Nguyên liệu và phương pháp trồng nhân trần

41 PHẦN 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Nguyên liệu 3.1.1 Các loại thảo mộc Các loại nhân trần khô: nhân trần Tía được mua tại cửa hàng thuốc nam Đại Phát Dược Hãng. Nhân trần nam, Nhân trần bồ bồđược mua tại Siêu thị hàng Hà Nội; Nhân trần bắc được mua tại Siêu thị thuốc Đông y Hải Thượng Lãn Ông. Tất cả các loại thảo mộc đều ở dạng khô, không ẩm mốc và được giám định bởi Bộ môn Dược liệu, khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM. 3.1.2 Mật ong Sử dụng mật ong của công ty Mật ong Phương Nam có các chỉ tiêu sau : Đường ≤ 5% ; Đường khử ≥ 65% ; Độ ẩm ≤ 18% Hydroxymethylfurfural ≤15 µg/kg Streptomycine < 0.01 ppm ; Chloramphenicol: < 0.3 ppm ; Sulfonamides: < 0.01 ppm ; Tetracycline < 0.01 (ppm) 3.1.3 Nước Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng nguồn nước máy và nước cất của Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh Hóa, Khoa Sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM. 3.1.4 Acid thực phẩm 42 Sử dụng acid citric dùng cho thực phẩm của công ty Weifang Ensign Industry Co., Ltd. 1313/2006/YT-CNTC. Sản phẩm ở dạng kết tinh trong suốt, không màu, không bị hút ẩm, không vón cục, không bị oxy hóa và có các chỉ tiêu sau : Độ tinh khiết : 99,78 % ; Tro sulfat : 0.04 % ; Độ ẩm : 8,56 % Pb < 5ppm ; As < 1ppm ; Al < 0.2ppm ; Fe < 10ppm ; Cl < 50ppm ; Oxalat < 350ppm ; Bacteria endotoxic < 0.5 iu/mg 3.1.5 Sơ đồ nghiên cứu: Thí nghiệm 4: Xác định chế độ thanh trùng Thí nghiệm 3: Xác định công thức phối chế tạo sản phẩm thức uống từ nhân trần Thí nghiệm 2: Xác định chế độ trích ly (tỉ lệ nguyên liệu:dung môi, nhiệt độ, thời gian, pH) Thí nghiệm 1: Phân tích hóa lý các loại thảo mộc và lựa chọn nguyên liệu Thí nghiệm 5: Kiểm nghiệm sản phẩm 43 3.2 Phương pháp phân tích hóa lý 3.2.1 Phương pháp phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của thảo mộc 3.2.1.1 Nguyên tắc: ™ Chiết các hợp chất có trong thảo mộc thành 3 phân đoạn với các dung môi có độ phân cực tăng dần là dietyl ether, ethanol 96% và nước. ™ Xác định các nhóm hợp chất trong từng phân đoạn bằng các phản ứng đặc trưng. [7] 3.2.1.2 Nguyên vật liệu thí nghiệm: Dung môi, thuốc thử: Dietyl ether, dung dịch KOH, thuốc thử Valse-Mayer, thuốc thử Xanthydrol. Anhydrid acetic, dung dịch NaOH, thuốc thử Dragendorff, thuốc thử Raymond-Marthoud. Dung dịch FeCl3; dung dịch NH4OH, thuốc thử Bouchardat; thuốc thử Fehling (A và B). Dung dịch CH3COONa; H2SO4 đậm đặc, thuốc thử Bertrand; NaCO3 tinh thể, HCl đậm đặc, bột Mg kim loại, cồn 96%...[24] 3.2.1.3 Chuẩn bị các dịch chiết: ™ Các loại nguyên liệu được rửa sạch, phơi khô và xay nhỏ. ™ Cân 5g nguyên liệu cho vào erlen 250ml, thêm 40ml dietyl ether, lắc đều trong 20 phút. Gạn, lọc dịch chiết ether. Bã nguyên liệu được chiết lần thứ hai với 40ml ether, lắc trong 5 phút. Gạn, lọc dịch chiết và gộp chung với dịch chiết lần đầu. Cô lại đến khi còn khoảng 50ml. ™ Bã nguyên liệu được chiết tiếp 2 lần, mỗi lần với 40ml cồn 96% trong 15 phút trên bếp cách thủy. Gộp dịch chiết, lọc và cô lại đến khi còn khoảng 50ml. ™ Bã nguyên liệu được chiết tiếp 2 lần, mỗi lần với 40ml nước cất trong 15 phút trên bếp cách thủy. Gộp dịch chiết, lọc và cô lại đến khi còn khoảng 50ml.[7] 44 3.2.1.4 Xác định các nhóm hợp chất tan trong dịch chiết ether ™ Định tính chất béo Lấy vài giọt dịch chiết ether nhỏ lên giấy thấm dầu, hơ nhẹ trên bếp cho bay hết dung môi. Nếu còn vết mờ tại nơi nhỏ dịch chiết: có chất béo. ™ Định tính tinh dầu Lấy khoảng 5ml dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hơi đến cắn. Nếu cắn có mùi thơm nhẹ, cho thêm vài giọt cồn rồi lại bốc hơi tới cắn. Nếu cắn có mùi thơm, nhẹ đặc trưng: có tinh dầu. ™ Định tính carotenoid Lấy khoảng 10ml dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Thêm vào cắn vài giọt SbCl3 (khan) bão hòa trong chloroform (thuốc thử Carr-Price). Dung dịch có màu xanh chuyển sang màu đỏ: có carotenoid. Lấy khoảng 10ml dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Thêm vào cắn vài giọt H2SO4 đậm đặc. Dung dịch có màu xanh dương đậm hay màu lục ngả sang màu xanh dương: có carotenoid. ™ Định tính triterpenoid Lấy khoảng 5ml dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa tan cắn trong 5ml anhydric acetic rồi thêm vào 0.5ml chloroform. Chuyển dung dịch vào một ống nghiệm nhỏ, khô. Dùng pipette thêm cẩn thận 1 – 2ml H2SO4 đậm đặc theo thành ống nghiệm. Nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp 45 dung dịch phía trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím: có triterpenoid (phytosterol hoặc các triterpen tự do). ™ Định tính alkaloid Lấy khoảng 10ml dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa cắn trong 2 – 4ml dung dịch acid chlohydric 5%. Chia dung dịch acid vào 4 ống nghiệm nhỏ. Định tính alkaloid bằng các thuốc thử với các phản ứng đặc trưng sau: Thuốc thử Valse – Mayer : tủa trắng – vàng nhạt. Thuốc thử Bertrand : tủa trắng. Thuốc thử Dragendorff : tủa đỏ cam. So sánh kết quả với ống đối chứng không thuốc thử. Nếu dung dịch đục hoặc có tủa: có alkaloid. ™ Định tính coumarin Nhỏ vài giọt dịch chiết ether lên một miếng giấy lọc. Bay hơi ether cho tới khô, nhỏ lên vết dịch 1 – 2 giọt dung dịch KOH 10% trong cồn và sấy nhẹ cho khô. Che một nửa vết dịch chiết bằng một miếng kim loại và soi dưới đèn tử ngoại 365nm. Sau vài phút, lấy miếng kim loại che ra. Nếu phần bị che có cường độ phát quang yếu hơn phần không bị che nhưng sau đó sáng dần lên đến mức tương đương: có coumarin. ™ Định tính anthraquinon Lấy khoảng 5ml dịch chiết ether cho vào một ống nghiệm nhỏ. Thêm vào 1ml dung dịch NaOH 10% và lắc kỹ. Nếu lớp kiềm có màu từ hồng tới đỏ: có anthraquinon dạng tự do. 46 ™ Định tính flavonoid Lấy khoảng 10ml dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa cắn với 2ml cồn và gạn dịch cồn vào một ống nghiệm nhỏ. Thêm vào dịch một ít bột Mg kim loại và 0.5ml HCl đậm đặc. Nếu dung dịch có màu từ hồng tới đỏ: có flavonoid. 3.2.1.5 Xác định các nhóm hợp chất tan trong dịch chiết cồn ™ Định tính alkaloid Lấy khoảng 5ml dịch chiết cồn cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa cắn trong 4ml dung dịch acid chlohydric 5%. Chia dung dịch acid vào 4 ống nghiệm nhỏ. Định tính alkaloid bằng các thuốc thử với các phản ứng đặc trưng sau: Thuốc thử Valse – Mayer : tủa trắng – vàng nhạt. Thuốc thử Bertrand : tủa trắng. Thuốc thử Dragendorff : tủa đỏ cam. So sánh kết quả với ống đối chứng không thuốc thử. Nếu dung dịch đục hoặc có tủa: có alkaloid. ™ Định tính coumarin Thực hiện tương tự phần định tính coumarin trong dịch chiết ether. ™ Định tính glycosid tim Phản ứng Raymond-Marthoud: Lấy 5ml dịch chiết cồn cho vào chén sứ bốc hơi tới cắn. Hòa lại cắn với 2ml cồn, gạn dịch cồn vào một ống nghiệm nhỏ. Cho vào 47 2-3 giọt dung dịch m-dinitrobenzen 1% trong cồn 96% rồi thêm vào 3 giọt KOH 5%. Nếu xuất hiện màu tím: có các carotenoid. Phản ứng với thuốc thử Xanthydrol: Lấy 5ml dịch chiết cồn cho vào chén sức bốc hơi tới cắn. Hòa lại cắn với 5ml thuốc thử Xanthydrol khuấy cho tan hết cắn, đậy ống nghiệm bằng nút bông gòn, đun cách thủy trong 5 phút. Nếu có màu hồng đến đỏ mận: có đường 2-desoxy. ™ Định tính saponin Lấy 5ml dịch chiết cồn cho vào chén sứ, cô trên bếp cách thủy tới cắn. Hòa cắn trong 25ml dung dịch cồn 25% trên bếp cách thủy, lọc vào ống nghiệm. Thêm 3ml nước và lắc mạnh theo chiều dọc ống. Nếu có bọt bền: có saponin. ™ Định tính flavonoid Lấy khoảng 5ml dịch chiết cồn cho vào chén sứ, bốc hơi còn khoảng 2ml và gạn dịch cồn vào một ống nghiệm nhỏ. Thêm vào dung dịch một ít bột Mg kim loại và 0.5 ml HCl đậm đặc. Nếu dung dịch có màu từ hồng tới đỏ: có flavonoid. ™ Định tính proanthocyanidin (PAC) Lấy 5ml dịch chiết cồn cho vào một ống nghiệm nhỏ. Thêm 2ml dung dịch acid hydrocloric 10% và đun trên bếp cách thủy 10 phút. Nếu dung dịch có màu hồng đỏ tới đỏ: có proanthocyanidin. ™ Định tính anthocyanosid (AC) Lấy 1ml dịch chiết cồn cho vào một ống nghiệm nhỏ. Thêm 2-3 giọt dung dịch acid hydrocloric 10%. Nếu dung dịch có màu hồng đỏ tới đỏ: có anthocyanosid. 48 Lấy 1ml dịch chiết cồn cho vào một ống nghiệm nhỏ. Thêm 2-3 giọt dung dịch natri hydroxid 10%. Nếu dung dịch có màu xanh: có anthocyanosid. ™ Định tính tanin Lấy 2ml dịch chiết cồn cho vào một chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa tan cắn với 4ml nước trên bếp cách thủy. Lọc, chia dịch lọc vào hai ống nghiệm. - Ống nghiệm thứ nhất: pha loãng 0.5ml dịch lọc với 1ml nước cất. Thêm 2-3 giọt thuốc thử FeCl3 5%, lắc đều. Nếu dung dịch có màu xanh đen hay xanh rêu: có hợp chất polyphenol. - Ống nghiệm thứ hai: thêm vào dịch lọc 5 giọt dung dịch gelatin muối, lắc đều, so sánh với dung dịch ban đầu. Nếu có tủa bông trắng: có tanin. ™ Định tính các acid hữu cơ Lấy 2ml dịch chiết cho vào một ống nghiệm. Pha loãng với 1ml nước và thêm vào dung dịch một ít tinh thể natri carbonat. Nếu có các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể Na2CO3: có acid hữu cơ. ™ Định tính các chất khử Lấy 5ml dịch chiết cồn cho vào một chén sứ, bốc hơi dịch cồn đến cắn. Hòa cắn với 3ml nước trên bếp cách thủy, để nguội và lọc qua giấy lọc. Thêm vào dịch lọc 0.5ml dung dịch Fehling A và 0.5ml dung dịch Fehling B. Đun cách thủy 5 phút. Nếu có kết tủa đỏ gạch dưới đáy ống nghiệm: có các hợp chất khử (chủ yếu là đường khử). [7] 49 3.2.1.6 Xác định các nhóm hợp chất tan trong dịch chiết nước ™ Định tính alkaloid Lấy khoảng 10ml dịch chiết nước cho vào bình lắng gạn 50ml, kiềm hóa dịch chiết tới pH=10 bằng dung dịch NH4OH 10% và chiết bằng chloroform (10ml x 3 lần). Gộp chung và rửa lớp dung môi hữu cơ với 10ml nước cất. Bốc hơi dung môi đến cắn sệt và hòa tan trong một lượng vừa đủ ether. Lắc lớp ether với dung dịch acid hydrocloric 5% (2ml x 3 lần). Chia dung dịch acid vào 4 ống nghiệm nhỏ. Định tính alkaloid bằng các thuốc thử: Valse-Mayer, Bertrand và Dragendorff. - Thuốc thử Valse-Mayer: tủa trắng – vàng nhạt - Thuốc thử Bertrand : tủa trắng. - Thuốc thử Dragendorff : tủa đỏ cam. So sánh kết quả với ống đối chứng không có thuốc thử. Nếu dung dịch đục hoặc có tủa: có alkaloid. ™ Định tính glycosid tim Phản ứng Raymond-Marthoud: Lấy 5ml chiết nước cho vào chén sứ bốc hơi tới cắn. Hòa lại cắn với 2ml cồn 25%, gạn dịch cồn vào một ống nghiệm nhỏ. Cho vào 2-3 giọt dung dịch m-dinitrobenzen 1% trong cồn 96% rồi thêm vào 3 giọt KOH 5%. Nếu xuất hiện màu tím: có các carotenoid. Phản ứng với thuốc thử Xanthydrol: Lấy 5ml dịch chiết nước bốc hơi tới cắn. Hòa lại cắn với 5ml thuốc thử Xanthydrol, khuấy cho tan hết cắn, đậy ống nghiệm 50 bằng nút bông gòn, đun cách thủy trong 5 phút. Nếu có màu hồng đến đỏ mận: có đường 2-desoxy. ™ Định tính saponin Lấy khoảng 5ml dịch chiết nước cho vào chén sứ, đun cách thủy tới cắn khô. Hòa cắn với 5ml dung dịch cồn 25%, lọc vào ống nghiệm. Pha loãng với 3ml nước và lắc mạnh theo chiều dọc ống trong 15 giây. Nếu có cột bọt bền trong 15 phút: có saponin. ™ Định tính flavonoid Lấy khoảng 5ml dịch chiết nước cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hòa tan cắn trong khoảng 2ml cồn 25%, lọc vào ống nghiệm nhỏ. Thêm vào dung dịch một ít bột Mg kim loại và 0.5ml HCl đậm đặc (phản ứng cyanidin). Nếu dung dịch có màu từ hồng tới đỏ: có flavonoid. ™ Định tính proanthocyanidin (PAC) Lấy 5ml dịch chiết nước cho vào một ống nghiệm nhỏ. Thêm 2ml dung dịch acid hydrocloric 10% và đun trên bếp cách thủy 10 phút. Nếu dung dịch có màu hồng đỏ tới đỏ: có proanthocyanidin. ™ Định tính anthocyanosid (AC) Lấy 1ml dịch chiết nước cho vào một ống nghiệm nhỏ. Thêm 2-3 giọt dung dịch acid hydrocloric 10%. Nếu dung dịch có màu hồng đỏ tới đỏ: có anthocyanosid. Lấy 1ml dịch chiết nước cho vào một ống nghiệm nhỏ. Thêm 2-3 giọt dung dịch natri hydroxid 10%. Nếu dung dịch có màu xanh: có anthocyanosid. 51 ™ Định tính tanin Lấy 0.5ml dịch chiết nước cho vào 1 ống nghiệm nhỏ. Thêm 2-3 giọt thuốc thử FeCl3 5% lắc đều. Nếu dung dịch có màu xanh đen hay xanh rêu: có hợp chất polyphenol. Lấy 2ml dịch chiết nước, thêm vào 5 giọt dung dịch gelatin muối, lắc đều, so sánh với dung dịch ban đầu. Nếu có tủa bông trắng: có tanin. ™ Định tính hợp chất khử Lấy 5ml dịch chiết nước cô cách thủy tới khô, hòa cắn trong cồn 25%, lọc. Cho dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 0.5ml dung dịch Fehling A và 0.5ml dung dịch Fehling B. Đun cách thủy 5 phút. Nếu có kết tủa đỏ gạch dưới đáy ống nghiệm: có các hợp chất khử. ™ Định tính các acid hữu cơ Lấy 2ml dịch chiết nước cho vào một ống nghiệm. Thêm vào dung dịch một ít tinh thể natri carbonat. Nếu có các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể Na2CO3: có acid hữu cơ. ™ Định tính hợp chất polyuronic Nhỏ từng giọt của 2ml dịch chiết nước vào một ống nghiệm có chứa 10ml cồn 95%. Nếu có nhiều tủa bông được tạo thành: có các hợp chất polyuronic. [7] 52 3.2.2 Xác định một số thành phần khác 3.2.2.1 Xác định độ ẩm của thảo mộc ™ Nguyên tắc: Sấy một lượng cân chính xác của nguyên liệu khoảng 1-3 g ở nhiệt độ 1050C cho tới khối lượng không đổi. Cân mẫu thử sau khi sấy. Từ sự chênh lệch khối lượng của mẫu trước và sau khi sấy, tính được độ ẩm của nguyên liệu.[25] ™ Cách tiến hành: Lấy một cốc hình trụ, sấy khô đến khối lượng không đổi ở 1050C. Cân vào cốc một lượng chính xác khoảng 2g nguyên liệu rồi đem sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 1050C trong 2 giờ. Lấy cốc có chứa nguyên liệu đã sấy để vào bình hút ẩm, mở khóa hoặc hé mở nắp bình hút ẩm cho thông khí với bên ngoài trong khoảng 1 phút rồi đóng kín bình hút ẩm. Để nguội trong bình hút ẩm 15 phút. Cân và ghi kết quả. Tiếp tục sấy trong 1 giờ, để nguội và cân mẫu như trên cho đến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp chênh lệch nhau không quá 5mg. ™ Tính kết quả: Độ ẩm của nguyên liệu được tính theo công thức sau: X% = [(a-b) : a].100 Trong đó: X%: độ ẩm nguyên liệu (phần trăm theo khối lượng). a: khối lượng nguyên liệu khi chưa sấy (g). b: khối lượng nguyên liệu sau khi sấy đến khối lượng không đổi (g). [25] 53 3.2.2.2 Xác định tro toàn phần trong thảo mộc ™ Nguyên tắc: Đốt nguyên liệu, nung ở 300 – 6000C đến khối lượng không đổi. Cân mẫu sau khi đốt. ™ Cách tiến hành: Nung một chén nung bằng sứ tới khối lượng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm và cân khối lượng của chén. Cân chính xác khoảng 1-3g nguyên liệu cho vào chén nung. Trải đều nguyên liệu ở đáy chén và đốt cẩn thận trên bếp điện cho đến khi nguyên liệu cháy hoàn toàn và chén không còn bốc khói. Đặt chén vào lò nung ở 300 – 6000C cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro không còn màu đen). Dùng cặp sắt lấy chén nung ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút ẩm. Cân và ghi lại lượng cân. Đặt chén đựng tro vào lò nung và lại tiếp tục nung ở nhiệt độ bên trong 1 giờ nữa. Lấy chén ra, để nguội trong bình hút ẩm khoảng 30 phút và cân. Tiếp tục làm như vậy đến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp giống nhau hoặc chênh lệnh nhau nhiều nhất 0.5mg. ™ Tính kết quả: Hàm lượng tro toàn phần của nguyên liệu được tính theo công thức: ( ) ( )hcc baA . 100.% − −= 54 Trong đó: A%: hàm lượng tro toàn phần của nguyên liệu (% theo khối lượng chất khô của nguyên liệu). a: khối lượng chén có tro (g). b: khối lượng chén không tro (g). c: khối lượng nguyên liệu dùng (g). h: độ ẩm của nguyên liệu (%). [25] 3.2.2.3 Xác định tro không tan trong acid ™ Nguyên tắc: dùng acid hydrocloric để kết tủa các thành phần không tan trong acid. Nung tủa ở 5000C đến khối lượng không đổi. Cân mẫu sau khi đốt. ™ Cách tiến hành: Cho 25 ml acid hydrocloric 2 M vào tro toàn phần, đun sôi 5 phút, lắc để tập trung những chất không tan vào một giấy lọc không tro, rửa bằng nước nóng rồi đem nung ở 500oC đến khối lượng không đổi. Tính tỉ lệ phần trăm của tro không tan trong acid so với dược liệu đã làm khô trong không khí. [7], [25] 3.2.3 Định lượng các chất chiết được trong nguyên liệu 3.2.3.1 Nguyên liệu: Dùng dung môi thích hợp để chiết kiệt các chất chiết được trong nguyên liệu. Sấy mẫu đến khối lượng không đổi và cân. 55 3.2.3.2 Cách tiến hành: Cân chính xác khoảng 2g nguyên liệu đã được cắt nhỏ vào bình 250ml có nút mài. Thêm chính xác 50ml nước cất, đậy nút và cân chính xác tới 0.01g, lắc đều và để yên 1 giờ. Lắp sinh hàn hồi lưu vào bình và đun sôi nhẹ trong 1 giờ. Để nguội và cân, điều chỉnh khối lượng bình tới khối lượng ban đầu bằng dung môi. Lắc đều và lọc nhanh hỗn hợp qua giấy lọc khô. Lấy toàn bộ dịch lọc cho vào một chén kết tinh khô hay becher 50ml đã được sấy khô tới khối lượng không đổi và cân bì. Làm khô dịch lọc trên bếp cách thủy rồi sấy ở 100 – 1050C trong 3 giờ. Để nguội trong bình hút ẩm và cân. Hàm lượng các chất chiết được của nguyên liệu được tính bằng công thức: ( )ha bX −= 1 Trong đó: X: hàm lượng các chất chiết được của nguyên liệu (% theo khối lượng chất khô của nguyên liệu). h: độ ẩm của nguyên liệu (%). a: khối lượng nguyên liệu đem thí nghiệm (g). b: khối lượng cân được (g) (sau khi trừ bì). [7], [25] 56 3.2.4 Xác định nồng độ chất khô của dung dịch bằng khúc xạ kế Khúc xạ kế là dụng cụ dùng để xác định hàm lượng chất khô có trong mẫu thí nghiệm. Dụng cụ này hoạt động theo nguyên tắc là độ lệch giữa tia khúc xạ và tia tới khi chiếu qua mẫu (dạng lỏng) sẽ phụ thuộc vào nồng độ chất khô của mẫu. Đơn vị đo được tính theo độ Brix (0Bx). [24] 3.2.5 Phân tích saponin theo phương pháp tính Chỉ số bọt (CSB) 3.2.5.1 Nguyên tắc: CSB của saponin là độ pha loãng của nguyên liệu bằng nước để có chiều cao bọt 1cm sau khi lắc trong ống nghiệm có kích thước xác định, thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện quy định. 3.2.5.2 Cách tiến hành: Lấy 10 ống nghiệm có chiều cao 16cm, đường kính 16mm. Cho vào các ống nghiệm được đánh số lần lượt là 1, 2, 3…10 tương ứng với lượng dịch cốt cho vào mỗi ống là 1,2,3...10ml. Thêm nước cất vào mỗi ống cho đủ 10ml. Bịt miệng ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc của ống trong 15 giây, 2 lần lắc/giây. Để yên trong 15 phút. Sau đó đo chiều cao các cột bọt. 3.2.5.3 Tính kết quả: Nếu cột bọt trong các ống thấp dưới 1cm thì chỉ số bọt l dưới 100. nghĩa là không có saponin. Chỉ số bọt được tính theo công thức : 57 CSB = 100 x 10 / i CBS : chỉ số bọt i : ống nghiệm thứ i có cột bọt cao 1cm. [28] 3.2.6 Phân tích Polyphenol theo phương pháp xanh Phổ (Prussian Blue) 3.2.6.1 Nguyên tắc: Polyphenol sẽ phản ứng với thuốc thử và tạo nên dung dịch có màu xanh Phổ. Từ cường độ màu của mỗi thí nghiệm và đồ thị đường chuẩn, ta sẽ suy ra được nồng độ polyphenol có trong mẫu cần phân tích. Hóa chất : Dung dịch FeCl3 0.02M trong HCl 0.1M; dd K3Fe(CN)6 0.016N . Chất ổn định : nước cất : H3PO4 85% : gum arabic 1% (tỷ lệ thể tích 3:1:1). Chất chuẩn : acid garlic trong nước cất (25-50-100-200-300-400-500 ppm). 3.2.6.2 Cách tiến hành: Lấy 0.1ml dịch (chất chuẩn hoặc mẫu cần đo được pha loãng đến nồng độ thích hợp) vào ống nghiệm, cho tiếp 3ml nước cất, lắc đều, cho nhanh 1ml K3Fe(CN)6 và 1ml FeCl3, lắc đều dung dịch. Để yên dung dịch trong 15 phút. Bổ sung chất ổn định cho đủ 10ml, đo độ hấp thu A tại bước sóng 700nm. Dựng đường chuẩn với acid garlic ở các nồng độ nêu trên. 58 3.2.6.3 Tính kết quả: Dựa vào đường chuẩn để tính và so sánh hàm lượng polyphenol trong các dịch cốt. [14] Ñöôøng chuaån polyphenol y = 0.0066x R2 = 0.9918 0 0.5 1 1.5 2 0 50 100 150 200 Hình 3.1 Đồ thị đường chuẩn polyphenol 3.2.7 Phương pháp sắc ký lớp mỏng TLC (Thin layer chromatography) 3.2.7.1 Nguyên tắc: Sắc ký lớp mỏng còn được gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), chủ yếu dựa vào hiện tượng hấp phụ. Trong đó, pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp phụ trơ. Mẫu cần phân tích thường là hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau. ™ Pha động: dung môi, đơn chất hoặc hỗn hợp, di chuyển dọc theo tấm lớp mỏng và l