Phân tích và nhân dòng gen Lipl21 mã hóa cho protein màng từ năm chủng Leptospira spp. phân lập tại Việt Nam

BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ 4 DOI: 10.15625/vap.2020.00054 PHÂN TÍCH VÀ NHÂN DÒNG GEN Lipl21 MÃ HÓA CHO PROTEIN MÀNG TỪ NĂM CHỦNG Leptospira spp. PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Nguyễn Tuấn Hùng1,3#, Đặng Thị Quỳnh2,3#, Nghiêm Ngọc Minh2,3, Võ Thị Bích Thuỷ2,3,* Tóm tắt: Protein LipL21 là một lipoprotein trong vi khuẩn Leptospira, lipoprotein này không gây độc nhưng có khả năng gây đáp ứng miễn dịch cao. Do đó, LipL21 được xem là protein kháng nguyên bề mặt phù hợp để sản xuất vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh xoắn khuẩn vàng da do vi khuẩn Leptospira gây nên. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành phân tích và nhân dòng gen LipL21 mã hóa cho protein LipL21 xuất hiện trên năm chủng Leptospira có mặt tại Việt Nam. Gen LipL21 được phân tích và lựa chọn vùng gen giàu epitope. Vùng gen giàu epitope sau đó được gắn vào vector nhân dòng pJET1.2 và biến nạp vào chủng E.coli DH10b. Kết quả này phục vụ cho việc biểu hiện và tinh chế thu nhận protein LipL21 có tiềm năng ứng dụng phát triển vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh xoắn khuẩn vàng da. Từ khóa: E.coli DH10b, Leptospira, LipL21, pJET1.2. 1. MỞ ĐẦU Bệnh leptospirosis (bệnh xoắn khuẩn vàng da) là một bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng, lan truyền từ động vật sang người gây ra bởi các chủng vi khuẩn Leptospira (André-Fontaine, 2006; Bharti et al., 2003; Palaniappan et al., 2007), được Tổ chức Sức khỏe động vật thế giới (World Organisation for Animal Health-OIE) xếp vào nhóm thứ 2 của bệnh nguy hiểm (Office International Des Epizooties, 2008) và được bổ sung vào nhóm bệnh nghề nghiệp ở Việt Nam (Tổng Liên đoàn Lao động Việt Nam, 1991). Ở nước ta, bệnh leptospirosis lần đầu được phát hiện trên người năm 1931. Đến nay, bệnh đã có mặt ở tất cả các vùng miền trong cả nước. Tổng số trường hợp mắc xoắn khuẩn được ghi nhận tại Việt Nam giai đoạn 2002-2011 là 369 ca và không có trường hợp tử vong. Tỷ suất mắc xoắn khuẩn trung bình trong 10 năm nghiên cứu là 0,05 ca/100.000 dân/năm trong đó tỷ suất mắc cao nhất vào năm 2004 với 0,25 ca/100.000 dân/năm. Tây Bắc Bộ và Bắc Trung Bộ là hai vùng sinh thái tập trung nhiều nhất số trường hợp mắc Leptospira (Lê Thị Thanh Xuân et al., 2015). Xoắn khuẩn Leptospira là một loại xoắn khuẩn Gram âm có kích thước nhỏ, dạng mảnh, đường kính 0,1-0,2 µm, dài 4-20 µm. Với những nghiên cứu ban đầu vào năm 1907, Stimson đã chia chi Leptospira thành 2 nhóm: Leptospira biflexa không gây bệnh và Leptospira interrogans gây bệnh cho người và động vật dựa trên độc lực của chúng (Stimson, 1970). Gần đây, phân tích gen di truyền cho thấy Leptospira có thể được chia thành 20 loài: 9 loài gây bệnh (L. interrogans, L. kirschneri, L. borgpeterenii, L. 1Công ty Cổ phần Thuốc thú y Trung ương VETVACO 2Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 3Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam #Các tác giả có đóng góp ngang nhau trong nghiên cứu *Email: [email protected] 432 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM santarosai, L. noguchii, L. weilii, L. alexanderi, L. alstoni và L. kmetyi), 6 loài hoại sinh (L. biflexa, L. wolbachii, L. meyeri, L. vanthielii, L. terpstrae và L. yanagawae), 5 loài trung gian (L. absai, L. broomii, L. fainei, L. wolffii và L. licerasiae) (Perolat et al., 1998). Trong gần một thế kỷ nay, vắc xin chống lại bệnh leptospirosis được sử dụng là loại vắc xin vô hoạt hoặc nhược độc. Các chế phẩm vắc xin này tiêu diệt vi khuẩn rất hiệu quả trong môi trường đặc hiệu. Tuy nhiên, những loại vắc xin này cũng có nhiều hạn chế như tác dụng phụ nghiêm trọng (đau, buồn nôn, sốt), sự đáp ứng miễn dịch ngắn hạn và việc hạn chế số lượng serovar tương thích với vắc xin (Faine et al., 1999). Trong khi vi khuẩn liên tục biến đổi, thì các loại vắc xin phổ thông không chống được serovar lạ, đòi hỏi cần có một giải pháp mới. Trong một thập kỉ qua, các nghiên cứu về vắc xin tái tổ hợp đã mở ra một hướng mới trong việc sản xuất vắc xin có khả năng đáp ứng miễn dịch cao và không gây độc cho cơ thể vật chủ. Vắc xin tái tổ hợp được phát triển bởi các liệu pháp miễn dịch đặc hiệu dựa trên kháng nguyên tái tổ hợp, đặc biệt là các epitope. Các epitope (hay còn gọi là quyết định kháng nguyên) là vị trí cấu trúc trên một kháng nguyên tương tác trực tiếp với kháng thể hoặc thụ thể tế bào T (Wang & Yu, 2004). Các epitope có thể được chia thành hai nhóm: epitope tế bào T gây miễn dịch tế bào và epitope tế bào B gây miễn dịch dịch thể (Malm et al., 2005). Đặc biệt, các epitope tế bào B được nghiên cứu để phát triển vắc xin tái tổ hợp (Peng et al., 2008). Vắc xin tái tổ hợp được phát triển dựa trên các gen gây đáp ứng miễn dịch cao được bảo tồn trong các chủng Leptospira gây bệnh như LipL32, LipL41, OmpL1, LigA và gen yếu tố độc lực như Loa22 (Guerreiro et al., 2001; Haake et al., 2000; Haake et al., 1999; Palaniappan et al., 2002). Lớp màng của xoắn khuẩn L. interrogans gồm có lớp lipopolysaccaride (LPS), các lipoprotein LipL21, Loa22, LigA và các protein xuyên màng như FecA, OmpL1. Những protein màng là protein có độ bảo tồn cao về mặt di truyền và có khả năng gây đáp ứng miễn dịch (Guerreiro et al., 2001; Haake et al., 1999). Dựa trên kết quả nghiên cứu trước đó của nhóm nghiên cứu, chúng tôi đã tìm ra gen LipL21 có mặt trong cả 6 chủng vi khuẩn Leptospira spp. hiện đang được sử dụng làm vắc xin Leptospora vô hoạt ở Việt Nam (Vo Thi Bich Thuy et al., 2018). Trong bài báo này, chúng tôi giới thiệu các kết quả về phân tích và nhân dòng gen mã hóa cho protein LipL21 (gen LipL21) từ năm chủng Leptospira spp. tại Việt Nam phục vụ cho nghiên cứu về chế tạo vắc xin tái tổ hợp phòng chống bệnh leptospirosis. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Vật liệu nghiên cứu được sử dụng là DNA tổng số của năm chủng vi khuẩn Leptospira interrogans bao gồm: Leptospira interrogans serovar Bataviae (L. Bataviae), Leptospira interrogans serovar Canicola (L. Canicola), Leptospira interrogans serovar Grippotyphosa (L. Grippotyphosa), Leptospira interrogans serovar Icterohaemorrhagiae (L. Icterohaemorrhagiae) và Leptospira interrogans serovar Pomona (L. Pomona) hiện đang được sử dụng làm vắc xin Leptospira vô hoạt do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương- Cục Thú y cung cấp. PHẦN I. NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 433 Vector pJET1.2/blunt (Thermo Fisher) có kích thước 2.974 bp chứa gen kháng Ampicillin (Amp), có khả năng chèn thêm một đoạn gen có kích thước từ 6 bp đến 10 kb. Vector pJET1.2/blunt được dùng để tạo plasmid pJET1.2-LipL21. Thiết kế cặp mồi và nhân gen LipL21 Năm chủng vi khuẩn Leptospira spp. sau khi nuôi đạt nồng độ khoảng 108 vi khuẩn/mL dịch nuôi sẽ được làm bất hoạt và chuyển về Viện Nghiên cứu hệ gen. DNA genome được tách bằng kit GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Thermo Fisher). Thông tin trình tự gen LipL21 được khai thác trên ngân hàng gen quốc tế NCBI. Dựa trên thông tin về gen LipL21 trên ngân hàng gen có mã số JQ228529.1 và sử dụng phần mềm Primer 3 để thiết kế cặp mồi nhân gen LipL21. DNA genome được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại toàn bộ đoạn gen LipL21 của 5 chủng Leptospira spp. Thành phần phản ứng PCR gồm: đệm 10X PCR: 2,5µl; dNTP (2,5mM): 2,5µl; mồi xuôi (10pmol/µl): 0,5µl; mồi ngược (10pmol/µl): 0,5µl; Taq DNA polymerase (5U/µl): 0,15µl; DNA khuôn: 1µl (200pmol/µl); nước cất vô trùng: 17,85µl. Phản ứng PCR được thực hiện trên máy với 25 chu kỳ: 95oC: 30 giây; 55oC: 30 giây; 72oC: 1 phút; kết thúc phản ứng ở 72oC trong 7 phút. Đoạn gen LipL21 sau tinh sạch và kiểm tra chất lượng được tiến hành giải trình tự trên máy giải trình tự ABI 3500. Trình tự gen LipL21 thu được được so sánh, phân tích bằng các phần mềm Bioedit, BLAST và MEGA 6.06 và chọn ra đoạn gen phù hợp để nhân dòng vào vector pJET1.2. Nhân dòng gen LipL21 Gen LipL21 được nhân bản từ DNA genome chủng L. Batavie với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế. Sản phẩm PCR thu được có kích thước tương ứng với kích thước lý thuyết được gắn vào vector nhân dòng pJET1.2 bằng kit CloneJET PCR Cloning Kit (Thermo Fisher). Vector tái tổ hợp chứa gen LipL21 sau đó được biến nạp vào chủng vi khuẩn E.coli chủng DH10b bằng phương pháp sốc nhiệt. Kết quả biến nạp vào E.coli của vector tái tổ hợp pJET1.2- LipL21 được kiểm tra bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu nhân gen LipL21. Đồng thời, các khuẩn lạc làm khuôn cho phản ứng PCR cho kết quả dương tính được nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung 50µg/ml kháng sinh Ampicillin qua đêm ở 37oC, lắc 200 vòng/phút. Tách DNA plasmid kiểm tra sự có mặt của gen LipL21 bằng cắt bởi enzyme giới hạn EcoRV và XhoI theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Thermo Fisher). Trình tự nucleotide của gen LipL21 được xác định bằng máy giải trình tự ABI 3500, sử dụng mồi pJET1.2 Forward. Trình tự nucleotide thu được được so sánh với trình tự gen LipL21 bằng công cụ Bioedit. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Thiết kế mồi đặc hiệu nhân gen LipL21 Trình tự của cặp mồi khuếch đại toàn bộ đoạn gen LipL21 được thiết kế (Bảng 1). Cặp mồi sẽ nhân lên đoạn nucleotide có chiều dài theo lý thuyết khoảng 861bp. Bảng 1. Trình tự mồi thiết kế nhân bản toàn bộ gen LipL21 Tên mồi Trình tự (5’-3’) Chiều dài (bp) Nhiệt độ bắt cặp LipL21-Fw AATGTGTTGCACAAACTCGGT 861 55°C LipL21-Rw AACGTCTCTATGGTTGTGATGC 434 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Với cặp mồi khuếch đại toàn bộ gen LipL21 đã được thiết kế, gen LipL21 đã được nhân bản từ DNA genome của năm chủng Leptospira (Hình 2). Kết quả điện di trên Hình 2 cho thấy, sản phẩm PCR chỉ có một băng duy nhất có kích thước khoảng 850bp, tương đương với kích thước của đoạn gen LipL21 theo lý thuyết. Hình 2. Kết quả điện di sản phẩm nhân bản toàn bộ gen LipL21 M: DNA marker 1kb (Thermo); Sản phẩm PCR nhân bản gen LipL21 từ DNA tổng số chủng L. Batavie (1); L. Canicola (2) L. Grippotyphosa (3); L. Icterohaemorrhagiae (4); L. Pomona (5); (-): Đối chứng âm Sản phẩm PCR LipL21 sau khi tinh sạch bằng kit GeneJETTM PCR Purification Kit (Thermo Fisher), đủ điều kiện sẽ được đem đi giải trình tự Sanger bằng máy giải trình tự ABI 3500 (Applied Biosystems, Singapore). Trình tự gen LipL21 của năm chủng Leptospira thu được từ máy giải trình tự sau khi được cắt gọt được so sánh với nhau bằng các phần mềm Bioedit, BLAST và MEGA 6.06. Sự so sánh này nhằm tìm kiếm những vùng khác biệt của các chủng, đồng thời xác định vùng bảo thủ giữa các chủng (Hình 4). Hình 4. Kết quả so sánh trình tự toàn bộ gen LipL21 của năm chủng Leptospira PHẦN I. NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 435 Kết quả so sánh trình tự nucleotit của gen LipL21 của năm chủng xoắn khuẩn cho thấy cả 5 chủng L. Bataviae, L. Canicola, L. Grippotyphosa, L. Icterohaemorrhagiae và L. Pomona đạt tỷ lệ tương đồng lên đến 99% giữa các chủng, chỉ có 6 vị trí sai lệnh, xuất hiện rải rác ở trên toàn bộ gen. Các vị trí sai khác lần lượt: 99 (L. Icterohaemorrhagiae), 171, 276, 279 (L. Canicola, L. Pomona), 324 (L. Pomona), 450 (L. Canicola, L. Grippotyphosa, L. Pomona). Sáu vị trí sai khác tìm thấy từ trình tự nucleotit không dẫn đến sự sai khác nào trong trình tự axit amin của năm chủng xoắn khuẩn. Điểm chung về cấu trúc 3D của năm chủng xoắn khuẩn được nghiên cứu sử dụng công cụ TM-score (Hình 5). Do trình tự axit amin là đồng nhất ở 5 chủng, do đó, ta có mô hình duy nhất biểu diễn cho cả 5 chủng. Hình 5. Cấu trúc 3D gen LipL21 của 5 chủng Leptospira Nhằm xác định các vùng giàu epitop trên các đoạn gen đã lựa chọn trên các gen LipL21. Các công cụ tin sinh khác nhau đã được sử dụng để dự đoán. Kết quả dự đoán được tổng hợp lại tại Bảng 2. Bảng 2. Trình tự các vùng giàu epitop được dự đoán của gen LipL21 STT Trình tự Độ dài (aa) Mở đầu Kết thúc Công cụ Tế bào lympho B gen LipL21 1 ETVESASGVSDGEAT 15 107 121 IEDB 2 RASGKAVAK 9 70 78 3 CKATGSGSDPKDVSKDNWE 19 141 159 4 EGWGGPPEQRNDGKTP 16 39 55 ABCPred 5 TGQKDATTVGDGGWTF 16 23 39 6 KKMVGETVESASGVSD 16 102 118 7 TGSGSDPKDVSKDNWE 16 144 160 8 VESASGVSDGEAT 12 109 121 BepiPred 9 KATGSGSDPKDVSKDNWE 18 141 159 10 ASDVVKKMVGETVESASGVS 20 97 116 SMVTriP Tế bào lympho T gen LipL21 436 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM STT Trình tự Độ dài (aa) Mở đầu Kết thúc Công cụ 11 ATTVGDGGW 9 28 36 NetMHC 12 TVGDGGWTF 9 30 38 13 GVVKGVGVY 9 131 139 14 GWGGPPEQR 9 40 48 15 IYAKFPGGK 9 165 173 16 DTNPKDWYY 9 57 65 NetCTL 17 ASDVVKKMV 9 98 106 18 WECQCVIY 9 157 165 ProPred 19 YIKFSSRAS 9 63 71 20 IKFSSRASG 9 64 72 21 MVGETVESA 9 103 111 22 VKGVGVYEC 9 132 140 Kết quả dự đoán thu được 22 vị trí epitope trên đoạn gen LipL21 (10 epitop tế bào B và 12 epitope tế bào T), cho thấy đoạn gen LipL21 rất giàu epitope. Các nghiên cứu trước đây cho thấy việc sử dụng toàn bộ trình tự gen LipL21 hay lựa chọn một đoạn epitope đều cho thấy khả năng gây đáp ứng miễn dịch cao (Anita et al., 2016; He et al., 2008; Kaur et al., 2014; Lin et al., 2010). Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn toàn bộ đoạn gen LipL21 đã được loại bỏ đoạn signal peptide nhằm tăng khả năng biểu hiện dạng tan của protein. Kết quả nhân dòng bước đầu cho thấy chúng tôi đã chuyển gen thành công vào vector nhân dòng pJET1.2. Đoạn gen LipL21 tái tổ hợp đã được gắn thêm vị trí enzyme giới hạn XhoI và EcoRV để chuẩn bị cho các thí nghiệm tiếp theo. Dựa trên kết quả phân tích, chúng tôi thiết kế cặp mồi đặc hiệu nhân lên đoạn gen LipL21 được xác định bảo thủ giữa 5 chủng Leptospira được gắn thêm vị trí enzyme giới hạn XhoI (5’-CTCGAG-3’) và EcoRV (5’-GATATC-3’) (Bảng 3). Bảng 3. Trình tự mồi thiết kế nhân bản đoạn gen LipL21 đặc hiệu Tên mồi Trình tự (5’-3’) Chiều dài (bp) Nhiệt độ bắt cặp LipL21-R-Fw AAAATAGATATCAATAGACTTATAGCTCT ATCTTTAG 548 55°C LipL21-R-Rw AACGAACTCGAGTTTGGAAACCTCTTGA GC Nhân dòng gen LipL21 Phân tích trình tự cho thấy trình tự gen LipL21 tái tổ hợp có vị trí từ 7bp đến 556bp của trình tự đầy đủ gen LipL21 của chủng L. Bataviae. Trình tự được lựa chọn tương đồng 100% với L. Bataviae và tương đồng 99% với L. Canicola, L. Grippotyphosa, L. Icterohaemorrhagiae và L. Pomona. Với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế, gen LipL21 đã được nhân bản từ DNA genome của chủng L. Batavie (Hình 6). Kết quả điện di trên Hình 6 cho thấy, sản phẩm PCR chỉ có một băng duy nhất có kích thước khoảng 550bp, tương đương với kích thước của gen LipL21 theo lý thuyết. PHẦN I. NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 437 Hình 6. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản gen LipL21 M: DNA marker 1kb (Thermo) ; (-): Đối chứng âm; (1): sản phẩm PCR nhân bản gen LipL21 từ DNA genome chủng L.Batavie với cặp mồi LipL21-R-Fw và LipL21-R-Rv được thiết kế Sau khi nhân bản, sản phẩm PCR thu được được gắn vào plasmid pLET1.2/blunt và biến nạp vào chủng E. coli DH10b. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu LipL21-R-Fw và LipL21-R-Rv được hiển thị trên Hình 7. Hình 7. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen LipL21 từ plasmid trong các khuẩn lạc 1, 2, 3, 4, 5 và 6 M: DNA marker 1 kb (Thermo); (-): Đối chứng âm; (1), (2), (3), (4), (5), (6): tương ứng với plasmid từ các khuẩn lạc 1, 2, 3, 4, 5 và 6. Kết quả điện di trên hình cho thấy, sản phẩm PCR của sáu khuẩn lạc đều chỉ có một băng duy nhất có kích thước khoảng 550bp, tương đương với kích thước của gen LipL21 theo lý thuyết. Như vậy, đoạn gen LipL21 đã được gắn vào plasmid pJET1.2/blunt và nhân dòng trong E. coli DH10b. Kết quả này cũng được khẳng định bằng kết quả cắt plasmid pJET1.2 có chứa gen LipL21 bằng enzyme EcoRV và XhoI (Hình 8). Kết quả điện di trên Hình 8 cho thấy, sản phẩm cắt xuất hiện 2 băng rõ nét, băng 3kb tương ứng với độ dài của plasmid pJET1.2 và băng 550bp tương ứng với độ dài của gen LipL21. 438 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Hình 8. Kết quả cắt kiểm tra đoạn gen LipL21 từ chủng L. Batavie trong plasmid pJET1.2 M: DNA marker 1 kb (Thermo); (1): plasmid nguyên bản từ khuẩn lạc (1); (2): plasmid từ khuẩn lạc (1) được cắt bằng enzyme EcoRV và XhoI Plasmid pJET1.2-LipL21 sau khi tách và tinh sạch được đem đi giải trình tự Sanger bằng máy giải trình tự ABI 3500. Kết quả giải trình tự nucleotide của đoạn DNA chứa gen LipL21 sau khi cắt gọt được so sánh với trình tự gen LipL21 của chủng L.Batavie. Kết quả so sánh trình tự cho thấy không có sự thay đổi nucleotide (Hình 9). Hình 9. Kết quả so sánh trình tự gen LipL21 của chủng L. Batavie và trình tự gen LipL21 trong plasmid 5. KẾT LUẬN Từ những kết quả phân tích và nhân dòng gen LipL21 từ 5 chủng vi khuẩn Leptospira, chúng tôi rút ra kết luận sau: Đã thu thập được trình tự đoạn gen LipL21 của 5 chủng xoắn khuẩn: L. Bataviae, L. Canicola, L. Grippotyphosa, L. Icterohaemorrhagiae, L. Pomona. Phân tích trình tự bằng các phần mềm tin sinh học thu được 22 vị trí epitope trên đoạn gen LipL21 (10 epitope tế bào B và 12 epitope tế bào T). Đã nhân dòng thành công gen LipL21 với mức độ chính xác cao. Vùng gen LipL21 được đem đi nhân dòng có trình tự nucleotide và trình tự axit amin tương đồng với chủng vi khuẩn L. Batavie. PHẦN I. NGHIÊN CỨU CƠ BẢN TRONG SINH HỌC 439 TÀI LIỆU THAM KHẢO André-Fontaine G., 2006. Canine leptospirosis - Do we have a problem? Vet. Microbiol., 117(1): 19-24. Anita K., Premlatha M. M., Kanagavel M., Mercy C. S. A., Raja V., Shanmughapriya S., Natarajaseenivasan K., 2016. Evaluation of combined B cell specific N-terminal immunogenic domains of LipL21 for diagnosis of leptospirosis. Int. J. Biol. Macromol., 91(): 465-470. Bharti A. R., Nally J. E., Ricaldi J. N., Matthias M. A., Diaz M. M., Lovett M. A., Levett P. N., Gilman R. H., Willig M. R., Gotuzzo E., 2003. Leptospirosis: a zoonotic disease of global importance. Lancet Infect Dis, 3(12): 757-771. Faine S., Adler B., Bolin C., Perolat P., 1999. Leptospira and leptospirosis. Melbourne, AustraliaMediSci, Guerreiro H., Croda J., Flannery B., Mazel M., Matsunaga J., Reis M. G., Levett P. N., Ko A. I., Haake D. A., 2001. Leptospiral proteins recognized during the humoral immune response to leptospirosis in humans. Infect. Immun., 69(8): 4958-4968. Haake D. A., Chao G., Zuerner R. L., Barnett J. K., Barnett D., Mazel M., Matsunaga J., Levett P. N., Bolin C. A., 2000. The leptospiral major outer membrane protein LipL32 is a lipoprotein expressed during mammalian infection. Infect. Immun., 68(4): 2276-2285. Haake D. A., Mazel M. K., McCoy A. M., Milward F., Chao G., Matsunaga J., Wagar E. A., 1999. Leptospiral outer membrane proteins OmpL1 and LipL41 exhibit synergistic immunoprotection. Infect. Immun., 67(12): 6572-6582. He H., Wang W., Wu Z., Lv Z., Li J., Tan L., 2008. Protection of guinea pigs against Leptospira interrogans serovar Lai by LipL21 DNA vaccine. Cell. Mol. Immunol., 5(5): 385-391. Kaur D., Verma R., Kumar B., Deka D., Agrawal R. K., 2014. Cloning, Phylogenetic Analysis and Expression of Recombinant LipL41, Loa22 and LipL21 Proteins from Leptospira interrogans. Int. J. Agric. Environ. Biotechnol., 7(3): 409-420. Lê Thị Thanh Xuân, Nguyễn Thị Bích Ngọc, Hoàng Thị Thu Hà, Lê Thị Tài, 2015. Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh xoắn trùng Leptospira tại Việt Nam giai đoạn 2002-2011. Tạp chí Y tế dự phòng, XXV(6): Lin X., Zhao J., Qian J., Mao Y., Pan J., Li L., Peng H., Luo Y., Yan J., 2010. Identification of immunodominant B-and T-cell combined epitopes in outer membrane lipoproteins LipL32 and LipL21 of Leptospira interrogans. Clin. Vaccine Immunol., 17(5): 778-783. Malm M., Rollman E., Ustav M., Hinkula J., Krohn K., Wahren B., Blazevic V., 2005. Cross- clade protection induced by human immunodeficiency virus-1 DNA immunogens expressing consensus sequences of multiple genes and epitopes from su