Protease là một trong những enzyme quan trọng nhất trong công nghiệp, có tác
dụng xúc tác cho phản ứng phân giải protein, được sử dụng trong nhiều thế kỷ,
lĩnh vực sử dụng đầu tiên enzyme này là ngành sản xuất sữa.
Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase.
* Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia
thành hai loại:
+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi
polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một
tripeptide.
+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi
polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
48 trang |
Chia sẻ: lamvu291 | Lượt xem: 3061 | Lượt tải: 2
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Sắc ký ái lực tinh sạch protease, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn
PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1.1. Enzym protease phân loại và đặc điểm các loại enzym protease
Protease là một trong những enzyme quan trọng nhất trong công nghiệp, có tác
dụng xúc tác cho phản ứng phân giải protein, được sử dụng trong nhiều thế kỷ,
lĩnh vực sử dụng đầu tiên enzyme này là ngành sản xuất sữa.
Protease được phân chia thành hai loại: endopeptidase và exopeptidase.
* Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia
thành hai loại:
+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi
polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một
tripeptide.
+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi
polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.
* Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn
nhóm:
+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong
trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác
của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin.
Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin,
elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin
Carlsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở
vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 1
Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang
Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn
+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt
động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin,
bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein
proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất
rộng.
+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.
Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin,
renin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt
động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi
khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase
thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của
EDTA.
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:
- Protease acid: pH 2-4 có nhiều ở tế bào động vật, nấm men, nhưng ít thấy ở
vi khuẩn.
- Protease trung tính có pH 7-8 như papain từ quả đu đủ, bromelain từ quả dứa,
ficin từ Ficus sp là những protease có nguồn gốc từ động vật. Những protease
này là cystein protease, papain là protease ổn định với nhiệt độ nhất. Vi khuẩn
Clostridium histolyticum sản xuất ra enzyme clostripain và Streptococcus spp
sản xuất ra enzyme streptopain, đều là cysteine protease.
- Protease kiềm có pH 9-11.
* Ngoài ra có thể phân thành 2 loại khác:
Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 2
Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang
Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn
Enzyme protease nội bào là những enzyme được tiết ra từ bên ngoài hoặc ngoại
biên màng protein và được trích ly vào môi trường bằng kỹ thuật trích ly
Enzyme protease ngoại bào được thu nhận từ quá trình lên men, như quá trình lên
men trên môi trường rắn. Enzyme được thu nhận khi quá trình lên men hoàn tất
hoặc ngay khi quá trình lên men đang diễn ra. Sử dụng chất làm sạch không có
tính chất ion như Triton X-100, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80… để
lọc các enzymes.
Nhìn chung quá trình diễn ra trong khoảng từ 50-60 phút, tỷ lệ dung môi và chất
rắn là 1:8, nếu giá trị này cao hơn thì nhiều chất rắn sẽ được hòa tan, khi đó dịch
thu được sẽ chứa nhiều phân tử không cần thiết.. Nhiệt độ trích ly trong khoảng
30oC, nhưng ở nhiệt độ 4-100C sẽ giảm sự biến tính, sự thủy phân và sự phát triển
của sinh vật. Sự trích ly được tiến hành ở pH=7, tuy nhiên để tránh xảy ra sự kết
tủa thì pH gần pI.
1.2. Ứng dụng sắc ký ái lực trong tinh sạch protease
Sự tinh sạch enzyme nói chung và protease nói riêng là một quá trình phức tạp và
có nhiều phương pháp đã được ứng dụng. Mục đích của quá trình tinh sạch là tăng
độ tinh sạch, hoạt tính và khả năng tái sử dụng của enzyme.
Sắc ký là một trong những phương pháp tinh sạch, trong đó enzym tách ra khỏi
hỗn hợp ngay khi được đưa qua matrix. Các matrix sử dụng trong sắc ký có tính
chất vật lý và hóa học có khả năng tương tác với các enzym do đó nó giữ lại
enzym.
Ví dụ như protease có tính acid sẽ tương tác với một matrix base nhiều hơn một
protease trung tính. Do vậy một matrix base có thể được sử dụng để tách các
protease mang tính acid vì nó sẽ tương tác với matrix và bị giữ lại, còn những
Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 3
Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang
Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn
protease không mang tính acid sẽ chảy qua matrix. Các protease bị giữ lại sẽ được
loại bỏ hoặc tách ra khỏi matrix bằng cách phá vỡ liên kết giữa chúng hoặc làm
yếu dần các liên kết.
Hạn chế chủ yếu của các phương pháp sắc ký là thiếu tính đặc hiệu cụ thể đối với
mỗi loại protease, ví dụ như là các matrix base có khả năng giữ lại các protease
khác ngoài protease mang tính acid.
Sắc ký ái lực là có thể khắc phục được hạn chế này bằng cách bổ sung một ligand
gắn lên matrix để tạo ra tương tác đặc hiệu với phân tử cần tách. Đây là một phân
đoạn hữu ích và có hiệu quả nhất để tinh sạch các protease bằng sắc ký ái lực đơn.
Mỗi loại cơ chất tương tác với một ligand tương ứng như bảng 1.
Bảng 1: Cơ chất và ligand tương ứng trong sắc ký ái lực
Cơ Chất Ligand
Enzyme Substrate, cofactor
Antibody Antigen, Virus, Cell
Polysaccharide, glycoprotein Lectin
Nucleic acid binding protein Nucleic Acid
Hormone receptor Hormone
Đối với protease, ligand thường sử dụng nhất là các chất ức chế của nó.
Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 4
Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang
Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn
PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ÁI LỰC TRONG TINH
SẠCH PROTEASE
2.1. Cơ sở khoa học
Nguyên lý
Đầu tiên là các ligand liên kết đồng hóa trị với các matrix không hòa tan, như các
hạt agarose, sau đó matrix được cho vào cột sắc ký. Hỗn hợp dung dịch chứa
protein cần tinh sạch sẽ được cho vào cột khi đó sẽ xảy ra sự tương tác giữa
protein với các ligand được cố định trên matrix, do đó protein sẽ bị giữ lại trên
matrix, những chất không tương tác với matrix sẽ chảy qua cột. Sự tương này có
tính đặc thù và thuận nghịch. Protein được tách ra khỏi matrix bằng cách làm yếu
liên kết giữa chúng bằng phương pháp giửa giải khác nhau.
Sự tương tác sinh học giữa ligand và phân tử tinh sạch có thể là kết quả của liên
kết tĩnh điện hoặc tương tác kỵ nước, lực van der Waals hoặc là liên kết hydro.
Để rửa giải có thể sử dụng ligand cạnh tranh đặc trưng, hoặc là không cạnh tranh
bằng cách thay đổi pH, nồng độ ion hoặc là sự phân cực để phá vỡ liên kết.
Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 5
Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang
Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn
Qui trình thực hiện
Hình 1: Các bước trong sắc ký ái lực
Buớc 1: Chọn môi trường ái lực
Chọn môi trường có sẵn (ligand liên kết sẵn với matrix). Nếu không có thì phải
chọn ligand thích hợp để tạo môi trường ái lực đặc hiệu.
Ổn định môi truờng ái lực trong dung dịch đệm liên kết (binding buffer).
Buớc 2: Chuẩn bị môi trường và dung dịch đệm
Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 6
Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang
Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn
Các dung dịch và chất bảo quản cần phải rửa trước khi sử dụng. Nước và các hoá
chất sử dụng phải có chất lượng cao. Dung dịch phải được lọc qua lưới lọc 0.45
µm hoặc 0.22 µm.
Việc tái sử dụng môi trường ái lực cần phải phụ thuộc vào bản chất của mẫu. Lưu
ý tránh những chất béo.
Bước 3: Chuẩn bị mẫu và chạy mẫu
Chuẩn bị mẫu: Mẫu cần được làm sạch trước khi chạy sắc ký. Nếu có thể nên
kiểm tra ái lực của ligand với protease cần tách. Sau đó, hiệu chỉnh pH mẫu và
loại bỏ các thành phần gây gián đoạn liên kết.
Chạy mẫu: Chạy mẫu dưói điều kiện tối ưu cho quá trình liên kết các phân tử cần
tách với ligand. Cần phải kiểm soát tốc độ dòng chảy, thể tích mẫu không ảnh
hưởng đến hiệu quả liên kết.
Bước 4: Rửa giải
Thu hồi protease mục tiêu bằng cách thay đổi các điều kiện thích hợp cho quá
trình rửa giải. Có nhiều phương pháp rửa giải, không có phương pháp chung nhất
định. Có thể tiến hành quá trình rửa giải đặc hiệu bằng cách sử dụng một ligand
cạnh tranh hoặc quá trình rửa giải không đặc hiệu bằng cách thay đổi pH, lực ion
hoặc độ phân cực. Kết quả thu được protease ở dạng tinh sạch hoặc cô đặc.
Phương pháp 1: Thay đổi dung dịch đệm
Phương pháp 2: Thay đổi pH hoặc nồng độ tác nhân cần cho quá trình rửa giải.
Phương pháp này có thể gây hại cho ligand.
Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 7
Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang
Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn
Phương pháp 3: Thêm một chất cạnh tranh liên kết. Phương pháp này có thể
cải thiện tính đặc hiệu của môi trường mà sử dụng các nhóm ligand đặc hiệu. Các
phương pháp rửa giải có tính chọn lọc được ứng dụng kết hợp với các nhóm
ligand đặc hiệu.
Rửa giải pH:
Sự thay đổi pH sẽ có ảnh hưởng đến mức độ ion hoá của cac nhóm trên ligand và
protease liên kết. Sự thay đổi này có thể tác động trực tiếp đến vị trí liên kết, hoặc
tác động gián tiếp đến sự thay đổi ái lực do thay đổi cấu hình.
Giảm pH là phương pháp thường sử dụng nhất để rửa giải. Tuy nhiên việc thu các
phân đoạn phải được tiến hành ở điều kiện pH trung tính (ví dụ Tris-HCl 1M, pH
9).
Rửa giải lực ion:
Thường sử dụng NaCl (dung dịch đệm) để làm tăng lực ion.
Các enzym thường được rửa giải với nồng độ thấp hơn hoặc bằng 1M NaCl.
Rửa giải cạnh tranh:
Thường sử dụng để tách những chất liên kết trên môi trường đặc hiệu nhóm hoặc
khi ái lực liên kết giữa protein mục tiêu với ligand tương đối cao. Chất rửa giải có
thể cạnh tranh liên kết với protein mục tiêu hoặc ligand. Có thể sử dụng cơ chất
với nồng độ tăng theo gradient hoặc dạng xung.
Thường sử dụng nồng độ xấp xỉ với nồng độ của ligand. Nếu cơ chất liên kết yếu
hơn thì sẽ phải sử dụng với nồng độ cao hơn.
Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 8
Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang
Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn
Rửa giải với chất rửa giải có độ phân cực thấp:
Thường sử dụng dioxane (≤10%) hoặc ethylen glycol (≤50%).
Rửa giải chaotroptic:
Chỉ sử dụng khi không dùng được phương pháp khác. Phương pháp này làm thay
đổi cấu trúc của protein được rửa giải. Các tác nhân thường dùng là guanidin
hydrocloride, ure.
Bước 5: Ổn định lại môi trường ái lực trong binding buffer.
2.2. Các matrix thường dùng
Matrix ái lực thường được chuẩn bị bằng liên kết đồng hóa trị của một ligand với
chất rắn hỗ trợ. Agarose hay Sepharose, Sephadex và tinh bột là những chất rắn
hỗ trợ tốt bởi vì chúng dễ tạo dẫn xuất với các ligand khác nhau. Tuy nhiên gel
agarose là được sử dụng nhiều nhất vì có độ bền cao và cho phép các đại phân tử
xâm nhập dễ dàng.
Để chuẩn bị cột ái lực, matrix phải được hoạt hóa để có thể gắn ligand bằng các
liên kết đồng hóa trị. Trong một số trường hợp, một spacer arm được dùng trong
quá trình hoạt hóa, và sau đó ligand có thể liên kết đồng hóa trị. Liên kết này có
thể được thực hiện bằng nhiều phương pháp. Bảng 4.10 đưa ra những tác nhân
thường dùng để hoạt hóa matrix và cố định ligand. Tuy nhiên, các matrix hoạt
hóa đã được thương mại hóa và có thể sử dụng rất tiện lợi phù hợp với những
ligand được chọn.
Sản phẩm thương mại thường gặp nhất là:
Sepharose 4B, 6B: chỉ agarose được liên kết ngang 4%, 6% tương ứng.
Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 9
Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang
Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn
AH Sepharose: Sepharose có nhóm amine tự do.
CH Sepharose: Sepharose có nhóm carboxyl tự do.
CNBr-activated Sepharose: Sephaose được hoạt hoá bằng CNBr…
Bảng 2: Một số tác nhân hoạt hóa matrix và cố định ligand phổ biến
2.3. Ligand sử dụng để tinh sạch protease trong sắc ký ái lực
Với mỗi protease khác nhau sẽ có một ligand tương ứng. Trong sắc ký ái lực để tinh
sạch/phân tách protease từ các nguồn khác nhau, ligand thường sử dụng nhất là các
polypeptide antibiotics gramicidin S hoặc các bacitracin.
Ngoài ra người ta còn nghiên cứu tổng hợp các ligand ái lực đặc hiệu mới từ các dẫn
xuất của polypeptide. Các peptide này có cấu trúc giống cấu trúc các cơ chất của
enzym, đồng thời chứa các liên kết kháng lại sự thuỷ phân protein.
Bảng 3: Một số ligand thường sử dụng trong sắc ký ái lực
Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 10
Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang
Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn
Một số cơ chất tổng hợp tương ứng với các protease khác nhau:
Subtilisin và thermitase: Z-Ala-AIa-Leu-pNA (p-nitroanilide).
Subtilisin-like serine protease: Ala-Ala-Leu-pNA
Enzyme từ rễ cây bồ công anh kininase X: Glp-Ala-Ala-Leu-pNA.
α-Chymotrypsin: Suc-Phe-pNA.
Kallikrein: Z-D-Ala-Leu-Arg-pNA.
Leu-aminopeptidase: Leu-pNA.
Trypsin của bò và cua: Bz-D,L-Arg-pNA.
Protease PC và papain: Glp-Phe-Ala-pNA.
Carboxypeptidase PC: DNP-Ala-Ala-Leu.
Tổng hợp một số ligand:
* Boc-Leu-N(CH2 CH2) 2O
Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 11
Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang
Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn
HOBt (1-hydroxybenzotriasol) (0.69 g, 5.16 mmol) được hoà tan trong 5ml hỗn
hợp THF (tetrahydrofuran)-DMF (1:10) (1)
Boc-Leu-OH (1 g, 4.3 mmol) hoà tan trong 5ml THF (2)
Hoà trộn (1) với (2). Hỗn hợp thu được đem làm lạnh đến 0oC. Sau đó thêm DCC
đã được hoà tan trong 3ml THF vào. Cuối cùng thêm mopholine (473 µL, 5.4
mmol) vào và khuấy 15 phút ở 20oC. Dicyclohexylurea kết tủa được lọc ra, tách
lấy dung môi.
Phần cặn dầu còn lại được hoà tan trong 120ml ethylacetate. Dung dịch này sau đó
được rửa bằng nước, bão hoà NaHCO3 và nước, làm khô với MgSO4. Cuối cùng
bốc hơi dung môi, thu được 0.91g Boc-Leu-N(CH2 CH2)2O, hiệu suất 81%.
* H-Leu-N(CH2 CH2) 2O *HCl
Boc-Leu-N(CH2 CH2)2O (0.91 g, 3 mmol) được hoà tan trong 15ml HCl 3.4M
trong dioxane. Hỗn hợp được khuấy 3 giờ ở 20oC. Sau đó, dung môi và HCl được
bốc hơi ở áp suất thấp. HCl được tách ra bằng cách rửa lại và bốc hơi với
methanol. Phần còn lại đem sấy khô chân không, thu được 0.642g H-Leu-N(CH2
CH2) 2O *HCl, hiệu suất 90%.
* Z-Ala-Ala-Leu-N(CH2CH2) 2O
0.425g (3.15mmol) HBOt được hoà tan trước trong 5ml hỗn hợp THF-DMF (5:1),
rồi được thêm vào (ở 0oC) 0.926g (3.15 mmol) Z-Ala-Ala-OH trong 20ml THF
khô. Tiếp tục cho vào hỗn hợp trên lần lượt được 0.779 g (3.78 mmol) DCC (đã
hoà tan trong 20ml THF), 0.749 g (3.15 mmol) H-Leu-N(CH2 CH2) 2O *HCl với
484 µL (3.46 mmol) triethylamine.
Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 12
Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang
Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn
Khuấy hỗn hợp trên ở 20oC trong 15 giờ, sau đó lọc dicyclohexylurea ra. Dịch lọc
bốc hơi ở áp suất thấp, và hoà tan phần cặn dầu còn lại trong 130ml ethyl acetate.
Dung dịch được rửa với nước, bão hoà với NaHCO3 và được làm khô với MgSO4.
Cuối cùng bốc hơi ở áp suất thấp, thu được 0.83g Z-Ala-Ala-Leu-N(CH2CH2) 2O,
hiệu suất 56%.
* Ala-Ala-Leu-N(CH2CH2) 2O
508g Z-Ala-Ala-Leu-N(CH2CH2) 2O được hoà tan trong 7ml methanol, sau đó
được bài khí với ảgon và thêm 50mg chì vào. Dẫn H2 qua dung dịch trong 48 giờ
ở 20oC. Rồi thêm HCOOH để hạ pH xuống còn 2-3.
Lọc hỗn hợp và bốc hơi dung môi dưói áp suất thấp, thu được 0.33g Ala-Ala-Leu-
N(CH2CH2) 2O, hiệu suất 95%.
2.4. Một số phương pháp cố định ligand trên matrix
2.4.1. Cố định ligand thông qua tác nhân hoạt hóa cyanogen bromide
Tác nhân phổ biến nhất để liên kết ligand với matrix là cyanogen bromide
(CNBr). Nó phản ứng với nhóm hydroxyl của Sepharose ở pH kiềm.
Phản ứng:
Phản ứng của CNBr rất phức tạp. Hình 4.9 thể hiện cơ chế của việc hoạt hóa
Agarose cũng như các matrix chứa hydroxyl khác bằng CNBr. ở pH cao (khoảng
11), CNBr phản ứng với nhóm hydroxyl của matrix để tạo ra thành phần hoạt hóa
chính, cyanate ester, và các thành phần phụ khác, imidocarbonate (cyclic hoặc
acyclic), carbamate và carbonate. Tuy nhiên, các vòng imidocarbonate chiếm ưu
thế hơn trong việc hoạt hóa các dextran liên kết ngang và cellulose. Trong điều
kiện kiềm nhẹ (pH 9-10), cyanate ester và vòng imidocarbonate phản ứng dễ dàng
Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 13
Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang
Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn
với các nhóm amine cơ bản của ligand, kết quả tạo ra các dẫn xuất isourease và
imidocarbonate thay thế tương ứng (hình 2). Các nhóm amino phản ứng như
trung tâm của phản ứng này, vì vậy cần thiết phải tiến hành phản ứng ở pH 8 –
10. Ở pH này các nhóm amino vẫn không nhận thêm proton. Phản ứng cặp đôi
này không nên tiến hành trong một dung dịch đệm chứa các amine cơ bản, như
tris, glycine hoặc ethanol amine. Vì những tác nhân này sẽ cạnh tranh với các
ligand cố định. Dung dịch đệm được chọn thuồng là sodium carbonate hoặc
bicarbonate, và điều kiện cặp đôi tối ưu là ở pH 8.3. Sau khi ligand được liên kết
và loại bỏ các ligand thừa, các nhóm hoạt hóa còn lai trong matrix có thể bị khóa
lại bằng cách thêm vào một lượng dư các amine cơ bản nhỏ như tris, glycine,
ethanolamine…
Ưu điểm:
Việc hoạt hóa bằng CNBr thì đơn giản và ôn hòa cho việc liên kết các phân tử
sinh học nhạy cảm như enzym, lectin và kháng thể. Hoạt hóa CNBr có thể được
ứng dụng không chỉ với agarose, dextran hay Sephadex, mà còn có thể ứng dụng
cho các polymer tổng hợp chứa nhóm hydroxyl. Một khi được hoạt hóa các
ligand nhỏ cũng như các ligand có khối lượng phân tử lớn chứa các amine cơ bản
có thể được liên kết.
Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 14
Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang
Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn
Nhược điểm:
Một nhược điểm chính của các matrix ái lực hoạt hóa bằng CNBr là các ligand đã
cố định bị rơi ra liên tục. Liên kết yếu là nguyên nhân chính của sự không ổn định
của liên kết isoureas giữa matrix hoạt hóa và ligand.
Một nhược điểm khác của matrix này là chúng có thể hoạt động như một chất trao
đổi anion yếu, làm thúc đẩy các liên kết không đặc hiệu. Điều này làm cho dẫn
xuất isourease tích điện dương ở pH trung hòa.
Hình 2: Cơ chế hoạt hóa agarose (hoặc các polymer có nhóm hydroxyl) bằng
CNBr.
Quy trình làm việc:
Huỳnh Công Duy Khoa – Cù Thị Hằng Trang 15
Nguyễn Lê Ánh Minh – Phạm Thị Trang
Sắc ký ái lực tinh sạch protease GVHD: Thầy Lê Văn Việt Mẫn
Các tác nhân:
1. Cyanogen bromide (Aldrich, Milwaukee, WI)
2. Sepharose 4B hoặc 6B (Pharmacia)
Sự hoạt hóa:
(Lưu ý: CNBr có độc tính rất cao, phải tiến hành hoạt hóa CNBr trong thiết bị kín
có van thông hơi tốt)
1. Rửa 100ml Sepharose 4B với 1 lít nước đã được de-ion hóa trong phễu
thủy tinh và làm khô.
2. Tạo huyền phù gel trong 100ml sodium carbonate 2M trong becher.
3. Hòa tan 10g CNBr trong 5ml acetonitrile và thêm dung dịch CNBr vào
huyền phù gel và khuấy liên tục, sử dụng cánh khuấy overhead paddle.
(Chú ý: không dùng cánh khuấy từ để tránh làm vỡ hạt gel).
4. Để phản ứng hoạt hóa tiếp tục trong đúng 2 phút ở nhiệt độ phòng.
5. Rửa nhanh các hạt gel đã được hoạt hóa với 1 lít nước đá lạnh, sau đó
rửa với dung dịch đệm liên k