Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu nấm linh chi

23 CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu Nấm Linh chi Việt Nam (LCVN), Linh chi đỏ sậm (LCĐS) (Ganoderma lucidum), Vân chi nâu (VCN), Vân chi vàng (VCV) (Trametes versicolor) được cung cấp bởi ThS. Cổ Đức Trọng, Trung tâm Nghiên cứu Linh chi và Nấm dược liệu. Dược liệu được xay nhỏ, bảo quản nơi khô mát. Các mẫu thử được chiết từ bột nấm. Cao cồn được chuẩn bị bằng cách chiết hồi lưu Soxhlet bột nguyên liệu với cồn 96 % theo tỷ lệ 1 : 15 (dược liệu : dung môi), dịch chiết được cô giảm áp thu được cao cồn với hiệu suất chiết theo bảng 2.1. Cao nước được chuẩn bị bằng cách đun nguyên liệu 3 lần với nước nóng, mỗi lần trong 1 giờ ở 100°C theo tỷ lệ 1 : 15 (dược liệu : dung môi), dịch chiết được cô cách thủy thu được cao nước với hiệu suất chiết theo bảng 2.1. Bảng 2.1. Hiệu suất chiết các cao của các nấm dược liệu Nấm dược liệu Cao Hiệu suất (%) Cao cồn 8,2 Linh chi Việt Nam Cao nước 4,8 Cao cồn 5,4 Linh chi đỏ sậm Cao nước 8,8 Cao cồn 6,6 Vân chi vàng Cao nước 11,8 Cao cồn 8,4 Vân chi nâu Cao nước 11,2 24 2.1.2 Động vật nghiên cứu Chuột nhắt trắng đực, Mus musculus var Albino, 5 - 6 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 20 ± 2 g, được cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế – TP. Nha Trang và được để ổn định ít nhất một tuần trước khi thử nghiệm. Chuột được nuôi đầy đủ bằng thực phẩm viên, giá, rau xà lách và nước uống đầy đủ. Thể tích cho uống hay tiêm là 10 ml/kg thể trọng chuột. 2.1.3 Hóa chất Endoxan® 500 mg: chứa thành phần hoạt chất: 534,5 mg cyclophosphamid momohydrat tương ứng với 500 mg cyclophosphamid khan (ký hiệu CY), Baxter Oncology GmbH, Germany. Lô sản xuất 8K593E, sản xuất 11/2008, hạn dùng 11/2011. Methanol (MeOH). 1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl (DPPH). Trolox (Calbiochem Ltd. Co.). Acid ascorbic (Merck Co. Germany). Malonyl dialdehyd (MDA) (Merck Co. Germany) Đệm Phosphat (PBS) Dung dịch Dimethylsulfoside (DMSO) (Merck ) Kali clorid 1,15% (KCl). Natri clorid 0,9% (NaCl). Đệm Tris-HCl (Merck Co. Germany). Acid tricloacetic (TCA). Acid thiobarbituric (TBA) (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan). Các dung môi và thuốc thử thông thường khác 25 2.1.4 Máy móc-Thiết bị Tủ sấy Memmert (Germany). Cân kĩ thuật Mettler Toledo AB204. Máy cô giảm áp Buchi waterbath B-480. Máy siêu âm Bransonic ultrasonic cleaner. Đèn soi UV Desaga. Máy đo pH Meter Schott. Thiết bị nghiền đồng thể (KA Works, Asia Sdn. Bhđ, Malaysia). Máy ổn nhiệt hiệu Desconectar. Máy ly tâm lạnh Sartorius (Germany). Máy đo quang phổ tử ngoại khả kiến Unicam, HE λ 10 SY vision 32 Software, thermo Spectrorius. Máy phân tích huyết học tự động Abbott Cell-Dyn 3700 2.2. Khảo sát thực vật 2.2.1. Khảo sát hình thái bên ngoài Quan sát dược liệu bằng mắt thường, mô tả đặc điểm hình thái quả thể: hình dạng, màu sắc, kích thước, mặt trên, mặt dưới. 2.2.2. Khảo sát vi học 2.2.2.1. Khảo sát bột dược liệu Quan sát bột bằng cảm quan. Soi bột: dược liệu được cắt nhỏ, sấy ở nhiệt độ khoảng 60 0C, tán nhỏ, nghiền nát, soi trong dung dịch KOH bằng kính hiển vi, chụp hình. 26 2.2.2.2. Khảo sát vi phẫu Tiến hành cắt vi phẫu, soi dưới kính hiển vi và chụp hình 2.3. Thử tinh khiết [3] 2.3.1. Xác định độ mất khối lượng do làm khô Đĩa nhôm đựng mẫu được sấy khô đến khối lượng không đổi ở 105 °C. Cân chính xác 2 g bột dược liệu trên đĩa, đem sấy ở 105 °C khoảng 8 giờ đến khối lượng không đổi. Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm khoảng 15 phút. Cân và ghi lại kết quả. Tiếp tục sấy và cân lại như trên vài lần đến khi nào kết quả hai lần cân liên tiếp chênh lệch nhau không quá 0,5 mg. Thực hiện trên 3 mẫu và lấy giá trị trung bình. Công thức xác định độ ẩm : X: tỉ lệ độ ẩm dược liệu (%) a: khối lượng bột dược liệu hay khối lượng cao trước lúc sấy b: khối lượng bột dược liệu hay khối lượng cao sau khi sấy khô đến khối lượng không đổi 2.3.2. Độ tro 2.3.2.1. Tro toàn phần Tro toàn phần là lượng tro còn lại sau khi nung một dược liệu. Các ion trong tro toàn phần ở dưới dạng carbonat hay oxid. Cách tiến hành: Cân chính xác 1 g nguyên liệu cho vào chén nung đã nung đến khối lượng không đổi. Trải đều dược liệu ở đáy chén và đốt trên bếp điện cho đến khi dược liệu cháy hoàn toàn và chén không còn bốc khói. X = a - b a ° 100 27 Đặt chén vào lò nung ở 300 - 600 °C cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro không còn màu đen). Dùng kẹp sắt lấy chén nung ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút ẩm. Cân và ghi kết quả. Đặt chén tro vào lò nung tiếp tục nung ở nhiệt độ trên trong 1 giờ và đem ra cân. Tiếp tục làm như vật cho đến khi nào kết quả hai lần cân liên tiếp chênh lệch nhau không quá 0,5 mg. Tính kết quả : G: Trọng lượng chén nung (g) G1: Trọng lượng chén nung và mẫu thử (g) G2: Trọng lượng chén và tro trắng sau khi đã nung và cân đến trọng lượng không đổi (g) X : Tỉ lệ độ ẩm dược liệu (%) 2.3.2.2. Tro không tan trong acid Cách tiến hành Hòa tan tro toàn phần ở trên vào 25 ml HCl 4N, đun cách thủy trong 10 - 15 phút. Thành phần tro không tan được lọc trên giấy lọc không tro. Rửa cả lọc và tro bằng nước cất nóng đến khi dịch lọc cho phản ứng trung tính (thử bằng giấy quỳ). Sau đó đem giấy lọc chứa chất không tan trong HCl cho vào chén nung để nung trên bếp điện đến khi thấy không còn khói trắng bay lên. Tiếp tục đưa vào lò nung và thực hiện như cách tiến hành của tro toàn phần. Tính kết quả: Tro không tan trong acid (%) = 100)( 12 ×− m mm m1 : Khối lượng chén nung (g) m2 : Khối lượng chén nung và tro không tan trong HCl (g) m : Khối lượng mẫu thử (g) Tro toàn phần (%) = G2 - G (G1 - G)(1-X) ° 100 28 2.4. Phân tích sơ bộ thành phần hoá thực vật [3] 2.4.1. Nguyên tắc Quy trình dùng để xác định nhanh một số nhóm hợp chất thường gặp trong nguyên liệu thực vật bằng các phản ứng hóa học (thường được gọi là phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật) dựa trên nguyên tắc: phân tách hỗn hợp các chất trong nguyên liệu thành 3 phân đoạn đơn giản dựa theo độ phân cực tăng dần: kém phân cực, phân cực trung bình và phân cực mạnh bằng cách chiết nguyên liệu lần lượt qua các dung môi: ether ethylic, ethanol, và nước, dùng các phản ứng hóa học đặc trưng (thường là các phản ứng kết tủa, phản ứng màu) để phát hiện các nhóm hợp chất có trong dịch chiết. Tiến hành phân tích theo quy trình phân tích thành phần hóa thực vật của Bộ môn Dược liệu – Khoa Dược – Trường Đại học Y Dược TP.HCM dựa trên cơ sở quy trình phân tích của Ciuley (Trường Đại học Dược khoa Rumani) có sửa đổi. 2.4.2. Chiết xuất Cân khoảng 10 g dược liệu và chiết lần lượt qua các dung môi ether ethylic, ethanol 96 %, nước cất, lượng dịch chiết của mỗi loại cô còn khoảng 50 ml để định tính. 29 Sơ đồ 2.1. Tóm tắt quy trình chiết xuất trong phân tích thành phần hóa thực vật 2.4.3. Định tính bằng phản ứng hoá học Bã dược liệu Dịch chiết ether Bã dược liệu Dịch chiết cồn Ether ethylic/ soxhlet Ethanol hồi lưu Bã dược liệu Dịch chiết nước Nước/ cách thủy Dược liệu Bảng 2.2. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật Dược liệu Chiết bằng ether Bã dược liệu Chiết bằng cồn Chiết bằng Dịch nước Bã dược liệu Dịch ether Dịch cồn Acid béo Mờ giấy lọc Tinh dầu Cắn có mùi thơm Carotenoid Phản ứng Carr-Price Tritepenoid tự do Phản ứng Liebermann-Burchard Coumarin Phát huỳnh quang/ OH- Alkaloid Thuốc thử chung Anthraquinon Phản ứng Bornträger Flavonoid Phản ứng Cyanidin Alkaloid Thuốc thử chung Coumarin Phát huỳnh quang/ OH- Glycosid tim Thuốc thử Raymond-Marthoud, xanthydrol Flavonoid γ–pyron Phản ứng Cyanidin Anthocyanidin HCl đđ Proanthocyanidin HCl/t0 Æ tủa đỏ Tannin FeCl3 5%, gelatin muối Saponin Phản ứng Liebermann-Burchard và tính tạo bọt trong nước Acid hữu cơ Na2CO3 Æ sủi bọt Hợp chất khử Thuốc thử Fehling Alkaloid Thuốc thử chung Glycosid tim Thuốc thử Raymond-Marthoud, xanthydrol Flavonoid γ–pyron Phản ứng Cyanidin Anthocyanidin HCl đđ Proanthocyanidin HCl/t0 Æ tủa đỏ Tannin FeCl3 5%, gelatin muối Saponin Phản ứng Liebermann-Burchard và tính tạo bọt trong nước Acid hữu cơ Na2CO3 Æ sủi bọt Hợp chất khử Thuốc thử Fehling Polyuronic Pha loãng trong cồn Æ tủa 30 31 NO2 NO2 N NO2 N 2.5. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in vitro [13] 2.5.1. Khảo sát hoạt tính chống oxy hoá in vitro bằng thử nghiệm DPPH (test DPPH) 2.5.1.1. Nguyên tắc Các chất nghiên cứu có tác dụng chống oxy hóa sẽ làm giảm màu của 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Xác định khả năng này bằng cách đo quang ở bước sóng có hấp thu cực đại tại λ = 515 nm. Hình 2.1. Công thức DPPH 2.5.1.2. Tiến hành Pha dung dịch DPPH 0,6 mM trong methanol (MeOH). Các mẫu thử cao cồn và cao nước được tiến hành nghiên cứu ở 7 nồng độ: 2000 µg/ml, 1500 µg/ml, 1000 µg/ml, 500 µg/ml, 100 µg/ml, 50 µg/ml, 10 µg/ml (các mẫu pha trong dd DMSO). 0,5 ml mẫu thử ở các nồng độ khảo sát được cho phản ứng với 0,5 ml dung dịch DPPH. Thêm MeOH vừa đủ 4 ml. Hỗn hợp sau khi pha được để ở nhiệt độ phòng 30 phút. Đo quang ở bước sóng λ = 515 nm. Acid ascorbic (Merck, Germany) được sử dụng làm chất đối chiếu. 32 2.5.2. Khảo sát hoạt tính chống oxy hoá in vitro bằng thử nghiệm malonyl dialdehyd (MDA test) 2.5.2.1. Nguyên tắc Xác định khả năng ức chế peroxy hoá lipid thông qua việc xác định hàm lượng MDA theo phương pháp của E.A.Makarova, 1989; Robak và cộng sự, 1988. MDA được sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid, khi cho phản ứng với acid thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử acid thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm. Phản ứng thực hiện ở môi trường pH 2 - 3, ở nhiệt độ 90 - 100 0C trong vòng 10 - 15 phút. Đo cường độ màu của phức suy ra lượng MDA có trong mẫu. Phương trình phản ứng như sau: Hình 2.2. Phương trình tạo phức màu giữa MDA và acid thiobarbituric 2.5.2.2. Cách tiến hành Pha thuốc thử TBA 0,8 %. Mỗi mẫu thử cao cồn và cao nước được tiến hành nghiên cứu ở 7 nồng độ: 2000 µg/ml, 1500 µg/ml, 1000 µg/ml, 500 µg/ml, 100 µg/ml, 50 µg/ml, 10 µg/ml (các mẫu pha trong dd DMSO). Tách não chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm phosphat 5 mM theo tỉ lệ 1 : 10 (não : dung dịch đệm) ở nhiệt độ 0 - 5 0C. Lấy 0,5 ml dịch đồng thể, 33 thêm vào 0,1 ml các nồng độ mẫu thử và 1,4 ml đệm phosphat, ủ ở 37 0C trong 15 phút. Kết thúc phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10%, ly tâm 10000 vòng/phút, lấy 2 ml dịch trong cho phản ứng với 1 ml acid thiobarbituric 0,8% ở 1000C trong 15 phút và đo màu ở λ = 532 nm. Trolox (Calbiochem Ltd. Co.), đồng phân của vitamin E được sử dụng làm chất đối chiếu. 2.5.3. Tính kết quả Hoạt tính chống oxy hóa HTCO (%) được tính theo công thức: HTCO (%) = [(ODChứng - ODThử) / ODChứng] × 100 ODchứng: mật độ quang của dung môi DMSO ODthử: mật độ quang của mẫu thử 2.6. Nghiên cứu in vivo 2.6.1. Gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophophamid (CY) [11], [24] 2.6.1.1. Nguyên tắc Cyclophosphamid là một chất gây ức chế miễn dịch được sử dụng phổ biến trong hóa trị liệu ung thư trên lâm sàng và là một chất gây độc ức chế các chỉ tiêu liên quan đến chức năng miễn dịch trong các nghiên cứu thực nghiệm trên động vật. Ngoài ra, cyclophosphamid còn thể hiện tác dụng phụ trên các cơ quan khác như gan, thận, tiêu hóa, tiết niệu,... Gan được xem là hàng rào chắn của cơ thể, ngăn các sản phẩm độc hại thâm nhập vào qua đường tiêu hóa, đồng thời làm giảm độc tính và thải trừ một số chất cặn bã do chuyển hóa trong cơ thể tạo nên. Trong quá trình chuyển hóa ở gan, cyclophosphamid được biến đổi thành những chất có khả năng gây độc, làm gia tăng quá trình peroxy hóa lipid tại gan. 2.6.1.2. Cách tiến hành Chuột thí nghiệm được chia thành hai nhóm: nhóm chuột bình thường CY(-) và nhóm bị gây suy giảm miễn dịch [CY(+), tiêm phúc mô liều duy nhất Endoxan® 34 hòa tan trong nước muối sinh lý với liều tương đương cyclophosphamid 150 mg/kg thể trọng]. Các lô thí nghiệm được bố trí theo bảng 2.3. Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm Nhóm Lô (N = 10-12) Tiêm phúc mạc CY (i.p.) Mẫu thử Uống Chứng - Nước cất CY(-) Thử - Cao Chứng 150mg/kg Cao CY(+) Thử 150mg/kg Nước cất CY: cyclophosphamid Bảng 2.4. Liều tương đương với 5 g dược liệu/kg thể trọng cho các cao thử nghiệm Nấm Linh chi Việt Nam Linh chi đỏ sậm Vân chi vàng Vân chi nâu Cao C.nước C.Cồn C.nước C.cồn C.nước C.cồn C.nước C.cồn Liều uống (g/kg) 0,44 0,41 0,24 0,27 0,56 0,42 0,59 0,33 2.6.2. Khảo sát trọng lượng cơ thể trên chuột nhắt trắng bị gây suy giảm miễn dịch bằng CY Tiến hành cân trọng lượng cơ thể chuột trước khi tiêm CY và sau 5 ngày, 10 ngày ở cả 2 nhóm bình thường và nhóm gây suy giảm miễn dịch. 2.6.3. Khảo sát huyết học trên chuột nhắt trắng bị gây suy giảm miễn dịch bằng CY Tiến hành lấy máu đuôi chuột sau 5 ngày và 10 ngày ở các nhóm chuột. Máu chuột được kiểm tra huyết học tại Bệnh viện Bình Dân bằng hệ thống phân tích huyết học tự động Abbott Cell-Dyn 3700. 35 2.6.4. Khảo sát trọng lượng tương đối của các cơ quan trên chuột nhắt trắng bị gây suy giảm miễn dịch bằng CY Sau 10 ngày, chuột ở hai nhóm bình thường và nhóm gây suy giảm miễn dịch được tách lấy gan, lách, tuyến ức, tuyến thượng thận để xác định trọng lượng tương đối của các cơ quan bằng công thức sau: g % = Pcq /Pct * 100 Pcq: trọng lượng của cơ quan Pct: trọng lượng cơ thể chuột tại thời điểm khảo sát 2.6.5. Khảo sát hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA) trong gan sau khi gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid Sơ đồ 2.2. Khảo sát hàm lượng MDA trong gan sau khi tiêm cyclophosphamid Định lượng hàm lượng MDA trong gan Tách gan chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm KCl 1,15 % theo tỉ lệ 1 : 10 (gan : dung dịch đệm) ở nhiệt độ 0 - 5 0C. Lấy 2 ml dịch đồng thể, thêm vào 1 ml dung dịch đệm Tris - HCl, ủ ở 37 0C trong 1 giờ. Kết thúc phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10 %, ly tâm 10000 vòng/phút, lấy 2 ml dịch trong cho phản ứng với 1 ml acid thiobarbituric 0,8 % ở 100 0C trong 15 phút và đo màu ở λ = 532 nm. [13] 2.6.6. Khảo sát tác dụng bảo vệ gan theo hướng chống gốc tự do qua việc định lượng malonyl dialdehyd (MDA) trong gan Sau khi gây suy giảm miễn dịch và điều trị theo sơ đồ 2.3 , tiến hành định lượng hàm lượng MDA như phần 2.6.5. Ngày 1 Cân trọng lượng Tiêm CY Định lượng MDA Định lượng MDA Định lượng MDA Ngày 3 Ngày 5 Ngày 8 36 Uống mẫu thử nghiệm (10 ml/kg) Ngày 1 2 3 4 5 6 7 8 Cân trọng lượng và tiêm CY Cân trọng lượng và định lượng MDA Sơ đồ 2.3. Khảo sát tác dụng bảo vệ gan theo hướng chống gốc tự do. 2.6.7. Tính kết quả Hàm lượng MDA (nM/ml) được tính theo phương trình hồi qui chất chuẩn MDA: y = 0,0637x - 0,0029 (R2 = 0,9981). CnMMDA/ml dịch đồng thể = (ODthử + 0,0029)/0,0637. Sau khi tính được hàm lượng MDA (nM/ml dịch đồng thể) ⇒ hàm lượng MDA (nM/g protid). 2.7. Đánh giá kết quả Các số liệu được biểu thị bằng trị số trung bình M ± SEM (Standard Error of Mean – sai số chuẩn của giá trị trung bình) và xử lý thống kê bằng phần mềm Jandel Scientific SigmaStat-98 dựa vào phép kiểm One-Way ANOVA hay Student t-test với P < 0,05.