Phân tích thành phần các saponin chính trong sâm Việt Nam nuôi cấy mô bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 579 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CÁC SAPONIN CHÍNH TRONG SÂM VIỆT NAM NUÔI CẤY MÔ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Hoàng Hải Anh*, Nguyễn Minh Cang*, Nguyễn Minh Đức* TÓM TẮT Mục tiêu: Phân tích thành phần các saponin chính trong Sâm Việt Nam nuôi cấy mô bằng phương pháp Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Phương pháp: Sử dụng phương pháp HPLC với cột Supelcosil RP-18 và hỗn hợp acetonitril – nước làm pha động, phân tách và định lượng các saponin chính có trong mẫu Sâm Việt Nam nuôi cấy mô, so sánh với Sâm Việt Nam tự nhiên. Kết quả: Qua phân tích, mẫu Sâm Việt Nam nuôi cấy mô có chứa các saponin chính trong thành phần saponin tương tự như Sâm Việt Nam tự nhiên nhưng với hàm lượng thấp hơn. Kết luận: Mẫu Sâm Việt Nam nuôi cấy mô khảo sát chứa các saponin chủ yếu có trong Sâm Việt Nam, có triển vọng nghiên cứu hoàn chỉnh để cung cấp nguồn sâm bổ sung. Từ khóa: Sâm Việt Nam, Sâm Việt Nam nuôi cấy mô, saponin, sắc ký lỏng hiệu năng cao. ABSTRACT HPLC ANALYSIS OF MAJOR SAPONINS IN BIO-CULTURED VIETNAMESE GINSENG Hoang Hai Anh, Nguyen Minh Cang, Nguyen Minh Duc * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 579 - 584 Objectives: to separate and quantitatively determine major saponins in bio-cultured products of Panax vietnamensis by HPLC. Methods: A reverse phase HPLC method using a Supelcosil RP-18 column and acetonitril–water mixture as mobile phase was used to separate and quantitatively determine major saponins in cultured Vietnamese Ginseng in comparison with the natural one. Results: The major saponins in Panax vietnamensis are also present in bio-cultured products, but in lower contents. Conclusion: The bio-cultured Vietnamese Ginseng contains most of the major saponins found in the natural one. It should therefore be a potential source of Vietnamese Ginseng in future. Keywords: Panax vietnamensis, bio-cultured Vietnamese Ginseng, saponin, HPLC. ĐẶT VẤN ĐỀ Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv. - Araliaceae) được phát hiện vào năm 1973 và được nghiên cứu một cách sâu rộng về nhiều phương diện như thực vật học, trồng trọt, hóa thực vật và dược lý học từ năm 1977. Các nghiên cứu cho thấy rằng Sâm Việt Nam là một trong những dược liệu độc đáo, quý giá của nước ta với nhiều đặc tính dược lý và tác động trị liệu có thể so sánh với sâm Triều Tiên(3,4). Những năm gần đây nguồn Sâm Việt Nam tự nhiên đang bị khai thác trái phép, nuôi trồng chưa phát triển, khiến Sâm Việt Nam đang đối mặt với nguy cơ cạn kiệt. Việc phát triển *Khoa Dược – Đại Học Y Dược TPHCM Tác giả liên lạc: GS. TS. Nguyễn Minh Đức ĐT: 0908989865 Email: ducng@hcm.vn.vnn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 580 phương pháp nuôi cấy Sâm Việt Nam bằng công nghệ sinh học sẽ đóng góp nguồn Sâm Việt Nam cho trồng trọt và sử dụng làm thuốc. Tuy nhiên, chất lượng của sâm nuôi cấy mô còn là một dấu hỏi. Mục tiêu của đề tài này là áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao(1,2) để phân tích thành phần các saponin chính có trong Sâm Việt Nam nuôi cấy mô so sánh với Sâm Việt Nam thiên nhiên. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu Mẫu Bộ phận dùng Độ ẩm Nguồn cung cấp Sâm Việt Nam (SVN) Rễ củ 6,56% Sở Y tế Kontum Sâm Việt Nam nuôi cấy mô (SVN NCM) Căn hành: 60% Tiền cây con: 20% Plbs1: 20% 10,88% Công ty TNHH Quốc tế Hoàng Gia (*) (*): 30/70/9, đường D2, phường 25, quận Bình Thạnh, Tp. HCM. Phương pháp nghiên cứu Hóa chất và dụng cụ máy móc Chất chuẩn: các saponin chuẩn, gồm: G-Rb1, G-Rg1, G-Rd, G-Re, N-R1, M-R2 do Ban Nghiên Cứu Khoa Học – Khoa Dược cung cấp, có độ tinh khiết > 97%. Resin pha đảo Diaion HP-20 (styren divinyl copolymer resin) của Mitsubishi Chemicals Co. (Nhật Bản). Máy HPLC LC-10 AD – Shimadzu, Nhật Bản, cột Supelcosil RP-C18 (150 x 4,6 mm, 5,0 µm), kèm theo cột bảo vệ Supelguard (20 x 4,6 mm), detector photodiode array (SPD-M10A VP – Shimadzu, Nhật Bản) đặt ở bước sóng 203 nm hoặc detector RI, tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. Định tính sơ bộ bằng sắc ký lớp mỏng Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử: hòa tan các chất chuẩn hoặc cắn saponin vào methanol. Điều kiện sắc ký Bản mỏng tráng sẵn silica gel F254 (Merck). Hệ dung môi: CHCl3-MeOH-H2O (65: 35:10, lớp dưới). Thuốc thử hiện màu: H2SO4 20%/EtOH 50%, sấy ở 105oC đến khi hiện màu. Xây dựng đường chuẩn từ các saponin chuẩn Xây dựng đường chuẩn biểu diễn sự tương quan nồng độ chất chuẩn với diện tích đỉnh bằng cách bơm vào máy HPLC các lượng ước phân của từng dung dịch chuẩn với nồng độ thích hợp [saponin (mg/ml)]: G-Rb1 (1,85), G-Rg1 (1,65), G-Rd (1,0), G-Re (0,7), N-R1 (1,5), M-R2 (3,1). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 581 Quy trình phân tích bằng HPLC Dịch H2O (hợp chất đường) Mẫu dược liệu Dịch MeOH - Sấy ở nhiệt độ 60 ± 5oC trong 2-3 giờ - Nghiền thành bột khá mịn (cân chính xác khoảng 3 g) - Chiết bằng MeOH - Chiết Soxhlet Kiểm tra bằng SKLM (đảm bảo chiết hết saponin) - Lọc và cô chân không đến cắn (toC ≤ 50oC) - Cân cắn thu được, cho một lượng thích hợp vào cột diaion HP-20 (2,5 x 30 cm) - Chiết xuất lần lượt bằng nước, MeOH, CHCl3 Dịch MeOH (hợp chất saponin) Dịch CHCL3 (hợp chất béo) H2O MeOH CHCL3 Cô chân không (toC ≤ 50oC) Cắn saponin - Cân chính xác 5 mg cắn - Hòa tan trong 1 ml MeOH - Lọc qua lọc 0,45 μm - Bơm vào máy HPLC (20 μl) Sắc ký đồ KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết quả phân tích bằng SKLM Phân tích sơ bộ bằng SKLM cho thấy, sắc đồ SKLM của SVN NCM xuất hiện các vết tương tự như SVN, các vết saponin tương ứng với các vết của saponin chuẩn. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 582 Hình 1. Sắc đồ SKLM của SVN và SVN NCM SVN: Sâm Việt Nam; SVN NCM: Sâm Việt Nam Bảng 1. Kết quả SKLM so sánh SVN và SVN NCM Rf SVN NCM SVN G-Rb1 0,22 x x G-Re 0,30 x x N-R1 0,32 x x G-Rd 0,35 x x G-Rg1 0,44 x x M-R2 4,48 x x x: có xuất hiện vết. Nhận xét: Trên sắc đồ SKLM, SVN NCM cho các vết tương ứng với các saponin chủ yếu có trong SVN gồm G-Rb1, G-Rg1, G-Rd, G-Re, N-R1 và M-R2. Kết quả xây dựng đường chuẩn Hình 2. Đường chuẩn G-Rb1 Hình 3. Đường chuẩn G-Rg1 Hình 4. Đường chuẩn G-Rd Hình 5. Đường chuẩn G-Re Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 583 Hình 6. Đường chuẩn N-R1 Hình 7. Đường chuẩn M-R2 Kết quả phân tích bằng HPLC Kết quả định tính Hệ dung môi 1: CH3CN-H2O (30: 70) Trong điều kiện HPLC đã mô tả, có thể tách được các saponin G-Rb1 và G-Rd với thời gian lưu tương đối (phút) theo thứ tự là 20,1 và 48,2. Tuy nhiên, hai đỉnh của G-Rg1 và G-Re trùng nhau, rất gần với đỉnh của N-R1. Hệ dung môi 2: CH3CN-H2O (20: 80) Với hệ dung môi này, có thể tách được G- Rg1 ra khỏi G-Re với thời gian lưu tương đối (phút) theo thứ tự là 30,1 và 33,1. Cũng ở điều kiện này thời gian lưu tương đối của N-R1 là 22,1. Hệ dung môi 3: CH3CN-H2O (24: 76) Phát hiện MR2: Pha động: acetonitril – nước (24:76). Detector: Refractive Index (nhiệt độ: 30oC, độ nhạy: 9, P: 133). Với điều kiện như trên, MR2 có thể được tách ra khỏi G-Rg1 và G-Re với thời gian lưu tương đối (phút) là 15,1. Kết quả định lượng Bảng 6. Kết quả định lượng các saponin chính trong SVN và SVN NCM Hàm lượng saponin chính (%) Mẫu GRb1 GRg1 GRd GRe NR1 MR2 Tổng cộng SVN 2,51 2,57 1,22 0,16 0,53 5,97 12,96 SVN NCM x 0,013 x 0,15 0,015 0,12 0,30 x: hàm lượng quá ít, trị số đáp ứng đỉnh quá nhỏ. Kết quả định lượng cho thấy, mẫu SVN NCM có chứa các saponin chính tương tự như SVN nhưng hàm lượng các saponin này chưa cao, có thể do ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy và thời gian nuôi cấy. KẾT LUẬN Bằng phương pháp SKLM và HPLC pha đảo, chúng tôi đã phân tích được các thành phần saponin chính trong mẫu nguyên liệu Sâm Việt Nam nuôi cấy mô. Kết quả cho thấy, Sâm Việt Nam nuôi cấy mô cũng có các saponin chính tương tự như Sâm Việt Nam tự nhiên, gồm G- Rb1, G-Rg1, G-Rd, G-Re, N-R1 và M-R2. Tuy hàm lượng tổng cộng các saponin chính trong Sâm Việt Nam nuôi cấy mô chưa cao (0,3% so với 12,96% trong Sâm Việt Nam thiên nhiên), kết quả ban đầu là hết sức khích lệ vì sản phẩm nuôi cấy mô không dừng ở dạng sinh khối (callus) mà đã phát triển thành căn hành và tiền cây. Việc nghiên cứu hoàn chỉnh Sâm Việt Nam nuôi cấy mô có thể đưa đến việc cung cấp nguồn cây sâm cho trồng trọt và sử dụng như nguyên liệu để thay thế sâm thiên nhiên. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu năng cao và một số ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu và hợp chất tự nhiên, NXB Y học, Chi nhánh Tp. HCM, tr.49-126, tr.218-232. 2. Nguyen Minh Duc, Nguyen Minh Cang, Nguyen Duc Dieu Trang (2001), “Quantitative determination of major saponin contents of cultivated vietnamese ginseng – Panax vietnamensis Ha et Grushv.-Araliaceae- by HPLC”, Proceedings Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 584 of Pharma indochina II, 20-23 Nov 2001, Hanoi, Vietnam, 247- 251. 3. Nguyễn Thượng Dong, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hương (2007), Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ Nhân Sâm, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr.15-22, tr.41, tr.99-105, tr.110-119, tr.126-130. 4. Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập II, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr.446-455, tr.704-710, tr.775-779.