Quy trình tách chiết, thu nhận chitinase thô từ mủ cao su

- 52 - Phần III: Kết quả và thảo luận Phần III: KẾT QUẢ – THẢO LUẬN III.1. QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT, THU NHẬN CHITINASE THÔ TỪ MỦ CAO SU III.1.1. Quy trình ly tâm tách mủ, thu hồi lutoid và phá vỡ lutoid để giải phóng chitinase Cách tiến hành được trình bày trong phần II.2.1. Mủ cao su tinh khiết được thu gom từ vườn cao su. Mủ được lọc sơ để loại côn trùng, ướp lạnh và chuyển về phòng thí nghiệm. Mủ cao su tươi được ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong thời gian 20 phút. Sau khi ly tâm, tách bỏ lớp mủ kem tạo thành lớp trắng dẻo trên bề mặt ống ly tâm, đổ bỏ phần dịch bên dưới, chỉ chừa lại phần lutoid màu vàng nhạt ở đáy ống ly tâm. Sau đó cho thêm vào ống ly tâm nước cất lạnh và ly tâm lần thứ 2 để loại hoàn toàn phần cao su. Phần lutoid thu được đem nghiền bằng cối có chứa cát thủy tinh, rồi lọc sạch. III.1.2. Quy trình tủa để thu nhận chitinase thô III.1.2.1. Tủa bằng cồn để thu nhận chitinase thô Tiến hành tủa như mô tả trong phần II.2.2 với dung môi là cồn tuyệt đối lạnh. Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp trong phần II.2.5. Hoạt tính chitinase được xác định như trong phần II.2.6 và tính kết quả theo công thức (1). Hoạt tính riêng tính theo công thức (2). Nguyễn Quang Nhân - 53 - Phần III: Kết quả và thảo luận Bảng 3.1: Hàm lượng, hoạt tính và hoạt tính riêng chitinase khi tủa bằng cồn Tác nhân tủa Hàm lượng protein (mg/ml) Hoạt tính chitinase (UI/ml) Hoạt tính riêng (UI/mg protein) Cồn 1:2 2,56 4,27 1,67 Cồn 1:3 3,88 4,33 1,12 Cồn 1:4 4,45 5,17 1,16 Nhận xét: Trong phần này, ta tiến hành tủa dịch lọc protein từ lutoid trong mủ cao su của 3 giống cao su bằng cồn lạnh với các tỷ lệ: 1:2 , 1:3 và 1:4 (thể tích dịch lọc : thể tích cồn), rồi xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry và xác định hoạt tính chitinase theo phương pháp định lượng đường khử bằng DNS với đường chuẩn N-acetylglucosamin. Với cùng một thể tích và độ pha loãng của dịch lọc ở 3 tỷ lệ tủa khác nhau, ta có thể so sánh kết quả hàm lượng và hoạt tính của mẫu ở các tỷ lệ tủa để tìm ra tỷ lệ tủa bằng cồn tốt nhất. Kết quả cho thấy, khi tủa bằng cồn với tỷ lệ 1:2, ta thu được dịch protein có hàm lượng 2,56mg/ml, hoạt tính chitinase là 4,27UI/ml và hoạt tính riêng của chitinase là 1,67UI/mg protein. Ở tỷ lệ 1:3, ta có hàm lượng protein cao hơn là 3,88mg/ml, hoạt tính chitinase cao hơn một chút là 4,33UI/ml và hoạt tính riêng là 1,12UI/mg protein. Trong khi đó, ở tỷ lệ 1:4, các kết quả lần lượt là hàm lượng protein 4,45mg/ml, hoạt tính chitinase 5,17UI/ml và hoạt tính riêng là 1,16UI/mg protein. Nhìn vào đồ thị 1, ta có thể thấy tỉ lệ tủa cồn 1:4 cho hàm lượng protein cao nhất, hoạt tính chitinase cũng tốt nhất mặc dù hoạt tính riêng thấp hơn 2 tỉ lệ kia nhưng độ chênh lệch hoạt tính riêng không nhiều. Như vậy, tỉ lệ 1:4 là tỉ lệ thích hợp nhất khi tủa chitinase trong dịch lọc lutoid từ mủ cao su bằng cồn. Nguyễn Quang Nhân - 54 - Phần III: Kết quả và thảo luận III.1.2.2. Tủa bằng acetone để thu nhận chitinase thô Tiến hành như trong phần II.2.2 với dung môi hữu cơ ở đây là acetone lạnh. Cách tính hàm lượng, hoạt tính chitinase và hoạt tính riêng tương tự phần trên tủa bằng cồn. Bảng 3.2: Hàm lượng, hoạt tính và hoạt tính riêng chitinase khi tủa bằng acetone Tác nhân tủa Hàm lượng protein (mg/ml) Hoạt tính chitinase (UI/ml) Hoạt tính riêng (UI/mg protein) Acetone 1:2 1,50 3,45 2,30 Acetone 1:3 1,85 4,75 2,57 Acetone 1:4 2,46 5,92 2,40 Nhận xét: Trong phần này, cách tiến hành và cách tính kết quả tương tự phần tủa bằng cồn bên trên, chỉ khác là thay cồn bằng acetone. Ta so sánh để tìm ra tỷ lệ acetone tốt nhất để tủa chitinase trong dịch lọc lutoid mủ cao su. Kết quả cho thấy, tủa bằng acetone tỷ lệ 1:2 cho hàm lượng protein 1,50mg/ml, hoạt tính đạt được 3,45UI/ml, hoạt tính riêng 2,30UI/mg protein. Tỷ lệ 1:3 cho kết quả lần lượt là hàm lượng 1,85mg/ml, hoạt tính 4,75UI/ml và hoạt tính riêng 2,57UI/mg protein. Ở tỷ lệ 1:4, ta có hàm lượng protein đạt được là 2,46mg/ml, hoạt tính chitinase là 5,92UI/ml và hoạt tính riêng của chitinase là 2,40UI/mg protein. Nhìn vào đồ thị 2, ta thấy hàm lượng protein cao nhất là ở tỷ lệ 1:4, hoạt tính cao nhất cũng đạt được ở tỷ lệ này, hoạt tính riêng không chênh lệch nhiều giữa các tỷ lệ. Do đó, tỉ lệ tủa 1:4 (thể tích dịch lọc : thể tích acetone) là tỉ lệ thích hợp nhất khi tủa chitinase từ mủ cao su bằng acetone. Nguyễn Quang Nhân - 55 - Phần III: Kết quả và thảo luận III.1.2.3. Tủa bằng muối ammonium sulfate để thu chitinase thô Tiến hành tủa dịch lọc bằng muối ammonium sulfate (NH4)2SO4 theo mô tả trong phần II.2.3, cách tiến hành tính hàm lượng protein như phần II.2.5, cách tiến hành xác định hoạt tính chitinase theo phần II.2.6 và tính kết quả theo công thứ (1), hoạt tính riêng theo công thức (2). Bảng 3.3: Hàm lượng, hoạt tính và hoạt tính riêng chitinase tủa bằng (NH4)2SO4 Tác nhân tủa Hàm lượng protein (mg/ml) Hoạt tính chitinase (UI/ml) Hoạt tính riêng (UI/mg protein) (NH4)2SO4 20% 0,20 0,87 4,42 (NH4)2SO4 30% 0,23 0,95 4,13 (NH4)2SO4 40% 0,36 1,27 3,54 (NH4)2SO4 50% 0,49 2,46 5,04 (NH4)2SO4 60% 1,51 6,33 4,19 (NH4)2SO4 65% 1,80 6,75 3,75 (NH4)2SO4 70% 2,01 6,92 3,44 (NH4)2SO4 75% 2,00 7,67 3,83 (NH4)2SO4 80% 3,05 8,42 2,76 (NH4)2SO4 85% 4,18 12,00 2,87 (NH4)2SO4 90% 4,05 12,42 3,07 (NH4)2SO4 95% 4,35 13,08 3,01 (NH4)2SO4 100% 4,05 12,75 3,15 Nhận xét: Ở đây, ta sử dụng muối ammonium sulfate (NH4)2SO4 để tủa dịch lọc lutoid từ mủ cao su. Muối ammonium sulfate đem tủa có các nồng độ bão hòa lần lượt là: 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ở nhiệt độ 5oC (để tủa trong tủ lạnh). Nồng độ phần trăm bão hòa khác Nguyễn Quang Nhân - 56 - Phần III: Kết quả và thảo luận nhau của ammonium sulfate cho hiệu quả kết tủa khác nhau. Khi được tiến hành trong cùng điều kiện, chỉ khác là nồng độ muối bão hòa khác nhau, ta có thể so sánh giữa các nồng độ muối để tìm ra nồng độ (NH4)2SO4 bão hòa thích hợp nhất để kết tủa chitinase từ mủ cao su. Kết quả cho thấy, ở nồng độ bão hòa 20%, hàm lượng protein của dịch enzyme sau tủa là 0,2mg/ml, hoạt tính chitinase là 0,87UI/ml, hoạt tính riêng là 4,42UI/mg protein. Ở độ bão hòa 30%, 40% và 50%, kết quả hàm lượng protein và hoạt tính chitinase tăng đều, riêng hoạt tính riêng không thay đổi nhiều. Đến nồng độ 60% bão hòa, hàm lượng protein và hoạt tính chitinase tăng khá nhiều so với các nồng độ trước, hàm lượng protein đạt 1,51mg/ml, hoạt tính chitinase là 6,33UI/ml, hoạt tính riêng 4,19UI/mg protein. Ở các nồng độ bão hòa tiếp theo 65%, 70%, 75% và 80%, hàm lượng protein và hoạt tính chitinase tiếp tục tăng đều. Ở nồng độ 85% bão hòa, hàm lượng protein tiếp tục tăng, đạt 4,18mg/ml, riêng hoạt tính chitinase tăng rất đáng kể, đạt 12,00UI/ml. Hàm lượng protein và hoạt tính chitinase tiếp tục tăng ở các nồng độ tiếp theo và đạt cao nhất ở nồng độ bão hòa 95% với kết quả hàm lượng protein là 4,35mg/ml và hoạt tính chitinase là 13,08UI/ml. Riêng chỉ số hoạt tính riêng không chênh lệch nhiều ở các nồng độ. Như vậy, nồng độ 95% độ bão hòa là nồng độ thích hợp nhất khi tủa chitinase từ mủ cao su bằng ammonium sulfate (NH4)2SO4. Thí nghiệm với các tác nhân tủa cồn, acetone, ammonium sulfate được tiến hành trong cùng điều kiện với cùng dịch enzyme ban đầu, cùng thể tích, cùng độ pha loãng, do đó có thể so sánh kết quả tủa của các tác nhân khác nhau. Ở đây, ta so sánh các kết quả tủa của cồn 1:4, acetone 1:4 và ammonium sulfate 95% độ bão hòa. Nguyễn Quang Nhân - 57 - Phần III: Kết quả và thảo luận Bảng 3.4: So sánh các tác nhân tủa với cùng lượng mẫu ban đầu Tác nhân tủa Hàm lượng protein (mg/ml) Hoạt tính chitinase (UI/ml) Hoạt tính riêng (UI/mg protein) Cồn 1:4 4,45 5,17 1,16 Acetone 1:4 2,46 5,92 2,40 (NH4)2SO4 95% 4,35 13,08 3,01 Xét về hàm lượng protein của dịch enzyme sau tủa, tác nhân tủa Cồn 1:4 đạt 4,45mg/ml, trong khi đó, ở Acetone 1:4 là 2,46mg/ml và (NH4)2SO4 95% là 4,35mg/ml. Như vậy, hàm lượng protein cao nhất có được với cồn tỉ lệ 1:4, tiếp theo là (NH4)2SO4 95%. Xét về hoạt tính chitinase, tác nhân Cồn 1:4 và Acetone 1:4 có kết quả lần lượt là 5,17UI/ml và 5,92UI/ml. Kết quả này thấp hơn nhiều so với tác nhân tủa (NH4)2SO4 95% với kết quả hoạt tính chitinase là 13,08UI/ml. Do đó, (NH4)2SO4 95% là tác nhân tủa cho hoạt tính chitinase tốt nhất. Xét về hoạt tính riêng của enzyme chitinase ở 3 tác nhân tủa khác nhau, tác nhân tủa (NH4)2SO4 95% cũng cho kết quả cao nhất với hoạt tính riêng là 3,01UI/mg protein so với 1,16UI/mg protein ở Cồn 1:4 và 2,40UI/mg protein ở Acetone 1:4. Đối với một tác nhân dùng để tủa enzyme, yếu tố hoạt tính là yếu tố hàng đầu để đánh giá khả năng tủa. Các yếu tố hàm lượng protein và hoạt tính riêng dùng để đánh giá tham khảo, bổ sung. Vì vậy có thể kết luận, ammonium sulfate (NH4)2SO4 95% độ bão hòa là tác nhân tủa thích hợp nhất khi kết tủa enzyme chitinase trong lutoid từ mủ cao su Hevea brasiliensis. Nguyễn Quang Nhân - 58 - Phần III: Kết quả và thảo luận III.2. QUY TRÌNH TINH SẠCH CHITINASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP LỌC GEL SEPHADEX III.2.1. Hàm lượng protein và hoạt tính chitinase trước lọc gel Mủ cao su của 3 giống cao su GT1, PB235 và RRIM600 được tiến hành thu gom, vận chuyển, ly tâm loại cao su, giã nghiền và lọc bã trong cùng điều kiện. Sau đó, đem tủa dịch lọc từ 3 giống cao su này với (NH4)2SO4 95% độ bão hòa. Cặn tủa sau ly tâm được hòa vào dịch đệm citrate pH 5,0, thẩm tích để loại muối và được giữ trong tủ lạnh. Tiến hành xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry và xác định hoạt tính chitinase theo phương pháp định lượng đường khử bằng DNS với đường chuẩn N-acetylglucosamin. Bảng 3.5: Hàm lượng và hoạt tính chitinase của 3 giống cao su trước lọc gel Giống cao su Hàm lượng protein (mg/ml) Hoạt tính chitinase (UI/ml) Hoạt tính riêng (UI/mg protein) GT1 2,74 32,10 11,72 PB235 3,12 29,40 9,42 RRIM600 3,36 32,40 9,64 Nhận xét: Xét về hàm lượng protein, giống GT1 cho hàm lượng protein thấp nhất với 2,74mg/ml, RRIM600 cho hàm lượng protein nhiều nhất với kết quả 3,36mg/ml trong khi ở PB235 là 3,12mg/ml. Kết quả thu được trong thí nghiệm này thấp hơn trong thí nghiệm của Klaikherd [15]. Klaikherd cũng tiến hành xác định hàm lượng protein từ mủ cao su bằng phương pháp Lowry, kết quả cho thấy mủ cao su chứa protein với hàm lượng 6,0mg/ml. Điều này có thể do sự khác biệt trong điều kiện thí nghiệm. Trong thí nghiệm của Klaikherd, nguồn gốc mủ cao su không rõ từ giống cao su nào và mủ được thu tại Thái Lan. Trong khi ở thí Nguyễn Quang Nhân - 59 - Phần III: Kết quả và thảo luận nghiệm này, mủ cao su thu được từ ba giống cao su GT1, PB235 và RRIM600 ở Việt Nam. Xét về hoạt tính chitinase, giống RRIM600 cũng cho hoạt tính tốt nhất với 32,40UI/ml, hoạt tính ở hai giống còn lại lần lượt ở GT1 và PB235 là 32,10UI/ml và 29,40UI/ml. Như vậy hoạt tính chitinase ở ba giống không có sự chênh lệch đáng kể. Hoạt tính riêng của ba giống cũng gần bằng nhau với 11,72UI/mg protein ở GT1, 9,42UI/mg protein ở PB235 và 9,64 ở giống RRIM600. Kết quả này cao hơn nhiều khi đem so sánh với thí nghiệm của Klaikherd. Trong thí nghiệm của mình, Klaikherd cho trộn dịch enzyme từ mủ cao su và β-chitin từ mai mực, rồi đo hàm lượng đường khử tạo thành theo phương pháp Schale cải tiến. Kết quả đạt được hoạt tính chitinase là 18mU/mg protein. Trong khi ở thí nghiệm này, cơ chất sử dụng là huyền phù chitin vỏ tôm và xác định hoạt tính chitinase thông qua sử dụng DNS. Việc khác biệt về điều kiện thí nghiệm, phương pháp xác định hoạt tính chitinase, cơ chất, nguồn enzyme và cả định nghĩa đơn vị hoạt tính là những lý giải cho sự sai khác khá rõ trong kết quả hoạt tính chitinase khi so sánh giữa hai thí nghiệm này. III.2.2. Kết quả đo OD 280nm các phân đoạn lọc gel ở 3 giống cao su Quá trình lọc gel tiến hành theo mô tả trong phần II.2.7. Các phân đoạn thu được, được đo OD 280nm xác định sơ lược hàm lượng protein mỗi phân đoạn bằng phương pháp quang phổ. Từ đồ thị hàm lượng protein này, ta có thể xác định các peak thu được qua lọc gel. Trộn các phân đoạn thuộc cùng một peak và đem xác định hoạt tính chitinase để thu được các peak có hoạt tính cần quan tâm. Nguyễn Quang Nhân - 60 - Phần III: Kết quả và thảo luận • Giống GT1 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Ống O D 2 80 nm Đồ thị 3.1: Kết quả đo OD 280nm các ống lọc gel giống cao su GT1 • Giống PB235 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Ống O D 2 80 nm Đồ thị 3.2: Kết quả đo OD 280nm các ống lọc gel của giống cao su PB235 Nguyễn Quang Nhân - 61 - Phần III: Kết quả và thảo luận • Giống RRIM600 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Ống O D 2 80 nm Đồ thị 3.3: Kết quả đo OD 280nm các ống lọc gel của giống cao su RRIM600 Nhận xét: Trong phần III.3.1, hàm lượng protein thô ở GT1 thấp hơn hai giống còn lại. Điều này khá khớp với kết quả đo OD 280nm để xác định sơ lược hàm lượng protein của các peak với OD trong đồ thị 5 (giống GT1) thấp hơn đồ thị 6 và 7 (PB235 và RRIM600). Kết quả trên cho thấy, cả ba giống cao su sau lọc gel đều thu được hai peak gần kề nhau. Gel sử dụng để lọc là Sephadex G-50 với khoảng phân tách từ 1500-30000Da. Như vậy, hai peak này chứa các protein có khối lượng phân tử không chênh lệch nhiều và đều nhỏ hơn 30kDa. Kết quả này tương tự ở cả ba giống cao su khác nhau. III.2.3. Hàm lượng protein và hoạt tính chitinase sau lọc gel Các peak thu được trong phần III.3.2 được đem xác định hoạt tính chitinase thông qua DNS. Peak có hoạt tính được xác định tiếp hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry. Nguyễn Quang Nhân - 62 - Phần III: Kết quả và thảo luận Bảng 3.6: Hàm lượng và hoạt tính chitinase của 3 giống cao su sau lọc gel Giống cao su Hàm lượng protein (mg/ml) Hoạt tính chitinase (UI/ml) Hoạt tính riêng (UI/mg protein) GT1 0,066 3,93 59,55 PB235 0,105 3,78 36,00 RRIM600 0,064 3,23 50,39 Nhận xét: Các peak thu được được đem xác định hoạt tính chitinase, kết quả cho thấy chỉ có peak đầu có hoạt tính chitinase, peak còn lại không thể hiện hoạt tính chitinase. Kết quả này giống nhau ở cả ba giống cao su. Do đó, hàm lượng và hoạt tính chitinase của peak đầu tiên cũng là hàm lượng và hoạt tính chitinase của mỗi giống cao su sau lọc gel. Kết quả hoạt tính chitinase sau lọc gel thu được ở GT1 là 3,93UI/ml, PB235 là 3,78UI/ml và RRIM600 là 3,23UI/ml. Khi đem so sánh kết quả này với hoạt tính chitinase thô với các thông số 32,10UI/ml, 29,40UI/ml và 32,40UI/ml (lần lượt tương ứng với các giống GT1, PB235, RRIM600), ta thấy hoạt tính chitinase sau lọc gel đã giảm rất nhiều, sấp xỉ 10 lần. Tuy nhiên, độ giảm này ít hơn khi so sánh với độ giảm hàm lượng protein trước và sau lọc gel. Trước lọc gel hàm lượng protein lần lượt là 2,75mg/ml, 3,12mg/ml và 3,35mg/ml (tương ứng với GT1, PB235 và RRIM600). Sau lọc gel, hàm lượng protein thu được là 0,066mg/ml, 0,105mg/ml và 0,064mg/ml. Tức là hàm lượng protein giảm từ 30- 50 lần khi so sánh trước và sau lọc gel. Điều này khiến cho hoạt tính riêng của enzyme tăng từ 11,72UI/mg protein, 9,42UI/mg protein và 9,64UI/mg protein lên 59,55UI/mg protein, 36,00UI/mg protein và 50,39UI/mg protein. Tức là tăng từ 400-500%. Điều đó cũng có nghĩa là enzyme đã được tinh sạch hơn nhiều so với dịch enzyme thô ban đầu và đó cũng chính là mục đích của phần tinh sạch enzyme bằng lọc gel này. Nguyễn Quang Nhân - 63 - Phần III: Kết quả và thảo luận III.2.4. Hiệu suất hàm lượng protein và hoạt tính chitinase thu được qua lọc gel Hiệu suất hàm lượng protein và hoạt tính chitinase được tính toán theo công thức (3) ở phần II.2.7. Bảng 3.7: Hiệu suất hàm lượng protein và hoạt tính chitinase qua lọc gel Giống Hiệu suất hàm lượng (%) Hiệu suất hoạt tính (%) GT1 9,64 48,97 PB235 13,46 51,43 RRIM600 7,62 39,81 Nhận xét: Kết quả cho thấy, hiệu suất hàm lượng protein qua lọc gel là 9,64% ở GT1, 13,46% ở PB235 và 7,62% ở RRIM600. Khi so sánh với hiệu suất về hàm lượng protein thì hiệu suất về hoạt tính chitnase cao hơn với 48,97% ở GT1, 51,43 ở PB235 và 39,81 ở RRIM600. Tính trung bình, hiệu suất hàm lượng protein khoảng 10%, trong khi hiệu suất hoạt tính chitinase đạt khoảng 40-50%. Kết quả hiệu suất ở đây cũng là sự phản ánh khác của độ giảm hàm lượng và hoạt tính qua lọc gel được đề cập ở phần trên. III.2.5. Hiệu suất thu hồi chitinase từ mủ cao su Hiệu suất thu hồi chitinase từ mủ cao su được tính là khối lượng chitinase tinh sạch thu được tương ứng với trong một đơn vị thể tích mủ cao su ban đầu. Hiệu suất này thể hiện một cách tương đối lượng chitinase có trong mỗi đơn vị thể tích mủ ban đầu. Nguyễn Quang Nhân - 64 - Phần III: Kết quả và thảo luận Bảng 3.8: Hiệu suất thu hồi chitinase từ mủ cao su Giống Hiệu suất thu hồi (μg/ml mủ cao su) GT1 195,56 PB235 252,00 RRIM600 153,60 Nhận xét: Hiệu suất thu hồi chitinase có sự chênh lệch giữa các giống. Tuy nhiên, nếu tính trung bình thì khoảng 0,2mg chitinase có trong mỗi ml mủ cao su. Hiệu suất này cao hơn so với thí nghiệm của Subroto [66], trong đó mỗi lít cao su thu được khoảng 5-10g chất đông khô từ lutoid. Mỗi g chất đông khô này chứa khoảng 2-3mg hevamin mỗi loại A và B. Như vậy tối đa hiệu suất này chỉ khoảng 60μg chitinase trong mỗi ml mủ cao su. Hiệu suất này phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: giống cao su, điều kiện thổ nhưỡng, tình trạng sinh lý cây, thời gian thu mủ, phương pháp sử dụng để tách chiết và tinh sạch chitinase, điều kiện thí nghiệm .v.v… Chính các yếu tố này ta