Quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens HB

721 QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM DIỆT SÂU TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN SERRATIA MARCESCENS HB Nguyễn Hoài Hƣơng, Hồ Trung Lộc, Nguyễn Đăng Thùy Dƣơng, Võ Đình Chiến Viện Khoa học Ứng dụng, trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh (HUTECH) TÓM TẮT Từ bộ sưu tập vi khuẩn Serratia marcescens SH1, SH4, SH5, SB, HB được phân lập từ tuyến trùng EPN Heterorhabditis indica CP 16, chủng HB có khả năng tổng hợp sắc tố đỏ prodigiosin và enzyme ngoại bào protease, chitinase cao nhất được chọn để sản xuất chế phẩm diệt sâu. Xử lý formalin 0.5%, 30 phút dịch nuôi cấy Serratia marccescens HB trong môi trường peptone glycerol tiêu diệt hoàn toàn tế bào mà ít ảnh hưởng nhất lên nồng độ prodigiosin, cũng như hoạt tính enzyme ngoại bào protease và chitinase. Chế phẩm được tạo thành từ dịch nuôi cấy xử lý như trên pha loãng 104 lần có bổ sung 0,04 % Tween 80, 0,2 % rỉ đường và 0,2% CMC trong điều kiện trong tối có khả năng diệt sâu khoang Spodoptera litura 100% sau 96 giờ. Chế phẩm bảo quản dưới nắng 5 ngày làm giảm hiệu lực diệt sâu xuống còn 80% sau sau 120 giờ. Từ khóa: Formalin, hiệu lực diệt sâu, prodigiosin, Serratia marcescens, sâu khoang ăn tạp. 1. GIỚI THIỆU Prodigiosin là một hợp chất thứ cấp được sản xuất bởi các vi khuẩn khác nhau, trong đó có các chủng Serratia marcescens phân lập từ tuyến trùng gây bệnh côn trùng (EPN) Steinernema guangdongsenxe XT và Heterorhabditis indica CP 16. Các chủng S. marcescens SS1 và S. marcescens SH1 đã chứng tỏ có khả năng diệt sâu khoang ăn tạp Spodoptera litura và Spodoptera exigua rất mạnh [1,2]. Dịch nuôi cấy chủng S. marcescens SH4 khi pha loãng 10 4 lần cũng thể hiện hoạt tính diệt sâu tơ Plutella xylostella 100% sau 96 giờ tương tự như thuốc trừ sâu sinh học Reagant 3.6EC chứa abamectin. Tác nhân gây chết sâu ngoài prodigiosin còn có các enzyme ngoại bào như protease, chitinase và các sản phẩm ngoại bào khác, hứa hẹn có thể phát triển thuốc trừ sâu trực tiếp từ dịch nuôi cấy vi khuẩn bỏ qua quá trình thu hồi và tinh sạch prodigiosin. Để hạn chế ảnh hưởng bất lợi của vi khuẩn sống khi sử dụng làm chế phẩm sinh học, phương pháp tieu diệt tế bào mà không ảnh hưởng lên hoạt chất cũng là một vấn đề được quan tâm. Đó là cũng là mục tiêu của nghiên cứu này khai thác bộ sưu tập các chủng Serratia marcescens đã phân lập, tuyển chọn chủng có khả năng vượt trội để sản xuất chế phẩm diệt sâu và xác định phương pháp tiêu diệt tế bào thích hợp cho chủng. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu Vi khuẩn Serratia marcescens SH1, SH4, SH5, SB và HB được phân lập, định danh theo nghiên cứu trước đó [1]. 722 2.2. Phƣơng pháp 2.2.1. Chọn lọc chủng sản xuất chế phẩm Thu dịch nuôi cấy Serratia marcescens SH1, SH4, SH5, SB và HB được tăng sinh trong môi trường peptone glycerol broth (PG), tỉ lệ cấy giống 1%, nhiệt độ phòng, lắc 150 vòng/phút trong 48 giờ. Sau nuôi cấy ly tâm 4000 vòng/phút x 15 phút thu tế bào, trích ly prodigiosin bằng dung môi EtOH: HCl 1N:với tỷ lệ nồng độ theo thể tích là 95:5 (v:v), cuối cùng ly tâm lần 2 thu dịch màu, bỏ tế bào. Quét phổ hấp thụ UV-VIS ở bước sóng 380 - 700 nm lần lượt đối với dịch nuôi cấy sau lên men và dịch trong sau trích ly. Khảo sát hoạt tính enzyme ngoại bào protease và chitinase của chúng trên môi trường thạch gelatin agar và chitin agar theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch, thời gian ủ là 24 giờ ở nhiệt độ phòng, phát hiện bằng cách tráng đĩa bằng dung dịch TCA 10% đối với thạch gelatin và dung dịch Lugol đối với thạch chitin. 2.2.2. Xử lý dịch nuôi cấy tiêu diệt tế bào Dịch nuôi cấy sau lên men được xử lý acid HCl 1N về pH 2 trong 24 giờ, sau đó trung hòa bằng NaOH về pH 7 [2] hoặc xử lý nhiệt ở 650C và 1000C trong 15 phút [3], hoặc bổ sung dung dịch formalin 0,125%, 0,25%, 0,5%, 0,75% và 1% trong 30 phút. Sau khi được xử lý, dịch nuôi cấy đem ria lại trên thạch peptone glycerol agar (PGA), ủ 24 giờ ở nhiệt độ phòng để kiểm tra sự sống sót của tế bào. Prodigiosin sau xử lý được so sánh với prodigiosin sau xử lý bằng qua đo mật độ hấp thụ tại bước sóng hấp thụ cực đại. Hoạt tính enzyme protease, chitinase của dịch nuôi cấy sau xử lý được thực hiện bằng phương pháp khuếch tán trong giếng thạch. 2.2.3. Hiệu lực diệt sâu khoang Spodoptera litura của dịch nuôi cấy Dịch nuôi cấy vi khuẩn sau lên men 48 giờ được xử lý theo công thức chọn được từ thí nghiệm mô tả ở mục 2.2.2, pha loãng 104 lần [1], phối trộn phụ gia và thiết lập điều kiện bảo quản trước khi thí nghiệm 5 ngày như trình bày trong bảng 1. Trứng sâu khoang Spodoptera litura ấp cho nở, sâu được nuôi bằng lá thầu dầu cho đến tuổi 3 cho thí nghiệm. Mỗi hộp thí nghiệm chứa 30 sâu tuổi 3 và 3 lá thầu dầu (kích thước mỗi lá là 15000 mm2) được quét lên bề mặt mỗi lá 100 μl dịch nuôi cấy chuẩn bị như trên. Mẫu đối chứng âm quét lá bằng 100 μl môi trường PG chứa phụ gia (CMC, rỉ đường, Tween 80), đối chứng dương là Reasgant 3.6EC nồng độ 1mg/cm2. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần và theo dõi sâu chết theo thời gian đến khi hộp đối chứng chuyển sang nhộng. Hiệu lực diệt sâu tính theo công thức Abbott. Bảng 1. Bố trí thí nghiệm khảo sát hiệu lực diệt sâu của dịch nuôi cấy S. marcescens HB xử lý diệt tế bào và bổ sung phụ gia Mẫu Công thức phụ gia Điều kiện bảo quản CT1 0,2%CMC + 0,2% rỉ đường + 0,04% Tween 80 Phơi nắng CT2 0,2% CMC + 0,4% rỉ đường + 0,04% Tween 80 Phơi nắng CT3 0,2% CMC + 0,2% rỉ đường + 0,08% Tween 80 Phơi nắng CT4 0,2% CMC + 0,4% rỉ đường + 0,08% Tween 80. Phơi nắng CT5 0,2% CMC + 0,2% rỉ đường + 0,04% Tween 80 Trong tối 723 2.2.4. Xử lý số liệu thống kê Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, xử lý thống kê phân tích ANOVA sử dụng phần mềm Statistical Analysis System (SAS 9.4). 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Chọn chủng Serratia marcescens từ bộ sƣu tập Các chủng S. marcescens SH1, SH4, SH5, SB và HB từ bộ sưu tập chủng được khảo sát khả năng tổng hợp prodigiosin được coi là yếu tố độc lực đối với côn trùng [1, 2, 3, 4]. Bước sóng hấp thu cực đại của dịch lên men các chủng S. marcescens được khảo sát trước khi trích ly đều ở mức 499 nm và sau khi trích ly đều nằm trong khoảng 535 nm, khẳng định sắc tố sinh ra bởi các chủng S. marcescens khảo sát chính là prodigiosin [6] (hình 1). Hình 1. Quang phổ hấp thụ của dịch nuôi cấy (trên) và dịch trích ly bằng EtOH: HCl 1N (95:5) (v/v) Serratia marcescens SH1 và HB Hình 2. Nồng độ prodigiosin trong dịch nuôi cấy các chủng SH1, SH4, SH5, SB, HB 724 Từ đó đo độ hấp thụ tại bước sóng 499 nm của dịch nuôi cấy và 535 nm của dịch trích ly sắc tố bằng Ethanol: HCl 1N (95:5) (v/v) được sử dụng để so sánh nồng độ prodigiosin do các chủng tổng hợp. Hình 2 trình bày độ hấp thụ của dịch nuôi cấy ở 499 nm và dịch nuôi cấy ở 535 nm, cho thấy hai chủng có mức độ tổng hợp prodigiosin cao nhất trong môi trường PG, sau đó đến chủng SH4, tiếp theo là chủng SH5. Cuối cùng chủng SB có nồng độ prodigiosin trong dịch nuôi cấy và thu hồi bằng trích ly đều thể hiện mức thấp nhất. Ngoài prodigiosin, theo Kenichi Ishii và cộng sự (2014), Serralysin metalloprotease góp phần vào cơ chế gây bệnh của S.marcescens đối với côn trùng bằng cách ức chế quá trình làm lành vết thương, dẫn đến tổn thất lớn huyết tương từ ấu trùng sâu tằm Bombyx mori [7]. Ngoài ra, enzyme endochitinase từ Serratia marcescens có thể hiệp lực với Cry protein từ Bacillus thurigiensis để tăng hiệu lực diệt ấu trùng Spodoptera littoralis. Vì vậy chọn chủng sản xuất chế phẩm diệt sâu cũng dựa trên khả năng tổng hợp các enzyme ngoại bào protease và chitinase. Bảng 2. Khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng S.marcescen SH1, SH4, SH5, SB, HB stt Chủng Đƣờng kính vòng phân giải (D-d), mm protease chitinase 1 SH1 6,67 a ± 0,57 Kxđ 2 SH4 5,33 b ± 0,57 Kxđ 3 SH5 5,33 b ± 0,57 Kxđ 4 SB 5,33 b ± 0,57 20,5 a ± 0,5 5 HB 6 ab ± 0 19,5 a ± 0,5 Bảng 2 trình bày khả năng tiết enzyme ngoại bào của các chủng S. marcescen SH1, SH4, SH5, SB và HB. Bảng 2 cho thấy đường kính vòng phân giải gelatin cao nhất ở dịch nuôi cấy chủng SH1 và HB, sai khác không có ý nghĩa thống kê. Đường kính vòng phân giải gelatin của chủng HB cao hơn các chủng SH4, SH5 và SB, tuy nhiên sai khác cũng không có ý nghĩa thống kê ở mức p<0,05). Điểm khác biệt của hai chủng SB và HB so với SH1, SH4 và SH5 lại thể hiện ở khả năng tiết enzyme chitinase. Kết hợp các kết quả khảo sát khả năng tổng hợp prodigiosin, protease và chitinase, chủng HB được chọn để sản xuất chế phẩm diệt sâu. 3.2. Xác định phƣơng pháp xử lý tiêu diệt tế bào Vi khuẩn S. marcescens thể hiện hoạt tính diệt sâu mạnh đã được nghiên cứu trước đó [1, 3, 4]. Nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Anh Kha, Lê Quốc Vũ cho thấy hiệu quả diệt sâu của các chủng này đối với sâu khoang Spodoptera litura và sâu xanh da láng Spodoptera exigua cũng như prodigiosin đóng vai trò hoạt chất diệt sâu [1, 2]. Tuy nhiên, S. marcescens cũng là vi khuẩn gây bệnh cơ hội nên việc sử dụng vi khuẩn sống như chế phẩm diệt sâu là không nên, vì vậy một phương pháp tiệu diệt tế bào mà không ảnh hưởng lên các yếu tố độc lực trong dịch nuôi cấy là cần thiết để phát triển một chế phẩm diệt sâu an toàn. Trước đó phương pháp xử lý dịch nuôi cấy bằng acid đã được thử nghiệm khi nuôi cấy S. marcescens SH1 và SH4. 725 Bảng 3. Ảnh hưởng của các phương pháp xử lý dịch nuôi cấy lên sự sống sót của vi khuẩn S. marcescens HB và nồng độ prodigiosin Phƣơng pháp xử lý dịch nuôi cấy Vi khuẩn S. marcescens HB sống sót Prodigiosin còn lại (%) HCl 1N pH 2, 24 giờ + Kxđ 65 o C, 15 phút + Kxđ 100 o C, 15 phút - Kxđ Formalin 0,125% + 90,18 a ± 1,99 Formalin 0,25% + 115,11 a ± 19,46 Formalin 0,5% - 110,75 a ± 12.43 Formalin 0,75% - 98,30 a ± 16,35 Formalin 1% - 53,34 b ± 14,89 Bảng 3 cho thấy xử lý acid HCl 1N đến pH 2 trong 24 giờ vẫn để vi khuẩn chủng HB sống sót, khác với các chủng nghiên cứu trước đó là SH1, SH4 (Trương Hoài Nguyên và cộng sự, 2018). Xử lý bằng formalin  0,5% 30 phút và gia nhiệt 100oC 15 phút tiêu diệt được 100% tế bào. Tuy nhiên, xử lý nhiệt ở 100 0 C trong 15 phút enzyme bị bất hoạt [3]. Sử dụng formalin đến 1% có thể ảnh hưởng lên nồng độ prodigiosin như trong bảng 2. Điều này có thể giải thích được vì formalin là dung dịch formaldehyde 37% thường được sử dụng để diệt khuẩn nên ở nồng độ đủ cao có thể ảnh hưởng đến các hoạt chất trong dịch nuôi cấy như prodigiosin và enzyme ngoại bào. Vì vậy nồng độ formalin 0,5% là nồng độ được chọn để xử lý diệt tế bào mà không ảnh hưởng lên nồng độ prodigiosin. Enzyme ngoại bào protease và chitinase của dịch nuôi cấy sau khi xử lý formalin được trình bày trong bảng 4. Bảng 4. Hoạt tính enzyme ngoại bào trong dịch nuôi cấy xử lý 0,5% formalin 30 phút Độ pha loãng Đƣờng kính vòng phân giải (D-d) mm protease (D-d), mm chitinase (D-d), mm Dịch vi khuẩn không xử lý 20,67â ± 4,04 15,33a ± 0,57 2 15,33 b ± 0,57 14,33 a ± 3,05 4 15,33 b ± 0,57 12,66 ab ± 2,08 8 11,33 c ± 1,52 8,66 bc ± 3,21 16 8,33 c ± 0,57 8,0 bc ± 5,19 32 6,00 d ± 0 6,66 c ± 0,57 64 5,67 d ± 1,52 5,33 c ± 0,57 Dựa trên kết quả xử lý thống kê cho thấy hoạt tính protease và chitinase của chủng Serratia marcescens HB không bị biến đổi nhiều sau khi xử lý formalin 0,5% 30 phút. Do đó xử lý bằng formalin 0,5% trong 30 phút được chọn để diệt tế bào vi khuẩn làm chế phẩm diệt sâu. 726 3.4. Hiệu lực diệt sâu Để tạo thành chế phẩm dịch nuôi cấy S.marcescens sau xử lý tiêu diệt thế bào cần bổ sung phụ gia. Các phụ gia được chọn bao gồm rỉ đường, CMC và Tween 80 với công dụng đã biết khi sản xuất chế phẩm. CMC giúp tăng độ kết bám của chế phẩm lên trên lá, giảm thất thoát prodigiosin. Rỉ đường không những kích thích khẩu vị của sâu giúp sâu ăn ngon miệng nên sâu ăn nhiều hấp thu lượng prodigiosin lớn trên bề mặt lá mà còn là chất che giúp bảo vệ prodigiosin dưới tác động của ánh sáng, đây là một trong những nguyên nhân hàng đầu dễ gây biến tính prodigion ngoài tự nhiên. Khi sâu khoang tiêu hóa chế phẩm, lượng Tween 80 bổ sung vào trong chế phẩm giúp prodigiosin khuếch tán tốt vào cơ thể sâu, ngoài ra còn có các enzyme ngoại bào như protease và chitinase phá hủy kết cấu cơ thể giúp cho hoạt chất prodigiosin hoạt động tốt và gây chết sâu nhanh hơn. Hình 3 trình bày hiệu lực diệt sâu khoang ăn tạp tính theo công thức Abbott khi các công thức đều chứa nồng độ prodigiosin pha loãng 104 lần từ dịch nuôi cấy theo các nghiên cứu từ trước (Nguyễn Hoàng Anh Kha 2015, Nguyễn Hoài Hương 2016, Trương Hoài Nguyên 2018). Thí nghiệm này cho thấy hiệu lực diệt sâu của chế phẩm ở CT5 trong điều kiện bảo quản tối đạt cao nhất tương đương thuốc trừ sâu Reasgant 3.6EC. Hiệu lực diệt sâu ở 4 công thức bảo quản ngoài nắng 5 ngày chỉ đạt tối đa 80% so với CT5 và đối chứng dương, tuy nhiên sai khác không có ý nghĩa thống kê giữa chúng với nhau. Điều này có thể giải thích là do prodigiosin là hoạt chất dễ bị phân hủy dưới ánh nắng mặt trời, nồng độ các chất phụ gia bổ sung rỉ đường từ 0,2-0,4% không có tác dụng bảo vệ prodigiosin như trường hợp trong tối. Thời gian 5 ngày cũng là thời gian của các thử nghiệm trước đó trên sâu để hiệu lực diệt sâu cực đại. Nghiên cứu tiếp theo cần xác định phụ giả bảo quản prodigiosin hiệu quả hơn. Hình 3. Hiệu lực diệt sâu khoang Spodoptera litura của các công thức chế phẩm từ dịch nuôi cấy vi khuẩn S. mascescens HB biến đổi theo thời gian 4. KẾT LUẬN Chủng Serratia marcescens HB thể hiện có khả năng sinh enzyme ngoại bào và prodigiosin tương đương chủng SH1 được sử dụng sản xuất chế phẩm. Vi khuẩn Serratia marcescens HB được nuôi cấy trong môi trường PG ở nhiệt độ 250C, trên máy lắc 150 vòng / phút để tạo độ khuếch tán oxy tốt cho vi khuẩn phát triển sinh tổng hợp prodigiosin trong 48 giờ. Xử lý dịch nuôi cấy S. marcescens bằng formalin ở nồng độ 0,5% trong thời gian 30 phút có khả năng tiêu diệt được toàn bộ tế bào, không ảnh hưởng đến nồng độ prodigiosin mà vẫn giữ được hoạt tính enzyme ngoại bào protease và chitinase. Ở nồng độ pha loãng dịch nuôi cấy 10-4 bổ sung các chất phụ gia 0,2% CMC, 0,04% Tween 80 và 0,2% rỉ đường có thể sử dụng diệt sâu khoang Spodoptera litura 100% trong 96 giờ khi bảo quản chế phẩm trong tối, hiệu lực giảm còn 80% trong trường hợp chế phẩm để ngoài nắng 5 ngày. Quy trình sản xuất chế phẩm và bảo quản cần được tiếp tục hoàn thiện. 727 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyễn Hoài Hương và Nguyễn Hoàng Anh Kha, Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ, Tập 18 (2015), trang 5-14. [2] Lê Quốc Vũ, Nguyễn Hoài Hương (2016) Hội nghị Khoa Học HUTECH 2016. [3] Lê Thị Ngọc Dung (2016) đồ án tốt nghiệp K2012, CNSH, trường Đại học Công nghệ TP.HCM. [4] Trương Hoài Nguyên, Hồ Trung Lộc, Nguyễn Hoài Hương (2018). Hội nghị Khoa học HUTECH 2018. [5] Lacey (2012). Manual of Techniques in Invertebrate Pathology, 2nd Edition. Academic Press, pp. 504. [6] Krishna J.G. (2008) Pigment production by marine Serratia sp. BTWJ8, PhD dissertation, University of Science and Technology, Kerala, India. [7] Kenichi I., Tatsuo A., Takashi H., Hiroshi H. Kazuhisa S. (2014) Identification of a Serratia marcescens virulence factor that promotes hemolymph bleeding in the silkworm, Bombyx mori. Vol 117, pp.61-67.