Phân tích mức độ biểu hiện của gen MeNF-YC đáp ứng đa yếu tố bất lợi phi sinh học ở cây sắn (Manihot esculenta) bằng công cụ tin sinh học

BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ 4 DOI: 10.15625/vap.2020.00052 PHÂN TÍCH MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GEN MeNF-YC ĐÁP ỨNG ĐA YẾU TỐ BẤT LỢI PHI SINH HỌC Ở CÂY SẮN (Manihot esculenta) BẰNG CÔNG CỤ TIN SINH HỌC Chu Đức Hà1,*, Nguyễn Thị Thu Trang1, 2, Phạm Phương Thu3, Lê Thị Ngọc Quỳnh4, Mai Đức Chung1, La Việt Hồng3, Nguyễn Văn Lộc2, Nguyễn Quốc Trung2, Phan Hữu Tôn2 Tóm tắt: Trong nghiên cứu này, đa ̣c tińh lý hóa của tiểu phàn MeNF-YC và thông tin về mức đo ̣ biểu hiê ̣n của các gen MeNF-YC đã được phân tićh và làm rõ trên cây sán (Manihot esculenta) thông qua các công cụ tin sinh học. Phân tićh trên ExPASY Protparam cho tháy họ MeNF-YC có kićh thước và trọng lượng phân tử rát đa dạng. Họ MeNF-YC có tińh ưa nước, giá tri ̣điểm đảng điê ̣n của hàu hết protein ở ngưỡng axit. Tiếp thêo, đoạn triǹh tự 1000 bp trên vùng promoter của phàn lớn các gen MeNF-YC có it́ nhát 1 yếu tó điều hòa cis- đáp ứng hormone và/hoa ̣c bát lợi. Đa ̣c biê ̣t, chúng tôi đã xác điṇh được mo ̣ t só gen MeNF-YC có đáp ứng với bát lợi phi sinh học dựa trên khai thác dữ liê ̣u phiên mã. Kết quả của nghiên cứu này đã bỏ sung những dãn liê ̣u tin ca ̣y cho viê ̣c kiểm chứng chức năng gên MeNF-YC liên quan đến chóng chiụ trên cây sán. Từ khóa: Biểu hiê ̣n gen, nuclear factor - YC, sán, tin sinh học. 1. MỞ ĐẦU Sắn (Manihot esculenta) là cây lấy củ quan trọng, được trồng rộng rãi trên thế giới, như ở khu vực Nam Mỹ và rất nhiều nước Châu Á (Philippin, Ấn Độ, Indonexia, Thái Lan, Trung Quốc và Việt Nam (Morgan & Choct, 2016). Được trồng chủ yếu làm thức ăn, nguyên liệu chế biến và nhiên liệu sinh học, sắn được đánh giá cây trồng “tỷ đô”, đóng góp không nhỏ cho nền kinh tế ở các nước đang phát triển. Vì vậy, phát triển ngành trồng sắn được xem là một trong những chiến lược quan trọng của nền nông nghiệp ở các nước Châu Á hiện nay. Tuy nhiên, một trong những thách thức hiện nay mà ngành trồng sắn gặp phải là tác động của biến đổi khí hậu. Để tiếp cận vấn đề này, cơ chế đáp ứng và chống chịu yếu tố bất lợi ở cây sắn được cho là liên quan đến sự điều hòa biểu hiện của các gen chức năng thông qua những nhóm nhân tố phiên mã. Trong đó, nuclear factor - Y (NF-Y), cấu tạo bởi 3 tiểu phần (NF-YA, -YB và -YC) được ghi nhận là một trong những nhóm nhân tố phiên mã đặc trưng ở thực vật, tham gia vào đáp ứng bất lợi trên cây trồng (Chu et al., 2018). 1Viê ̣n Di truyền Nông nghiê ̣p 2Học viê ̣n Nông nghiê ̣p Viê ̣t Nam 3Đại học Sư phạm Hà No ̣ i 2 4 Đại học Thủy lợi *Email: hachu_amser@yahoo.com PHẦN I. NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 417 Trong nghiên cứu trước đây, 14 thành viên của họ tiểu phần MeNF-YC ở sắn đã được xác định, định danh và phân tích cấu trúc gen (Chu Đức Hà và nnk., 2019). Tuy vậy, chức năng của các gen MeNF-YC vẫn chưa được làm rõ. Chính vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện nhằm làm sáng tỏ về các đặc tính cơ bản của protein, cấu trúc vùng promoter cũng như mức độ biểu hiện của gen mã hóa tiểu phần này trong các điều kiện bất lợi, từ đó định hướng cho các phân tích chức năng gen trong tương lai. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu Trình tự protein và trình tự gen của họ tiểu phần MeNF-YC ở sắn khai thác từ nghiên cứu trước đây (Chu Đức Hà và nnk., 2019). Dữ liệu hệ gen, hệ protein của giống sắn AM560-2 được khai thác trên NCBI (Bredeson et al., 2016). 2.2. Phương pháp nghiên cứu - Phân tích đặc tính cơ bản của protein: Các chỉ số lý hóa của protein được khai thác trên Expasy Protparam (Gasteiger et al., 2003). Trong đó, đặc điểm cấu trúc, bao gồm kích thước và trọng lượng phân tử, và một số đặc tính lý hóa, bao gồm điểm đẳng điện, chỉ số bất ổn định, chỉ số phân nhánh, độ ưa nước trung bình của protein được làm rõ theo mô tả trong nghiên cứu trước đây (Chu et al., 2018). - Truy xuất vùng promoter của gen: Đoạn trình tự 1000 bp ở vùng thượng nguồn của MeNF-YC, bắt đầu tính từ vị trí bộ ba mở đầu ATG được thu thập bằng cách BlastN đoạn gen mã hóa NF-YC vào hệ gen của sắn (Bredeson et al., 2016). Kết quả được sàng lọc bằng sự có mặt của hộp CAAT và TATA. - Dự đoán yếu tố điều hòa cis-: Vùng promoter của gen được truy vấn trên PlantCARE (Lescot et al., 2002) để xác định các yếu tố điều hòa cis-, bao gồm đoạn lặp giàu TC (G/ATTTTCTTA/CC/A) liên quan đến khả năng phòng thủ, LTRE (CCGAAA) đáp ứng lạnh, HSE (AAAAAATTTC) đáp ứng nóng, CE3 (CACGCG) đáp ứng hạn, ABRE (C/TACGTG) và CE3 (CACGCG) đáp ứng axit abscisic, yếu tố TGA (AACGAC) và yếu tố AuxRR đáp ứng auxin, TGACG và CGTCA motif đáp ứng axit jasmonic, ERE (ATTTCAAA) đáp ứng ethylene, GARE motif (TCTGTTG), P Box (GCCTTTTGAGT) và TATC Box đáp ứng gibberellin, và yếu tố TCA (C/GAGAAA/GAG/GG/TA) đáp ứng axit salicylic (Chu et al., 2018). - Khai thác ngân hàng biểu hiện gen: Thông tin về biểu hiện gen MeNF-YC ở các điều kiện khác nhau được khai thác trên GEO NCBI. Trong đó, chúng tôi khai thác dữ liệu GSE89971 (thiếu hụt dinh dưỡng NPK trên mẫu FEC), GSE93098 (xử lý PEG 6000 ở mẫu rễ, lá đỉnh, lá trung tâm, lá trưởng thành), GSE98537 (xử lý hạn ở mẫu lá) và GSE84715 (xử lý mặn ở mẫu rễ, lá). Dữ liệu được xử lý và thể hiện bằng bảng nhiệt màu thông qua ngôn ngữ R (Liao et al., 2019). Theo đó, mức độ biểu hiện của gen được xác định theo giá trị Fold-change (FC), gen có đáp ứng mạnh được định nghĩa là gen có giá trị FC ≥ 1,5. 418 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân tích đặc tính lý hóa của họ tiểu phần MeNF-YC ở sắn Để khai thác đặc tính lý hóa của MeNF-YC ở sắn, trình tự protein tương ứng đã được sử dụng để phân tích trên Expasy Protparam (Gasteiger et al., 2003). Theo đó, MeNF-YC01 là tiểu phần có kích thước nhỏ nhất (117 axit amin, tương ứng 12,76 kDa), trong khi MeNF-YC10 có chiều dài lớn nhất (311 axit amin, tương ứng 34,01 kDa) (Bảng 1). Phân tích giá trị điểm đẳng điện cho thấy họ NF-YC ở sắn chủ yếu ở trong khoảng axit (<7), chỉ có 3 protein, MeNF-YC01, -YC05 và -YC11 có điểm đẳng điện trong khoảng bazơ (>7) (Bảng 1). Bảng 1. Đặc tính lý hóa của tiểu phần MeNF-YC ở sắn NF-YC L mW pI II AI GRAVY MeNF-YC01 117 12,76 8,85 46,35 88,38 -0,16 MeNF-YC02 201 23,36 5,74 60,69 92,14 -0,36 MeNF-YC03 281 31,29 4,85 41,52 74,89 -0,73 MeNF-YC04 254 28,22 5,62 66,09 73,86 -0,52 MeNF-YC05 227 25,90 9,28 66,01 55,86 -1,23 MeNF-YC06 303 33,43 5,16 41,76 64,42 -0,82 MeNF-YC07 229 24,90 5,16 58,84 70,83 -0,44 MeNF-YC08 265 29,63 5,34 68,55 66,34 -0,52 MeNF-YC09 259 28,91 5,91 55,51 69,00 -0,58 MeNF-YC10 311 34,01 5,07 54,91 69,77 -0,74 MeNF-YC11 139 15,69 9,93 54,38 84,17 -0,58 MeNF-YC12 266 29,89 5,63 64,69 64,21 -0,61 MeNF-YC13 246 27,07 5,32 58,73 72,64 -0,44 MeNF-YC14 257 28,71 5,97 68,11 72,61 -0,58 Ghi chú: L - kích thước (aa), mW - trọng lượng phân tử (kDa), pI - điểm đẳng điện, II - chỉ số bất ổn định, AI - chỉ số phân nhánh, GRAVY - độ ưa nước trung bình. Chỉ số bất ổn định của tất cả thành viên của họ NF-YC ở sắn đều > 40 (Bảng 1), cho thấy các tiểu phần MeNF-YC có cấu trúc không bền vững trong điều kiện in vitro. Trong nghiên cứu trước đây, một số thành viên của tiểu phần NF-YC ở đậu gà (Cicer arietinum) đã được dự đoán sau khi được tạo thành từ quá trình dịch mã sẽ kết hợp với 2 tiểu phần NF-YA và NF-YB để tạo thành phức hợp NF-Y (Chu Đức Hà và nnk., 2020), từ đó tham gia vào cơ chế đáp ứng bất lợi (như hạn) (Chu et al., 2018). Điều này cho thấy MeNF-YC cũng không tồn tại độc lập và bền vững mà tương tác với 2 tiểu phần MeNF-YA và MeNF-YB để hình thành phân tử MeNF-Y hoàn chỉnh, tham gia vào điều hòa sự biểu hiện của gen chức năng. Ngoài ra, chỉ số phân nhánh của MeNF-YC trải dài từ 55,86 (MeNF- YC05) đến 92,14 (MeNF-YC02) (Bảng 1). Tất cả MeNF-YC đều có độ ưa nước trung bình < 0, chứng tỏ tiểu phần NF-YC ở sắn có tính ưa nước, tương tự như ở các loài thực vật khác. PHẦN I. NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 419 3.2. Dự đoán yếu tố điều hòa cis- trên vùng promoter của gen MeNF-YC ở sắn Sự có mặt của yếu tố điều hòa cis- có thể cung cấp những dẫn liệu khoa học tin cậy cho việc dự đoán chức năng gen. Trong nghiên cứu này, các yếu tố điều hòa cis- liên quan đến (i) tín hiệu hormone, như auxin (yếu tố TGA, yếu tố AuxRR), axit abscisic (CE3, ABRE), axit methyl jasmonic (TGACG motif, CGTCA motif), ethylene (ERE), gibberellin (GARE motif, P Box, TATC Box) và axit salicylic (yếu tố TCA), (ii) đáp ứng bất lợi, như nhiệt độ cao (HSE), hạn (MBS), lạnh (LTRE) và liên quan đến (iii) cơ chế phòng thủ (đoạn lặp giàu TC) (Hình 1). Hình 1. Sự phân bố của các yếu tố điều hòa cis- trên promoter của MeNF-YC Kết quả cho thấy các nhóm yếu tố cis- phân bố rất đa dạng trên vùng promoter của các gen mã hóa tiểu phần NF-YC, gợi ý rằng MeNF-YC có thể tham gia vào quá trình điều hòa thông qua tín hiệu hormone và cơ chế đáp ứng bất lợi. Phần lớn các gen MeNF-YC (13 trên tổng số 14) chứa ít nhất một nhóm yếu tố điều hòa cis- liên quan đến tín hiệu hormone (Hình 1). Cụ thể, gen MeNF-YC08 chứa nhiều nhóm yếu tố cis- nhất, bao gồm ABRE, yếu tố AuxRR, CGTCA motif, P Box và yếu tố TCA, cho thấy gen này có thể tham gia vào quá trình điều hòa thông qua các con đường tín hiệu phụ thuộc vào axit abscisic, auxin, axit jasmonic, gibberellin và axit salicylic. Vùng promoter của gen MeNF- YC10 chứa các yếu tố cis- liên quan đến 3 hormone, trong khi MeNF-YC01, -YC04, -YC05 và -YC14 chứa nhóm yếu tố điều hòa liên quan đến 2 hormone (Hình 1). Tiếp theo, kết quả cũng ghi nhận sự xuất hiện của nhiều nhóm yếu tố cis- liên quan đến đáp ứng bất lợi trên vùng promoter của họ gen mã hóa NF-YC ở sắn. Cụ thể, ít nhất 1 yếu tố cis- liên quan đến đáp ứng hạn (MBS), nóng (HSE), lạnh (LTRE) hoặc phòng thủ (đoạn lặp giàu TC) phân bố trên vùng promotern của 12 trên tổng số 16 gen MeNF-YC (Hình 1). Trong đó, MeNF-YC01, -YC08 và -YC10 chứa cả đoạn lặp giàu TC và MBS (Hình 1), chứng tỏ các gen này có thể liên quan đến đáp ứng hạn, trong khi 3 gen, MeNF- YC02, -YC03, -YC04 chỉ chứa yếu tố HSE (Hình 1), cho thấy nhóm gen này có thể tham gia vào cơ chế chống chịu nóng. Bốn gen, bao gồm MeNF-YC05, -YC06, -YC07 và -YC12 không chứa nhóm yếu tố điều hòa cis- liên quan đến đáp ứng bất lợi. 3.3. Khai thác dữ liệu biểu hiện gen MeNF-YC trong các điều kiện xử lý bất lợi Để tìm hiểu về biểu hiệu của các gen MeNF-YC, các dữ liệu phiên mã trong các điều kiện bất lợi phi sinh học đã được khai thác và phân tích. Trong điều kiện thiếu hụt NPK 420 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM (GSE89971), hầu hết các gen MeNF-YC đều biểu hiện yếu (FC <1,5), ngoại trừ MeNF- YC10 có đáp ứng ở mẫu mô FEC (Hình 2A). Kết quả này cho thấy họ gen MeNF-YC ít liên quan đến cơ chế điều hòa trong điều kiện thiếu hụt dinh dưỡng tại mô FEC ở sắn. Trong điều kiện xử lý mặn (GSE84715), MeNF-YC03 và -YC07 có biểu hiện mạnh ở cả lá và rễ (Hình 2B). Bên cạnh đó, một số gen, như MeNF-YC10 và -YC14 cũng có xu hướng tăng cường biểu hiện ở lá và rễ, trong khi hai gen, MeNF-YC05 và -YC11 lần lượt có biểu hiện tương đối mạnh ở rễ và lá (Hình 2B). Hình 2. Mức độ biểu hiện của họ gen MeNF-YC ở sắn trong điều kiện (A) thiếu hụt NPK, (B) mặn, (C) hạn và (D) xử lý PEG 6000 Trong điều kiện xử lý hạn ở mẫu lá (GSE98537), hầu hết các MeNF-YC đều có đáp ứng mạnh (Hình 2C). Kết quả này phù hợp với phân tích về sự có mặt của các nhóm yếu tố điều hòa cis- trên vùng promoter của MeNF-YC (Hình 1). Cụ thể, bảy gen, bao gồm MeNF-YC02, -YC03, -YC04, -YC06, -YC08, -YC09 và -YC10 có mức độ phiên mã tăng ở mẫu lá xử lý hạn (Hình 2C). Xem xét dữ liệu GSE93098 liên quan đến xử lý các mẫu sắn trong PEG 6000, hầu hết các thành viên trong họ MeNF-YC có xu hướng đáp ứng ở mẫu rễ và lá đỉnh (Hình 2D). Cụ thể, 12 trên 16 gen MeNF-YC được tăng cường biểu hiện ở mẫu rễ và/hoặc lá đỉnh khi xử lý với PEG 6000 (Hình 2D), Ở mẫu lá trung tâm xử lý với PEG 6000, chỉ có gen MeNF-YC12 có xu hướng biểu hiện tăng, trong khi các gen còn lại hầu như không có đáp ứng (Hình 2D). Tương tự, chỉ có 4 gen, bao gồm MeNF-YC02, - YC04, -YC08 và -YC12 được tăng cường biểu hiện ở mẫu lá trưởng thành xử lý với PEG 6000 (Hình 2D). Tóm lại, nghiên cứu này đã chỉ ra rằng các gen MeNF-YC có thể tham gia vào nhiều cơ chế đáp ứng bất lợi phi sinh học ở cây sắn. 4. KẾT LUẬN Tiểu phần MeNF-YC ở sắn có kích thước từ 117-311 axit amin, tương đương 12,76 đến 34,01 kDa, không có tính ổn định trong điều kiện in vitro, có tính ưa nước. Mười một trên 14 protein có điểm đẳng điện ở khoảng axit. Mười ba trên 14 gen MeNF-YC chứa ít nhất 1 nhóm yếu tố điều hòa cis- liên quan đến tín hiệu hormone và/hoặc đáp ứng bất lợi. Gen MeNF-YC08 chứa nhóm yếu tố cis- liên quan đến con đường tín hiệu và đáp ứng bất lợi nhất. Gen MeNF-YC10 có đáp ứng mạnh ở FEC trong điều kiện thiếu hụt NPK. Biểu hiện của MeNF-YC03 và -YC07 ở lá và rễ đáp ứng với điều kiện mặn. Bảy trên 16 gen PHẦN I. NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 421 MeNF-YC được tăng cường biểu hiện ở lá trong điều kiện hạn. Gen MeNF-YC04 và -YC12 có biểu hiện đáp ứng ở các mô trong điều kiện xử lý PEG 6000. Nghiên cứu này sẽ được tiếp tục nhằm kiểm tra biểu hiện gen MeNF-YC bằng thực nghiệm, từ đó làm rõ chức năng của gen liên quan đến cơ chế chống chịu đa yếu tố bất lợi ở cây sắn. TÀI LIỆU THAM KHẢO Chu Đức Hà, Nguyễn Đức Anh, Hoàng Thị Thao, Phạm Thị Lý Thu, Phạm Phương Thu, Chu Thùy Dương, Nguyễn Thị Thu Phương, Phạm Xuân Hội, 2019. Xác định và đánh giá mức độ biểu hiện của họ gen mã hóa tiểu phần nuclear factor-YC ở cây sắn (Manihot esculenta). Tạp chí Khoa học & Công nghệ Việt Nam, 61(7): 56-59. Chu Đức Hà, Lê Thị Ngọc Quỳnh, 2020. Nghiên cứu tương tác và khai thác dữ liệu biểu hiện giữa các tiểu phần của yếu tố nhân Y ở loài đậu gà (Cicer arietinum). Tạp chí Khoa học & Công nghệ - Đại học Thái Nguyên, 225(01): 11-16. Bredeson J. V., Lyons J. B., Prochnik S. E., Wu G. A., Ha C. M., Edsinger-Gonzales E., Schmutz J., Rabbi I. Y., Setter T. L., Gleadow R. M., Kulakow P., Ferguson M., Rounsley S., Rokhsar D. S., 2016. Sequencing wild and cultivated cassava and related species reveals extensive interspecific hybridization and genetic diversity. Nat. Biotechnol., 34(5): 562-570. Chu H. D., Nguyen K. H., Watanabe Y., Le D. T., Mochida K., Tran L. P., 2018. Identification, structural characterization and gene expression analysis of members of the nuclear factor-Y family in chickpea (Cicer arietinum L.) under dehydration and abscisic acid treatments. Int. J. Mol. Sci., 19 (11): 3290. Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R. D., Bairoch A., 2003. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res., 31(13): 3784-3788. Lescot M., Déhais P., Thijs G., Marchal K., Moreau Y., Rouzé P., Rombauts S., 2002. PlantCARE, a database of plant cis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences. Nucleic Acids Res., 30(1): 325-327. Liao Y., Smyth G. K., Shi W., 2019. The R package Rsubread is easier, faster, cheaper and better for alignment and quantification of RNA sequencing reads. Nucleic Acids Res., 47(8): e47- e47. Morgan N. K., Choct M., 2016. Cassava: Nutrient composition and nutritive value in poultry diets. Anim. Nutr., 2(4): 253-261. 422 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM EXPRESSION ANALYSES OF THE MeNF-YC GENES UNDER VARIOUS ABIOTIC STRESSES IN CASSAVA (Manihot esculenta) USING BIOINFORMATICS APPROACH Chu Duc Ha1, Nguyen Thi Thu Trang1, 2, Pham Phuong Thu3 Le Thi Ngoc Quynh4, Mai Duc Chung1, La Viet Hong3 Nguyen Van Loc2, Nguyen Quoc Trung2, Phan Huu Ton2 Abstracts: In this study, the theoretically physic-chemical properties of the MeNF-YC subunits and the expression patterns of these corresponding genes have been analyzed in cassava (Manihot esculenta) based on various bioinformatics methods. According to the ExPASY Protparam, we found that the MeNF-YCs are highly variable in sizes and molecular weights. The MeNF-YC proteins are hydrophilic and the isoelectric points of the majority of MeNF-YCs are acidic. Next, the 1000-bp-upstream promoter regions of most MeNF-YCs contain at least one type of cis- regulatory element related to the hormone and/or stress responsiveness. Of our interest, several MeNF-YC genes are induced under the abiotic stress conditions based on previous transcriptome atlases. Taken together, our study could provide reliable information for further functional characterization of MeNF-YC genes associated with stress tolerance in cassava. Keywords: Bioinformatics, cassava, expression profile, nuclear factor-YC. 1Agricultural Genetics Institute 2Vietnam National University of Agriculture 3Hanoi Pedagogical University 2 4Thuyloi University *Email: hachu_amser@yahoo.com