vấn đề quan tâm đối với các nhà phân tích. Trong nghiên cứu xác định d− l−ợng Clenbuterol, một số tác giả đã đề cập đến xử lý mẫu n−ớc tiểu bằng chiết pha rắn (SPE) ( Christin Berggren, Sami Bayoudh, David Sherington, Kees Ensing – Department of Analytical Chemistry and Toxicology, University Centre for Pharmacy, Antonius Deusinglaan 1, 9713 AV Groningen, Netherlands; Department of Pure and Applied Chemistry, University of Strathclyde), hay trong các mẫu thức ăn gia súc và chế phẩm sinh học (Gianfranco Brambilla, Maurizio Fiori, Barbara Rizzo, Vittorio Crescenzi, Giancarlo Masci- laboratorio Medicina Veterinaria, Viale Regina Elena 299, 1-00161 Rome, Italy; Department of Chemistry, University of Rome, Italy). Các nghiên cứu này đều cho thấy khi sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn (SPE), các mẫu phân tích đ−ợc làm sạch và làm giầu lên rất nhiều [4]. 1.5 Các ph−ơng pháp xác định Clenbuterol: Hiện nay các ph−ơng pháp cơ bản đ−ợc sử dụng để xác định d− l−ợng Clenbuterol gồm có: ph−ơng pháp EIA, ph−ơng pháp H