Phân lập và xác định đặc điểm sinh học của chủng nấm men Candida glabrata RN4 từ gạo nếp cẩm lên men

BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ 4 DOI: 10.15625/vap.2020.00046 PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CHỦNG NẤM MEN Candida glabrata RN4 TỪ GẠO NẾP CẨM LÊN MEN Trần Văn Tuấn1,*, Vũ Xuân Tạo2 Tóm tắt: Nấm men Candida glabrata thường được liên hệ với khả năng gây bệnh cơ hội ở người. Tuy nhiên, một số chủng của loài này lại có khả năng sinh ethanol và chịu được các điều kiện sinh trưởng khắc nghiệt trong quá trình lên men. Với khả năng lên men sinh ethanol và chịu được nồng độ ethanol cao mà C. glabrata có thể vô tình được sử dụng hoặc bị nhiễm vào sản phẩm lên men trong quá trình sản xuất. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân lập được chủng C. glabrata RN4 trong một sản phẩm gạo nếp cẩm lên men. Chủng RN4 có hình thái tế bào trên cả môi trường thạch và dưới kính hiển vi đều rất giống với loài nấm men rượu Saccharomyces cerevisiae. Chủng RN4 có đặc tính kết lắng và bám dính bề mặt giống với một số chủng nấm men S. cerevisae đã được nghiên cứu. Đặc biệt, chủng này có khả năng lên men hình thành khí CO2 và chịu được nồng độ ethanol trong môi trường nuôi cấy lên đến 7%. Việc phân lập được chủng nấm men C. glabrata trong sản phẩm lên men cho thấy cần phải có sự kiểm soát chặt chẽ về chất lượng của gạo nếp cẩm lên men theo hình thức thủ công để tránh nhiễm nấm men gây bệnh cơ hội có thể ảnh hưởng đến sức khỏe người sử dùng. Từ khóa: Candida glabrata, Saccharomyces cerevisiae, gạo nếp cẩm lên men. 1. MỞ ĐẦU Sau Candida albicans, Candida glabrata là nguyên nhân thường gặp nhất liên quan đến các bệnh về da, miệng và đường sinh dục ở người. Nấm men C. glabrata có thể gây nhiễm trùng hệ thống, viêm da hoặc viêm đường sinh dục ở những người bị suy giảm miễn dịch (Pfaller & Diekema, 2004). Tương tự với nấm men rượu Saccharomyces cerevisiae, C. glabrata có khả năng bám dính để dễ dàng tiếp cận và xâm nhập vào cơ thể vật chủ. Khả năng bám dính cũng là yếu tố cần thiết trong tương tác giữa các tế bào và tạo các khối đa bào (Brückner & Mösch, 2011). Nhờ có khả năng sinh lượng lớn ethanol trong quá trình lên men mà C. glabrata đã được nghiên cứu để dùng trong sản xuất ethanol sinh học (Watanabe et al., 2010). Tuy nhiên vì loài nấm men này có nguy cơ ảnh hưởng đến sức khỏe con người, nên C. glabrata chỉ được nghiên cứu sử dụng cho mục đích công nghiệp. Nấm men S. cerevisiae thường được sử dụng trong sản xuất thực phẩm lên men và các đồ uống có cồn (Walker & Stewart, 2016). Ở những cơ sở sản xuất nhỏ lẻ, việc kiểm soát chất lượng men giống dùng trong sản xuất còn rất hạn chế. Men giống (dạng bột hoặc 1Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. 2Trung tâm Sinh học Thực nghiệm, Viện Ứng dụng Công nghệ *Email: tuantran@vnu.edu.vn 370 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM dạng bánh men) thường được bổ sung vào nguyên liệu ở mỗi lần sản xuất. Nếu chủng giống không được kiểm soát về mặt phân loại mà chỉ dựa vào hiệu quả lên men sẽ rất khó để đánh giá được mức độ an toàn. Ngoài ra trong quá trình lên men theo sản xuất thủ công cũng có thể xuất hiện sự tạp nhiễm của nấm men gây bệnh cơ hội như C. glabrata. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phân lập được chủng C. glabrata RN4 trong sản phẩm gạo nếp cẩm lên men được bán tại một chợ ở Hà Nội. Chủng RN4 có hình thái và một số đặc tính tương đồng với nấm men rượu S. cerevisiae như khả năng lên men, đặc tính kết lắng tế bào và bám dính bề mặt. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Mẫu gạo nếp cẩm lên men theo phương pháp thủ công được mua tại một chợ ở Hà Nội dùng cho phân lập nấm men tổng số. Chủng S. cerevisiae BY4741 không có khả năng kết lắng và không bám dính được mua từ EUROSCARF (www.euroscarf.de). Chủng BY4741[FLO8] là chủng được chuyển gen FLO8 để kích hoạt khả năng kết lắng và bám dính ở nấm men rượu do Phòng Genomic, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN cung cấp. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Phân lập và quan sát hình thái Mẫu gạo nếp cẩm lên men được tiến hành pha loãng ở các nồng độ khác nhau, sau đó cấy trải trên môi trường YPD (1% cao nấm men, 1% pepton, 2% dextrose, 2% agar, pH 6,5). Đĩa môi trường sau đó được ủ ở nhiệt độ 30 ºC trong 24 giờ. Các khuẩn lạc nấm men xuất hiện được tinh sạch, thuần khiết. Hình dạng tế bào được quan sát dưới kính hiển vi quang học. Đánh giá khả năng bám dính Chủng RN4 và 2 chủng đối chứng BY4741 và BY4741[FLO8] được cấy vạch trên đĩa môi trường YPD. Sau 24 giờ nuôi ở 37 oC, tiến hành bổ sung 5-7 ml nước cất lên bề mặt đĩa và lắc nhẹ cho đến khi khuẩn lạc nấm ở chủng đối chứng âm BY4741 trôi hết thì đổ bỏ phần dịch lỏng. Khả năng bám dính bề mặt của chủng RN4 được so sánh với chủng đối chứng dương là BY4741[FLO8]. Đánh giá khả năng kết lắng Cấy một vài khuẩn lạc nấm men vào ống fancol 10 ml có chứa 3 ml môi trường YPD dạng dịch. Ống được nuôi lắc với tốc độ 200 vòng/phút, ở 37 ºC. Hai chủng BY4741[FLO8] và BY4741 được sử dụng làm đối chứng. Sau 18 giờ, các ống dịch nuôi sẽ được dựng đứng cố định trong 1-2 phút. Các chủng có khả năng kết lắng sẽ nhanh chóng tạo lớp sinh khối lắng dưới đáy ống fancol. Đánh giá khả năng lên men sinh CO2 và chịu ethanol PHẦN I. NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 371 Chủng RN4 và chủng đối chứng là nấm men rượu Saccharomyces cerevisiae BY4741 được nuôi cấy trong ống nghiệm có chứa ống Durham và 10 ml dịch môi trường Hansen (5% glucose; 1% pepton; 0,3% KH2PO4; 0,2% MgSO4.7H2O; 1,5% agar; pH 6). Các ống nghiệm được bọc kín và nuôi ở nhiệt độ 30 ºC. Các mẫu được quan sát khả năng sinh khí sau 15-20 giờ nuôi cấy. Khả năng chịu cồn được xác định bằng cách nhỏ 10 µL dịch tế bào nấm men RN4 và chủng đối chứng BY4743 lên bề mặt môi trường YPD đã bổ sung ethanol để đạt được các nồng độ ethanol tương ứng là 5%, 7% và 9%. Các đĩa được ủ trong tủ ổn nhiệt 30 oC trong 24 giờ để nấm men phát triển. Định danh chủng RN4 bằng giải trình tự vùng ITS của rDNA DNA hệ gen của chủng RN4 được tách chiết theo quy trình nhóm nghiên cứu đã công bố (Tran et al., 2017). Vùng ITS của rDNA được khuếch đại từ DNA hệ gen bằng PCR sử dụng cặp mồi đa năng đặc hiệu cho phổ rộng các loài nấm gồm: mồi xuôi ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) và mồi ngược ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATAT GC) (White et al., 1990). Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,7% và tinh sạch bằng kit tinh sạch của hãng Promega (Mỹ). Mẫu DNA tinh sạch được giải trình tự bởi Công ty 1st BASE (Singapore) và trình tự ITS được phân tích so sánh với cơ sở dữ liệu của GenBank. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng bằng phần mềm MEGA6. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và đặc điểm hình thái của chủng RN4 Từ mẫu gạo nếp cẩm lên men, chúng tôi phân lập và thuần khiết được chủng nấm men RN4. Sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường YPD, khuẩn lạc chủng RN4 có màu trắng, bóng đặc trưng của nấm men. Quan sát dưới kính hiển vi, tế bào chủng RN4 có dạng hình oval, sinh trưởng bằng nảy chồi. So sánh đặc điểm hình thái chủng RN4 với chủng nấm men chuẩn S. cerevisiae BY4741 nhận thấy chúng đều có khuẩn lạc tròn, màu trắng đục, bề mặt lồi và bóng, hình thái tế bào dưới kính hiển vi của chúng cũng rất giống nhau (Hình 1). Nếu chỉ dựa vào hình thái khuẩn lạc hoặc hình thái tế bào, rất khó có thể phân biệt được hai chủng này. Hình 1. Hình thái khuẩn lạc chủng nấm men RN4 và S. cerevisiae BY4741 trên môi trường YPD và hình thái tế bào dưới kính hiển vi 3.2. Định danh chủng RN4 bằng giải trình tự vùng ITS của rDNA So với các gen 18S rRNA và 28S rRNA của rDNA, vùng ITS nối giữa gen 18S rRNA và 28S rRNA (gồm ITS1; 5,8S rRNA; ITS2) ở nấm có mức độ biến đổi cao giữa 372 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM các loài gần gũi. Do đó vùng trình tự này được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu phân loại nấm (Curran et al., 1994, White et al., 1998). DNA hệ gen của chủng nấm RN4 được tách chiết dùng để khuếch đại vùng ITS bằng PCR với cặp mồi ITS1/ITS4. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose chỉ cho một băng DNA duy nhất với kích thước khoảng 760 bp (Hình 2a). Kết quả so sánh trình tự ITS thu được với dữ liệu trong GenBank cho thấy chủng RN4 thuộc loài Candida glabrata với độ tương đồng về trình tự ITS là 99,9% (Hình 2b). Hình 2. Định danh chủng RN4 dựa trên trình tự vùng ITS của rDNA (a) Sản phẩm PCR vùng ITS trên gel agarose 0,7%, (b) Cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự ITS của rDNA 3.3. Khả năng bám dính và kết lắng của của chủng RN4 Khả năng bám dính tạo thành các cụm tế bào hoặc bám dính bề mặt là điều kiện tiên quyết cho các phương thức sinh trưởng, khả năng hấp thụ dinh dưỡng và thích ứng với các yếu tố khắc nghiệt của môi trường như nồng độ ethanol cao, dinh dưỡng cạn kiệt (Brückner & Mösch, 2011). Đối với các chủng nấm men gây bệnh, khả năng bám dính bề mặt giúp chúng có thể bám và xâm nhập vào tế bào chủ để lây nhiễm. Chủng RN4 cùng 2 chủng đối chứng BY4741 và BY4741[FLO8] được kiểm tra khả năng kết lắng và bám dính. Từ kết quả nghiên cứu cho thấy chủng RN4 có khả năng kết lắng giống với chủng đối chứng BY4741[FLO8]. Dựa trên lượng sinh khối kết lắng cho thấy chủng RN4 có khả năng sinh trưởng và kết lắng rất mạnh (Hình 3a). Sau khi rửa trôi bằng nước, các tế bào chủng RN4 hầu như không bị rửa trôi so với đối chứng âm là chủng BY4741 và khá tương đồng với chủng đối chứng dương BY4741[FLO8]. Thậm chí chủng RN4 còn thể hiện đặc tính bám dính bề mặt mạnh hơn cả chủng đối chứng dương BY4741[FLO8] (Hình 3b). Ở nấm men rượu S. cerevisiae, khả năng bám dính và kết lắng được quyết định bởi một nhóm gen thuộc họ FLO mã hóa các protein gồm Flo1, Flo5, Flo9, Flo10 và Flo11. Sự biểu hiện của các protein Flo được kiểm soát bởi protein điều hòa Flo8 mã hóa bởi gen FLO8. Trên thực tế, nhiều các chủng nấm men rượu tự nhiên không có khả năng bám dính và kết lắng do gen FLO8 bị đột biến dẫn đến bất hoạt (Fichtner et al., 2007). Khả năng bám dính ở hai loài nấm men quan trọng nhất của chi Candida là C. albicans và C. glabrata cũng được kiểm soát bởi gen điều hòa FLO8 (Cao et al., 2006; Mundy & PHẦN I. NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 373 Cormack, 2009). Ở loài C. glabrata, protein Flo8 điều hòa biểu hiện các gen thuộc họ EPA mã hóa protein gắn bề mặt. Khả năng bám dính giúp nấm men dễ dàng xâm nhập và lẫy nhiễm tế bào vật chủ (Mundy & Cormack, 2009). Hình 3. Khả năng kết lắng và bám dính của chủng RN4 so với nấm men rượu S. cerevisiae. (a) Khả năng kết lắng (b) Khả năng bám dính 3.4. Khả năng sinh khí CO2 và chịu ethanol của chủng RN4 Khả năng lên men của chủng RN4 được xác định gián tiếp qua sự hình thành khí CO2 tích tụ trong ống Durham. Sau 15-20 giờ nuôi cấy, ống nghiệm với chủng RN4 và chủng đối chứng là nấm men S. cerevisiae BY4741 đều sinh khí CO2. Khả năng sinh CO2 ở chủng RN4 thậm chí còn mạnh hơn so với chủng BY4741 (Hình 4a). Thử nghiệm nuôi trên môi trường YPD có bổ sung các nồng độ ethanol khác nhau cho thấy chủng RN4 có khả năng chịu được nồng độ cồn khá cao, lên đến 7% (Hình 4b). Nấm men S. cerevisiae có khả năng lên men rượu và an toàn đối với sức khỏe con người. Do đó, chúng được sử dụng rất nhiều trong sản xuất rượu vang, bia và một số sản phẩm lên men khác (Legras et al., 2007). Việc chịu được nồng độ cồn cao khiến C. grabrata dễ dàng thích ứng và sinh trưởng tốt trong các điều kiện lên men rượu. Gạo nếp cẩm lên men là món ăn được bán rộng rãi tại các chợ truyền thống ở nước ta. Tuy nhiên, việc phân lập được chủng C. glabrata RN4 có khả năng lên men sinh CO2 và chịu được hàm lượng cao ethanol từ sản phẩm gạo nếp cẩm lên men cho thấy nguy cơ gây hại đối với sức khỏe người tiêu dùng khi vô tình sử dụng chủng RN4 trong lên men hoặc chủng này bị nhiễm vào sản phẩm trong quá trình sản xuất. Trên thế giới, một số chủng thuộc loài C. glabrata đã được nghiên cứu ứng dụng trong lên men sản xuất ethanol từ nguyên liệu là phế thải nông nghiệp (Watanabe et al., 2010). Tuy nhiên, việc nghiên cứu sử dụng loài C. glabrata kể cả phục vụ cho sản xuất ethanol công nghiệp cũng cần được cân nhắc và kiểm soát chặt chẽ. 374 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Hình 4. Khả năng sinh khí CO2 và chịu ethanol của chủng RN4 so với chủng nấm men rượu S. cerevisiae BY4741. (a) Khả năng sinh khí CO2, (b) Khả năng chịu ethanol 4. KẾT LUẬN Đã phân lập được chủng nấm men RN4 từ sản phẩm gạo nếp cẩm lên men có đặc điểm hình thái giống với loài nấm men rượu S. cerevisiae. Chủng RN4 được phân loại thuộc loài C. glabrata dựa trên trình tự vùng ITS của rDNA. Chủng RN4 có khả năng lên men sinh khí CO2, chịu được nồng độ ethanol cao, có đặc tính bám dính và kết lắng. Tuy nhiên, C. glabrata là loài nấm men gây bệnh cơ hội ở người, nên chủng RN4 không được phép sử dụng trong sản xuất thực phẩm. Lời cảm ơn: Để hoàn thành nghiên cứu này, các tác giả xin cảm ơn CN. Đào Thị Bích Ngọc đã hỗ trợ kỹ thuật cho một số thí nghiệm. TÀI LIỆU THAM KHẢO Brückner S., Mösch H.-U., 2011. Choosing the right lifestyle: adhesion and development in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiology Reviews, 36(1): 25-58. Cao F., Lane S., Raniga P. P., Lu Y., Zhou Z., Ramon K., Chen J., Liu H., 2016. The Flo8 transcription factor is essential for hyphal development and virulence in Candida albicans. Molecular Biology of the Cells, 17(1): 295-307. Curran J., Driver F., Ballard J. W. O., Milner R. J., 1994. Phylogeny of Metarhizium: analysis of ribosomal DNA sequence data. Mycological Research, 98(5): 547-552. Fichtner L., Schulze F., Braus G. H., 2007. Differential Flo8p‐dependent regulation of FLO1 and FLO11 for cell–cell and cell–substrate adherence of S. cerevisiae S288c. Molecular Microbiology, 66(5): 1276-1289. Legras J. L., Merdinoglu D., Cornuet J. M., Karst F., 2007. Bread, beer and wine: Saccharomyces cerevisiae diversity reflects human history. Molecular Ecology, 16(10): 2091-2102. Mundy R. D., Cormack B., 2009. Expression of Candida glabrata adhesins after exposure to chemical preservatives. The Journal of Infectious Diseases 199(12):1891-1898. PHẦN I. NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 375 Pfaller M., Diekema D., 2004. Twelve years of fluconazole in clinical practice: global trends in species distribution and fluconazole susceptibility of bloodstream isolates of Candida. Clinical Microbiology and Infection, 10(s1): 11-23. Tran V. T., Do T. B. X., Nguyen T. K., Vu X. T., Dao B. N., Nguyen H. H., 2017. A simple, efficient and universal method for the extraction of genomic DNA from bacteria, yeasts, molds and microalgae suitable for PCR-based applications. Vietnam Journal of Science, Technology and Engineering, 59(4): 66-74. Walker G. M., Stewart G .G., 2016. Saccharomyces cerevisiae in the production of fermented beverages. Beverages 2, 30; doi:10.3390/beverages2040030. Watanabe I., Nakamura T., Shima J., 2010. Strategy for simultaneous saccharification and fermentation using a respiratory-deficient mutant of Candida glabrata for bioethanol production. Journal of Bioscience and Bioengineering, 110(2): 176-179. White T. J., Bruns T. D., Lee S. B., Taylor J. W., 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 18(1): 315. BIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF Candida glabrata RN4 ISOLATED FROM A FERMENTED GLUTINOUS RICE PRODUCT Tran Van Tuan1,*, Vu Xuan Tao2 Abstract: The yeast Candida glabrata is often associated with the ability to cause opportunistic disease in humans. However, some strains of this species have a high ethanol production capacity and can endure the harsh growing conditions of fermentation. There have been previous studies on the ability to use C. glabrata for industrial bioethanol production. With the ability to ferment and a tolerance toward high concentration of ethanol, C. glabrata may unknowingly contaminate the glutinous rice fermention process. In this study, we isolated a budding yeast colony from a fermented glutinous rice product and identified it as C. glabrata RN4. The strain RN4 has similar morphological characteristics and cell shape to the baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae when grown on an agar plate and under microscopy. RN4 possesses the features of flocculation (cell-cell adhesion) and agar surface adhesion, which are similar to some well-known strains of S. cerevisae. RN4 has the ability to ferment via production of CO2. This strain can grow at especially high concentrations of ethanol (up to 7%). The successful isolation of a strain of C. glabrata from a traditional fermented product indicates that it is necessary to have strict control on the quality of hand-made fermented glutinous rice products in order to avoid contamination of harmful yeasts that can cause opportunistic diseases. Keywords: Candida glabrata, Saccharomyces cerevisiae, fermented glutinous rice. 1University of Science, Vietnam National University, Hanoi 2Center of Experimental Biology, National Center for Technological Progress *Email: tuantran@vnu.edu.vn