Phương pháp làm bộ nhiễm sắc thể người

Đại học y khoa Phạm Ngọc Thạch Bộ môn Mô – Phôi – Di truyền - GPB PHƢƠNG PHÁP LÀM BỘ NHIỄM SẮC THỂ NGƢỜI Th.Bs. HUYNH MINH TUAN I. CẤU TRÚC NST : Chất nhiễm sắc ( chromatine) : Thông tin di truyền. Đơn vị chức năng NSC: Nucléosome Nhiễm sắc chất: Đồng nhiễm sắc ( Euchromatine) và Dị nhiễm sắc ( Heterochromatine) Caryotype: Bộ NST chuyên biệt đặc trƣng cho từng loài. + Chỉ định: 1. Bất thƣờng bẩm sinh: - 12 – 16 tuần vô kinh, tiền sử sanh con bất thƣờng hay cha mẹ mang bất thƣờng NST. - Bất thƣờng trên siêu âm.. - Chết sau sinh, không rõ giới tính, dị tật bẩm sinh - Chậm phát triển tâm thần vận động ( retard mental, retard staturo- pondéral). 2. Bất thƣờng mắc phải: - Bạch huyết mạn dòng tủy (NST Philadelphia t(9;22) (q34;q11). BỆNH DI TRUYỀN Bạch huyết mạn dòng tủy (CML) Bệnh ƣa chảy máu (Hémophilie) Bệnh nhƣợc cơ Duchenne Bệnh nhƣợc cơ Duchenne (DMD) Bệnh di truyền liên kết lặn với NST X. Xp21.2. Tần suất 1/3500 trẻ sơ sinh nam. Phát hiện năm 1858, bởi Guillaume Duchenne. Bất thƣờng do di truyền đứt đoạn NST(65%bệnh nhƣợc cơ Duchenne và 85% bệnh nhƣợc cơ Becker). Nhân đoạn (duplications) trong 6% bệnh Duchenne  bất thƣờng sản xuất protéine Dystrophine Protéine dystrophine Protein chịu lực của cơ  DMD: Yếu cơ đều nguyên nhân do đột biến BỆNH ƯA CHẢY MÁU (HEMOPHILIE) Bệnh di truyền lặn liên quan đến NST X Tần suất 1/5000 trẻ sơ sinh nam. 2 dạng Hemophilie A (80%) và hemophilie B (20%). Nữ mang gen gây bệnh. Lâm sàng: Chảy máu là triệu chứng chính. Biến chứng máu tụ (hématome), tràn máu màng khớp ( arthohémarthrose). Di Truyền: Vai trò của karyotype trong chẩn đoán ? - NST philadelphie t(9;22) (q34;q11). - Mô tả 1960, Janet .Rowley mô tả cơ chế: chuyển đoạn tƣơng hỗ năm 1973. - Vai trò caryotype: Test chẩn đoán. - 95% bệnh nhân LMC mang t(9;22) (q34;q11). - 5% LMC mang bất thƣờng NST khác. - Gen BCR = Breakpoint cluster region NST 22 và abl = abelson NST 9  protein 185-200 kDa  hoạt tính Tyrosine kinase  R tyrosine kinase  Ras/ Raf  tăng sinh tế bào ( proliferation). - Điều trị : ức chế tyrosine kinase. LMC = Leucémie myéloide chronique Phân loại NST: + Kích thƣớc NST. + Vị trí tâm động. +Band đặc trƣng cho từng NST. Chỉ số tâm động Ic = Indice centromérique Ic = 0,5 Tâm giữa 0,25 < Ic < 0,5 Tâm gần giữa ≤ 0,25 Tâm lệch Ic < 0,1 Tâm đầu. 7 nhóm NST - Nhóm A : Kích thƣớc lớn, tâm giữa hoặc gần giữa (1,2,3). - Nhóm B :Kích thƣớc lớn, tâm lệch (4,5). - Nhóm C : Kích thƣớc trung bình, tâm giữa hoặc gần giữa ( 6  12, X). - Nhóm D : Trung bình, tâm đầu (13,14,15). - Nhóm E : Dƣới trung bình, tâm giữa hoặc gần giữa (16,17,18). - Nhóm F : Nhỏ, tâm giữa (19,20). - Nhóm G : Nhỏ, tâm đầu (21,22,Y). KỸ THUẬT LÀM CARYOTYPE A. Lấy mẫu và nuôi cấy tuân thủ nguyên tắc vô trùng - Máu tĩnh mạch (lymphocytes), da, tủy xƣơng, gai nhau,. - Nuôi cấy môi trƣờng phù hợp: RPMI, DMEM, TC-199, Amniomax, HAM F-10,) - Thời gian nuôi cấy: tùy theo loại tế bào (72h/ lymphocytes, 10-15j/ amniocytes.) B. Thu hoạch: - Bloc phân bào (Colcémide) - Sốc nhƣợc trƣơng (Choc hypotonique). - Cố định ( Fixations). C. KỸ thuật nhuộm band: - Band G : Trypsine – Giemsa. - Band R : Heat – Giemsa. - Band C = centromère. - Band A : Acridine. - Band Q : Quinacrine. * Band G: - Xử lý làm già lame. - Xử lý với Trypsine. - Rửa lame với nƣớc cất. - Nhuộm trong Giemsa. - Rửa lame. - Để khô đọc kết quả. FISH ( Fluorescence In situ Hybridization) FISH : Lai phân tử huỳnh quang dựa trên nguyên tắc bắt cặp của ADN. - Kết hợp với kỹ thuật caryotype trong hội chứng vi khuyết đoạn ( micro-délétion). - Áp dụng vào những năm 70 để tìm AND satellite. - Nguyên tắc: tái bắt cặp giữa các acides nucléiques. - Các đoạn mồi sử dụng . Đoạn mồI NST . Locus chuyên biệT. . Télomérique. . Centromérique. - Chất đánh dấu (haptène) . Biotine-avidine. . Dioxigenine-antidigoxine. . Fluoresceùine. . Rouge texas. .Rhodamine .Coumarine