Phát hiện Corticoid pha trộn trong các chế phẩm đông dược bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 617 PHÁT HIỆN CORTICOID PHA TRỘN TRONG CÁC CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỚP MỎNG Lê Đào Khánh Long*, Vũ Văn Hiếu*, Trương Ngọc Huyền*, Trần Hùng* TÓM TẮT Mục tiêu: Nghiên cứu phương pháp phân tích phát hiện dexamethason, betamethason prednison, prednisolon và hydrocortison trong các chế phẩm Đông Dược đơn giản bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. Đối tượng: dexamethason, betamethason prednison, prednisolon và hydrocortison trong công thức giả lập và các chế phẩm Đông dược lưu hành trên thị trường. Phương pháp: Khảo sát các công thức của y học cổ truyền và các chế phẩm đang sử dụng trên thị trường để xây dựng công thức giả lập cho việc khảo sát việc chiết xuất, tinh chế và phân tích các corticoid trong các chế phẩm. Phương pháp chiết, dung môi chiết các corticoid ra khỏi chế phẩm và điều kiện loại tạp được khảo sát. Các điều kiện sắc ký lớp mỏng được xác định cho việc định tính các corticoid và ứng dụng chúng trên các chế phẩm thu thập trên thị trường. Kết quả: đã xây dựng được công thức giả lập gồm các dược liệu thường dùng trong các công thức y học cổ truyền và các chế phẩm thường gặp trên thị trường để khảo sát các điều kiện chiết xuất và sắc ký các corticoid. Phương pháp chiết xuất siêu âm kết hợp với chiết phân bố lỏng-lỏng được chọn là phương pháp chiết corticoid ra khỏi chế phẩm. Các hệ dung môi để tách các corticoid ra khỏi hỗn hợp đã được xác định. Để phát hiện các corticoid trên lớp mỏng, thuốc thử xanh tetrazolium cho kết quả nhanh, tuy nhiên, thuốc thử H2SO4/cồn có formaldehyd lại có giới hạn phát hiện thấp nhất. Giới hạn phát hiện của các corticoid trong hỗn hợp mẫu thay đổi từ 0,3 μg đến 0,08 μg, tuỳ thuộc vào từng chất và thuốc thử sử dụng. Trong 26 mẫu đông dược lấy từ thị trường, 7 mẫu (22%) cho thấy có dexamethason hoặc betamethason. Chưa phát hiện có prednison, prednisolon hay hydrocortison. Kết luận: Phương pháp sắc ký lớp mỏng là một phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và có thể thực hiện ở nhiều phòng thí nghiệm. Tuy giới hạn phát hiện cao, nhưng phương pháp cũng có thể phát hiện nhiều trường hợp pha trộn corticoid trái phép trong các chế phẩm. ABSTRACT DETERMINATION OF CORTICOID ADULTERANTS IN HERBAL MEDICINES BY THIN-LAYER CHROMATOGRAPHY Le Dao Khanh Long, Vu Van Hieu, Truong Ngoc Huyen, Tran Hung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 617 - 621 Objective: the aims of this research were to find out conditions for extraction and analysis procedures to detect common corticoid adulterants in herbal medicines by using TLC. Subjects: Authentic standards of dexamethasone, betamethasone, prednisone, prednisolone, hydrocortisone acetate, dexamethasone acetate and oriental medicines obtained from market. Method: Establishing a simulation formula consisting of herbs that are frequently used in traditional formulas and medicines in order to investigate the extraction-purification procedure of corticoids. Finding TLC conditions for analysis of these corticoids and applying this procedure to analyze herbal preparations. *Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược, Đại Học Y Dược TpHCM Tác giả liên hệ: PGS. TS. Trần Hùng ĐT: 0918057096 Email: tranhung@uphcm.edu.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 618 Results: A simulation formula consisting of herbs that are frequently used in traditional formulas and medicines were established for investigation of extraction-purification and analysis procedure of corticoids. Ultrasonic solvent extraction, liquid-liquid distribution was proved a suitable sample extract and clean-up; TLC conditions for analysis of these corticoids were studied and applied to analyze herbal preparations. Blue tetrazolium was a fast develop and good reagent for visualization. However, sulfuric acid-formalin solution in ethanol had a lowest detection limit. Detection limits of corticoid in simulation formulas ranged from 0.3 μg to 0.08 μg per spot depending on individual corticoids. Of the 27 oriental medicines from the market, cortisone and betamethasone were detected in 7 samples (22%). Prednisone, prednisolone and hydrocortisone were found in none of them. Conclusion: Procedures of TLC analyses of corticoids adulterant in herbal preparations by TLC were established. Although the LODs were not as high as other methods, it is a simple, easy to use and reliability enough for quality control of herbal medicines in common cases. Key words: corticoids, herbal medicines, TLC, dexamethasone, betamethasone, prednisone, prednisolone, hydrocortisone acetate ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, bên cạnh các phương pháp trị liệu y học hiện đại, các phương pháp chữa bệnh theo y học cổ truyền và các thuốc có nguồn gốc tự nhiên ngày càng được người dân quan tâm sử dụng bởi xu hướng quay về với thiên nhiên của người sử dụng và mức độ an toàn khi dùng lâu dài của thuốc. Tuy vậy, nhiều cơ sở sản xuất thuốc thuốc có nguồn gốc tự nhiên đã pha trộn trái phép các chất tổng hợp nhằm đánh lừa người sử dụng bằng hiệu quả nhanh của chúng. Hậu quả của việc dùng các thuốc này có thể sẽ rất trầm trọng và khó lường trước được. Corticoid là một trong những hoá chất thường được pha trộn nhằm gia tăng tác dụng kháng viêm, giảm đau, chống dị ứng của các chế phẩm. Sử dụng corticoid trong thời gian dài có thể gây hội chứng cushing, loét dạ dày tá tràng, tình trạng loãng xương, suy giảm chức năng tuyến thượng thận Việc phát hiện sự hiện diện các corticoid trong các chế phẩm đông dược gặp nhiều khó khăn do hàm lượng thấp của chất cần phát hiện, sự phức tạp của mẫu thử. Hầu hết việc định tính và định lượng corticoid trong các chế phẩm đông dược và thực phẩm chức năng đều dựa trên các hệ thống phân tích hiện đại như LC-UV, LC-MS, GC-MS mà không phải phòng thí nghiệm nào cũng có được. Để tìm một phương pháp đơn giản hơn mà vẫn có thể phát hiện các corticoid pha trộn trái phép trong các chế phẩm, phương pháp định tính phát hiện corticoid pha trộn trong các chế phẩm Đông dược bằng sắc ký lớp mỏng được nghiên cứu nhằm xây dựng một số phương pháp chiết xuất và sắc ký lớp mỏng phát hiện dexamethason, betamethason prednison, prednisolon và hydrocortison trong chế phẩm đông dược. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Các dược liệu sử dụng cho bài thuốc giả lập gồm Cam thảo, Độc hoạt, Đỗ trọng, Đương quy, Ngưu tất, Phòng phong và Thổ phục linh. Các chất chuẩn corticoid bao gồm: dexamethason (DXM), dexamethason acetat (DA), betamethason (BTM), prednison (P), prednisolon (PL), hydrocortison acetat (HA) được mua tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp. Hồ Chí Minh. Các sản phẩm đông dược được mua từ các nhà thuốc, chủ yếu tại khu vực Tp HCM Phương pháp nghiên cứu Khảo sát tần suất sử dụng của các dược liệu thường dùng trong các chế phẩm trị phong thấp, kiện tỳ trên thị trường để xây dựng một công thức thuốc giả lập để khảo sát việc phát hiện các corticoid. Các dược liệu được xác định chất lượng trước khi sử dụng theo dược điển Việt nam. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 619 Xây dựng quy trình chiết – loại tạp cho các corticoid trên công thức giả lập dựa trên các kết quả khảo sát phương pháp và dung môi chiết, loại tạp. Khảo sát các điều kiện sắc ký lớp mỏng bao gồm hệ dung môi, thuốc thử (TT) phát hiện, giới hạn phát hiện các corticoid riêng lẻ hay hỗn hợp trong mẫu giả lập. Áp dụng các điều kiện phân tích vào các sản phẩm thu nhập từ thị trường có tác dụng trị phong thấp, kiện tỳ bao gồm các dạng thuốc hoàn, viên nang, viên nén, và dung dịch thuốc nước. Đánh giá quy trình chiết xuất và loại tạp điều kiện sắc ký và khả năng phát hiện các corticoid trong các chế phẩm đông dược. KẾT QUẢ Công thức giả lập Từ các tài liệu về thuốc YHCT, các bài thuốc dân gian cũng như các sản phẩm có trên thị trường dùng làm thuốc bổ tỳ vị, trừ phong thấp, tiến hành thực hiện khảo sát tần suất xuất hiện của các vị thuốc để lựa chọn vị thuốc có tần suất sử dụng cao nhất. Kết quả 7 vị thuốc có tần suất sử dụng cao nhất được sử dụng trong bài thuốc giả lập (Bảng 1). Các dược liệu sử dụng đều phải đạt tiêu chuẩn của Dược điển Việt nam III trước khi sử dụng. Bảng 1. Bài thuốc giả lập Dược liệu Tên khoa học Hoạt chất chính Liều lượng Cam thảo Glycyrrhiza uralensis Fisch., G. inflata Bat. hoặc G. glabra L. Flavonoid, saponin 1 g Độc hoạt Angelica pubescens Maxim. Acid béo, sterol, angelicol 2 g Đỗ trọng Eucommia ulmoides Oliv. Alkaloid, glycosid, chất nhựa 3 g Đương quy Angelica sinensis (Oliv.) Diels. Tinh dầu 3 g Ngưu tất Achyranthes bidentata Blume Saponin, sterol 3 g Phòng phong Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk. Glycosid đắng, tinh dầu 2 g Thổ phục linh Smilax glabra Roxb. Saponin, chất nhựa, tanin 3 g Khảo sát quy trình chiết xuất – loại tạp Qua khảo sát, đánh giá các dung môi chiết, khả năng loại tạp, khả năng hoà tan chất cần chiết, mức độ hao hụt chất cần chiết và các yếu tố ảnh hưởng quy trình chiết xuất được chọn như sau: dược liệu được chiết loại tạp bằng n- hexan (chiết trong bể siêu âm 3 lần, tỉ lệ mẫu:dung môi = 1/20; 1/20 và 1/10) sau đó bằng MeOH-H2O (3:7) ở pH 5 với số lần và lượng dung môi tương tự như trên để chiết các corticoid. Dịch methanol-nước được loại tạp bằng cách phân bố với ether dầu rồi dùng ethyl acetat để chiết lấy corticoid. Khảo sát điều kiện sắc ký lớp mỏng Khảo sát hệ dung môi tách các corticoid trên sắc ký lớp mỏng Kết quả khảo sát khả năng tách của các corticoid trên sắc ký lớp mỏng (SKLM) đã thu được một số dung môi tách tốt như sau: Hệ 1: Benzen - Et2O-acid acetic-H2O (120:60:18:1) Hệ 2: Toluen - EtOAc-H2O (7:3:5) Hệ 3: CHCl3 - EtOAc (9:1) Hệ 4: CHCl3 – Aceton - H2O (8:2:5) Hệ 5: CHCl3 - MeOH (9:1) Các hệ dung môi trên tách tốt các corticoid ra khỏi nhau và khỏi các thành phần trong chế phẩm giả lập. Tuy nhiên, với hai đồng phân lập thể là DXM và BTM thì chưa được tốt. hai vết còn chồng lên nhau trên sắc đồ. Kết quả khảo sát các hệ dung môi nhằm tách được hai corticoid này đã thu được các hệ dung môi: Toluen - EtOAc - H2O (7:3:5) CHCl3 - EtOH (9:1) Et2O - EtOAc (1:4) Et2O - EtOAc - H2O (2:8:5) BuOAc - EtOAc (8:2) Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 620 Khảo điều kiện phát hiện các corticoid trên SKLM Từ kết quả khảo sát trên 30 phương pháp phát hiện corticoid trên SKLM, đã chọn được các điều kiện phát hiện là: soi dưới đèn UV 254 nm, thuốc thử xanh tetrazolium, dung dịch H2SO4/cồn có formaldehyd. Phương pháp phát hiện và thuốc thử này đơn giản, dễ sử dụng và dễ phát hiện các corticoid. Trên sắc đồ sắc ký lớp mỏng, thuốc thử xanh tetrazolium cho màu tím với corticoid nhưng cũng cho màu tím với một vài chất khác trong dịch chiết; tuy vậy màu tím của các corticoid xuất hiện ngay sau khi phun thuốc thử, trong khi các vết trong dịch chiết nếu có màu thì để lâu sau mới xuất hiện. Dung dịch H2SO4 có formaldehyd sau khi sấy được quan sát dưới UV 365 nm cho màu cam với các corticoid có thể phân biệt với các chất khác trong dịch chiết. Tuy nhiên, các vết cần được tách riêng. Một số thuốc thử như acid phosphomolybdic cho màu xanh dương tất cả các chất kể cả chất có trong dịch chiết, không phân biệt được với các corticoid. Một số thuốc thử như anisaldehyd - sulfuric, vanillin - sulfuric cho các vết màu khác biệt nhưng khó phân biệt. Thuốc thử vanillin - sulfuric cho màu chàm với BTM, xám đậm với DA và DXM và xanh dương với prednison và prednisolon. Thuốc thử anisaldehyd - sulfuric cho màu vàng chanh với DA, DXM, prednison, prednisolon; cho màu cam nhạt với BTM và HA. Lượng thuốc thử, nhiệt độ sấy, thời gian sấy cũng ảnh hưởng đến việc lên màu của các thuốc thử. Qua các kết quả thử nghiệm, tetrazolium được chọn là thuốc thử chính vì khá đặc hiệu với các corticoid. Giới hạn phát hiện các corticoid trên SKLM Kết quả xác định giới hạn phát hiện của các corticoid trên các vết trên sắc ký đồ các của mẫu chuẩn pha trong dung môi và mẫu chuẩn trong chế phẩm giả lập được trình bày ở Bảng 2 và 3. Bảng 2. Giới hạn phát hiện trên chất chuẩn DXM DA BTM HA Prednison Prednisolon UV 254 nm 0,07 µg 0,08 µg 0,04 µg 0,04 µg 0,04 µg 0,04 µg TT Xanh tetrazolium 0,3 µg 0,3 µg 0,08 µg 0,2 µg 0,1 µg 0,1 µg Lượng chất chuẩn có thể phát hiện được TT H2SO4/cồn có formaldehyd 0,03 µg 0,03 µg 0,02 µg 0,016 µg 0,02 µg 0,02 µg Bảng 3. Giới hạn phát hiện chất chuẩn trong dịch chiết chế phẩm giả lập DXM DA BTM HA Prednison Prednisolon UV 254 nm 0,1 µg 0,1 µg 0,1 µg 0,04 µg 0,2 µg 0,2 µg TT Xanh tetrazolium 0,3 µg 0,3 µg 0,1 µg 0,2 µg 0,3 µg 0,3 µg Lượng chất chuẩn có thể phát hiện được TT H2SO4/cồn có formaldehyd 0,08 µg 0,1 µg 0,05 µg 0,016 µg 0,1 µg 0,2 µg Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện của corticoid trên sắc ký lớp mỏng cho thấy BTM có thể phát hiện ở lượng thấp hơn so với DXM và DA ở trên chất chuẩn cũng như trong chế phẩm giả lập với tất cả các phương pháp phát hiện. Giới hạn phát hiện của prednison và prenisolon là gần như nhau. Nhìn chung, các corticoid có giới hạn phát hiện có thể coi là tương đương nhau. Tuy nhiên, việc giới hạn phát hiện của các corticoid phụ thuộc vào cảm quan nên mức độ chính xác khi ở gần giới hạn này sẽ thấp. Ứng dụng phương pháp phát hiện corticoid trên sản phẩm thị trường Áp dụng các kết quả khảo sát trên với 26 mẫu chế phẩm đông dược thu mua trên thị trường, đã phát hiện được 7 mẫu có sự pha trộn cortioid (Bảng 4). Việc xác định sơ bộ hàm lượng các chất trong chế phẩm được dựa trên so sánh diện tích và cường độ các vết trên sắc dồ so với giai mẫu của chất chuẩn. Bảng 4. Kết quả phân tích khối phổ một số sản phẩm Mã số sản phẩm Corticoid phát hiện H2L03HC BTM (0,010% đến 0,030%) H2L05NA BTM (0,010% đến 0,030%) Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 621 Mã số sản phẩm Corticoid phát hiện H2L06TN BTM (0,010% đến 0,030%) H2L22NA DXM (0,03% đến 0,05%) H2L23NA DXM (0,03% đến 0,05%) H2L16NA DXM (> 0,050%) H2L17NA DXM (> 0,050%) KẾT LUẬN Để phát hiện các corticoid pha trộn trái phép trong các chế phẩm đông dược, đề tài đã xây dựng công thức giả lập gồm 7 dược liệu có tần suất xuất hiện cao trong các chế phẩm trên thị trường cũng như các phương thuốc của y học cổ truyền. Công thức giả lập này được sử dụng trong nghiên cứu việc phát hiện các chất trên sắc ký lớp mỏng cũng như có thể sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Từ đó đã xây dựng được quy trình chiết xuất – loai tạp tối ưu cho việc phát hiện corticoid trên sắc ký lớp mỏng. Các điều kiện phân tích sắc ký như hệ dung môi, thuốc thử phát hiện và giới hạn phát hiện các chất cũng đã được xác định. Kiểm tra phương pháp và thử phân tích các chế phẩm có trên thị trường cũng đã phát hiện gần 1/3 trong 26 sản phẩm có pha trộn corticoid như dexamathason, betamethason, dexamethason dạng acetat. Phương pháp có thể dể dàng được áp dụng ở mọi cơ sở phân tích ở các địa phương chưa có điều kiện có các thiết bị phân tích hiện đại. Các kết quả cho thấy, dù là phương pháp đơn giản, độ nhạy còn thấp nhưng cũng đủ để phát hiện các mẫu có corticoid trong nhiều trường hợp. Các nghiên cứu phát hiện các corticoid bằng các phương tiện hiện đại hơn như HPLC-UV, HPLC-MS, HPLC-MS/MS đã và đang được thực hiện và sẽ được báo cáo trong các bài báo tiếp theo. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Huetos Olga (1999),“Determination of Dexamethason in feed by TLC and HPLC”, Analyst, 124, 1583-1587 2. Nguyễn Văn Thị, Nguyễn Thị Kim Danh (2002). Xây dựng quy trình chiết xuất Dexamethason acetat và cyproheptadin hydroclorid trộn trái phép trong chế phẩm Đông dược, Y học TP Hồ Chí Minh. 3. Vũ Thị Mỹ Hương (2008). Phát hiện corticoid được pha trộn trong chế phẩm Đông dược, Khóa luận dược sĩ Đại học, Khoa dược, ĐHYD TpHCM