Tạo dòng và biểu hiện gene mã hóa interferon alpha 2b của người trên hệ thống pichia pastoris

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận văn Thạc sĩ TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trang 2 I.1. INTERFERON I.1.1. Các dạng Interferon [2],[15] Interferon là một loại cytokine có bản chất là protein do chính tế bào trong cơ thể tiết ra có khả năng ngăn cản sự phát triển cũng như xâm nhiễm của virus. Thuật ngữ interferon lần ñầu tiên ñược nhắc trong công trình của Isaacs A và Lindenmann năm 1957, lấy nguồn từ từ “interference” có nghĩa là ngăn cản khi hai ông ghi nhận khả năng kháng lại virus cúm sống ở màng phôi gà sau khi gây nhiễm bởi virus cúm ñã bị bất hoạt bằng nhiệt. Tính tới nay, rất nhiều loại interferon ñược tìm thấy và ñược ñặt bằng nhiều tên khác nhau. Trước ñây, interferon ñược chia là 3 dạng theo nguồn gốc tạo thành: interferon alpha ñược tiết bởi tế bào bạch cầu, interferon beta ñược tiết bởi nguyên bào sợi và interferon gamma ñược tiết bởi tế bào T [2]. Hiện nay, interferon ñược chia thành 3 nhóm dựa vào thụ thể của chúng.
Interferon dạng I: Interferon dạng I bao gồm 8 loại: Interferon alpha (IFN-α), Interferon beta (IFN-β), Interferon kappa (IFN-κ), Interferon delta (IFN-δ), Interferon epsilon (IFN-ε), Intereferon tau (IFN-τ), Interferon omega (IFN-ω), và Interferon zeta (IFN- ζ) (còn ñược gọi là limitin). IFN-δ, IFN-τ và IFN-ζ không tìm thấy ở người mà chỉ có ở các ñộng vật khác. IFN-ζ ñược tìm thấy ở chuột và IFN-τ có ở ñộng vật nhai lại như cừu... Hình 1.1. Interferon alpha 2b ( Luận văn Thạc sĩ TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trang 3 Trong ñó, interferon alpha gồm 13 loại: ñược ñánh số thứ tự gồm: IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNA, IFNA14, IFNA15, IFNA17, IFNA21. Trong mỗi nhóm phụ này, người ta có thể chia thành các nhóm nhỏ nữa, ví dụ như IFNA1 ñược chia thành 2 nhóm là IFNA1a, IFNA1b; IFNA2 ñược chia thành hai nhóm nhỏ là IFNA2a, IFNA2b... Tất cả các dạng interferon dạng I ñều kết hợp với một phức hợp thụ thể trên bề mặt tế bào ñược gọi là interferon- α receptor (IFNAR), mà có chứa hai chuỗi tiểu ñơn vị: IFNAR1 và IFNAR2.
Interferon dạng II: Interferon dạng II chỉ gồm 1 dạng duy nhất là Interferon gamma (IFN-γ). IFN- γ trưởng thành có cấu trúc là một anti-paralle homodimer, kết hợp với phức hợp thụ thể ở bề mặt tế bào là IFN-γ receptor (IFNGR). IFNGR cũng có cấu tạo gồm hai ñơn vị là IFNGR1 và IFNGR2 hay còn ñược viết là γR1 và γR2. Hình 1.2. Interferon gamma của người (www.wikipedia.org)
Interferon dạng III: Interferon dạng III là một nhóm gồm 3 loại interferon lambda (IFN-λ): IFN- λ1, IFN-λ2 và IFN-λ3. (Hay còn ñược ký hiệu là IL29, IL28A và IL28B). Phức hợp thụ thể của Interferon dạng III cũng gồm 2 tiểu ñơn vị là IL10R2 (còn gọi là CRF2- 4) và IFNLR1 (còn gọi là CRF2-12). Luận văn Thạc sĩ TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trang 4 I.1.2. Cơ chế hoạt ñộng của Interferon [2], [12] Khi có sự xâm nhiễm của virus, một trong những ñáp ứng ñầu tiên của hệ miễn dịch là tiết ra interferon. Sự tiết interferon ñược cảm ứng bởi nhiều tác nhân, mỗi tác nhân cảm ứng một hay nhiều loại interferon khác nhau (Hình 1.3). Hình 1.3. Biểu ñồ so sánh thời gian ñáp ứng của các thành phần hệ miễn dịch. Interferon xuất hiện ngay khi có sự xâm nhiễm của virus, trong khi các thành phần khác xuất hiện trễ hơn (Tc: tế bào T gây ñộc và kháng thể) ( Hình 1.4. Các con ñường cảm ứng tạo interferon ( Luận văn Thạc sĩ TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trang 5 Mỗi loại interferon có một tác dụng riêng nhưng nhìn chung là ñều có khả năng ức chế sự xâm nhiễm và phát triển của virus ở các giai ñoạn khác nhau ñối với từng loại virus khác nhau; ví dụ: ức chế chu trình nhân bản ngay từ bước xâm nhiễm ñối với retrovirus, hay giai ñoạn phiên mã ñối với virus cúm. Thật ra, bản thân interferon không có khả năng kháng virus mà là interferon có khả năng cảm ứng sự biểu hiện các gene hay các tế bào chức năng có khả năng kháng virus (Bảng 1.1). Bảng 1.1: Bảng tóm tắt chức năng của các dạng interferon [2, tr. 133] Chức năng Interferon alpha Interferon beta Interferon gamma Gây ñộc tế bào + + + Kháng sự hình thành khối u + + + Cảm ứng HLA lớp I + + + Kích thích sản xuất tế bào B - ± ± Kích thích tăng trưởng tế bào T ± ± + Tuy nhiên, cơ chế tác ñộng của interferon hiện nay vẫn chưa ñược biết rõ. Tổng quát, khi interferon ñược tạo ra, interferon sẽ cảm ứng các protein phụ thuộc vào dsRNA (double strand RNA – RNA mạch ñôi), trong ñó 2 protein ñược biết rõ là protein kinase 67K và 2-5 Adenylate synthetase. Protein kinase 67K dạng hoạt ñộng có khả năng phosphoryl hóa nhân tố khởi sự eIF-2 làm bất hoạt nhân tố này, còn enzyme 2-5 Adenylate synthetase có khả năng tạo 2-5 Adenylate từ ATP, 2-5 Adenylate có khả năng hoạt hóa các enzyme nuclease dẫn ñến sự phá hủy rRNA, mRNA và polysome. Ngoài ra, interferon còn cảm ứng các enzyme không phụ thuộc vào dsRNA gây ức chế sự gắn mũ methyl vào mRNA. Tất cả các sự kiện trên Luận văn Thạc sĩ TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trang 6 ñều dẫn ñến việc giai ñoạn khởi ñầu của quá trình tổng hợp protein bị ức chế, virus không thể phát triển trong tế bào. Hơn nữa, interferon còn gây biến ñổi màng tế bào ñể hạn chế sự phóng thích của virus cũng như màng tế bào chưa bị nhiễm nhằm hạn chế sự xâm nhiễm của virus. Hình 1.5. Cơ chế hoạt ñộng của interferon ( ) I.1.3. Các ứng dụng của Interferon Năm 1960, interferon ñược tách chiết lần ñầu tiên từ tế bào máu ñể ứng dụng trong trị bệnh cúm. Tuy nhiên, quá trình thu nhận khá phức tạp nên số lượng interferon thu ñược rất nhỏ và giá cực kỳ ñắt. Tại Hungary, vào năm 1972, người ta ñã bắt ñầu ứng dụng interferon ñể ñiều trị bệnh nhiễm virus ở người và sử dụng interferon ñể ñiều trị ung bướu vào năm 1975. Năm 1979, interferon ñược ứng dụng ñể chống virus Herpes trong ghép thận và trong ñiều trị bệnh một số bệnh ung thư như: ung thư xương, ung thư vú, u lympho bào, u tủy. ðầu những năm 1980, bằng công nghệ gen, các nhà khoa học ñã sản xuất thành công Interferon tái tổ hợp, khởi ñầu cho sự bùng nổ của hàng loạt Luận văn Thạc sĩ TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trang 7 những nghiên cứu tiếp theo về Interferon trong y dược. Năm 1987, Hoofnagle ñã thành công trong việc ứng dụng Interferon ñể ñiều trị bệnh viêm gan siêu vi C. Và hai năm sau, 1989, tại Mỹ, người ta ñã ứng dụng interferon ñể ñiều trị cho bệnh nhân bị ung thư bàng quang, ung thư vú và ung thư hắc tố. Ngày 25/2/1991, FDA (United States Food and Drug Administration) chính thức cho phép sử dụng interferon alpha trong ñiều trị viêm gan C. Sau ñó, năm 1998, người ta sử dụng interferon ñể ñiều trị cho bệnh nhân bị ung thư máu tại Hy Lạp. Hiện nay, interferon ñược ứng dụng rất rộng rãi: viêm gan siêu vi B, C, ung thư...Ngoài ra interferon còn ñược dùng ñể hỗ trợ ñiều trị AIDS và SARS. Bảng 1.2: Bảng tóm tắt các ứng dụng của interferon alpha trong ñiều trị một số bệnh hiện nay [2, tr. 133] Dạng bệnh Loại Interferon Bệnh lây nhiễm Viêm gan B IFN-α2b Viêm gan C IFN-α2a; IFN-α2b Rối loại huyết học Ung thư bạch cầu tế bào nhung mao (Hairy cell Leukemia) IFN-α Ung thư tủy bào mãn tính (Chronic myeloid leukemia) IFN-α Ung thư hạch bạch huyết IFN-α U rắn U sùi dạng nấm (Mycosis fungoides) IFN-α U carcinoid IFN-α Luận văn Thạc sĩ TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trang 8 Trong các loại Interferon, Interferon alpha 2b ñang ñược ứng dụng nhiều nhất trên thực tế như ñiều trị viêm gan siêu vi C, viêm gan siêu vi B và một số bệnh ung thư (như ung thư da, ung thư thận…). Vì vậy, chúng tôi chọn tạo loại Interferon alpha-2b. I.1.4. Tình hình nghiên cứu Interferon hiện nay Theo thông tin từ Trung tâm thông tin của Sở Khoa học và Công nghệ, từ năm 2005 trở về trước, chưa có ñề tài nào ñăng ký nghiên cứu về Interferon. Hiện nay, có công ty Nanogen ñã sản xuất interferon alpha 2a nhưng chỉ dùng cho gia súc và viện Vaccine và Sinh phẩm Nha Trang có sản phẩm Superferon và IVACFeron. Tuy nhiên, nhìn chung, nghiên cứu về interferon nói chung và interferon alpha 2b nói riêng vẫn còn rất ít trong khi nhu cầu về interferon cho ngành y tế hiện nay là rất cao. Trước tình hình ñó, ñề tài nghiên cứu biểu hiện ñược interferon alpha 2b trên hệ thống tế bào nấm men là rất thiết thực, không chỉ ñáp ứng cho nhu cầu về mặt y tế mà còn mở hướng nghiên cứu biểu hiện protein trên hệ thống tế bào nấm men ứng dụng cho các loại dược sinh học khác. I.2. HỆ THỐNG BIỂU HIỆN PICHIA PASTORIS I.2.1. Các hệ thống biểu hiện Interferon alpha 2b Với tiềm năng ứng dụng cao của Interferon như thế, các nhà khoa học cũng ñã tập trung nghiên cứu ñể có thể sản xuất một lượng lớn Interferon ñáp ứng nhu cầu thực tế. Bắt ñầu từ năm 1980, Nagata và cộng sự ñã biểu hiện thành công Interferon alpha trong tế bào E. coli. Năm 2005, P. Srivastava và cộng sự biểu hiện và tinh sạch Interferon alpha 2b hàm lượng cao trong E. coli. Năm 2006, Valente và cộng sự tìm ra cách thu nhận interferon alpha 2b có hoạt tính từ thể vùi khi biểu hiện hàm lượng cao ở E. coli. Tuy nhiên, vì Interferon alpha 2b cần là protein của eukaryote, nên biểu hiện trên hệ thống E. coli có nhược ñiểm là protein biểu hiện ở dạng thể vùi, không ñược glycosyl hóa, vì vậy, ñể có thể ñưa vào sử dụng, interferon alpha 2b tái tổ hợp cần qua công ñoạn tái gấp cuộn ñể phục hồi hoạt tính sinh học của protein Luận văn Thạc sĩ TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trang 9 mục tiêu. Trước vấn ñề ñó, các nhà khoa học ñã thử biểu hiện interferon nói chung và interferon alpha 2b nói riêng ở nhiều dạng tế bào eukaryote khác nhau như tế bào ñộng vật, tế bào côn trùng, và tế bào nấm men. Các nghiên cứu này cũng thu ñược kết quả nhất ñịnh. Năm 1993, Kenji Sugyima và cộng sự biểu hiện ñược interferon alpha 2 trong tế bào côn trùng Sf9 [9]. Tuy nhiên, ngoài sản phẩm chính giống với interferon tự nhiên, còn có sản phẩm protein phụ không ñược glycosyl hóa ñúng và mất một cầu nối di-sulfide. Năm 1996, Cornelia Rossmann và cộng sự ñã biểu hiện ñược Interferon alpha 2b trong tế bào ñộng vật NSo với hàm lượng tương ñối 120µg/ml với hoạt tính khá tốt (2x108 IU/mg) [5]. Kết quả này khả quan nhưng với chi phí nuôi tế bào ñộng vật, thời gian phát triển cũng như thao tác phức tạp, biểu hiện interferon trên tế bào ñộng vật không phải là giải pháp tối ưu cho việc sản xuất interferon rộng rãi. Vì vậy, tế bào nấm men là ñược coi là một giải pháp tốt cho việc biểu hiện protein của eukaryote với hướng ứng dụng vào sản xuất lớn. Khi nói về hệ thống nấm men, hiện nay có hai hệ thống biểu hiện là Saccharomyces cerevisiae và Pichia pastoris. Trong ñó, Saccharomyces cerevisiae là một hệ thống truyền thống, ñã ñược nghiên cứu biểu hiện từ những năm 1980, nhưng hệ thống này có một số nhược ñiểm như là protein tạo ra có gắn ñoạn oligosaccharide khá dài, từ 50-100 ñường manose, ñồng thời, các oligosaccharide có cầu nối glycan α1-3, vốn không thích hợp cho việc ñiều trị bệnh [11]. Với các nhược ñiểm trên, Saccharomyces cerevisiae không thỏa mãn ñược yêu cầu cầu sản xuất protein tái tổ hợp, ñặc biệt là các loại sinh dược. Ngược lại, tuy mới ñược phát hiện gần ñây nhưng Pichia pastoris ñã cho thấy tiềm năng lớn trong việc sản xuất protein. ðã có rất nhiều nghiên cứu về biểu hiện interferon trên hệ thống Pichia pastoris và ñã ñạt kết quả tốt như tinh sạch ñược interferon alpha 1 với hàm lượng protein tinh sạch ñạt 0.7mg/20ml [16], biểu hiện và tinh sạch interferon beta 1 với hàm lượng protein mục tiêu ñạt 6-12 mg/L và hoạt tính 2-3x107 IU/mg [14]. Gần ñây nhất, năm 2007, Linmei Shi cùng cộng sự biểu hiện Interferon alpha 2b có hoạt tính cao trên hệ thống tế bào nấm men Pichia pastoris (1.9 x 109 IU/mg) [10]. Các kết quả nghiên Luận văn Thạc sĩ TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trang 10 cứu này ñã mở ra một tiềm năng sản xuất Interferon alpha 2b với lượng lớn, ñáp ứng nhu cầu của thị trường trong tương lai. I.2.2. Ưu nhược ñiểm của hệ thống biểu hiện Pichia pastoris Hệ thống tế bào nấm men Pichia pastoris cần thời gian biểu hiện dài (5-6 ngày), hàm lượng tiết protein không cao như ở E.coli nhưng với mục tiêu lâu dài là phục vụ cho việc sản xuất lớn hIFNα2b, chúng tôi chọn chủng tế bào nấm men Pichia pastoris GS115 với vector biểu hiện là pPIC9K vì những ưu ñiểm sau: − Pichia pastoris là một eukaryote, nên có thể cung cấp môi trường thích hợp cho protein tái tổ hợp tiết và gấp cuộn cũng như thực hiện các biến ñổi sau dịch mã như tế bào ñộng vật [18], ñây là ñiều cần thiết ñể bảo ñảm hIFNα2b có hoạt tính. − Một ưu ñiểm của hệ thống Pichia pastoris là khi protein ñược biểu hiện ra là ñộc ñối với tế bào thì protein ñó vẫn ñược duy trì sản xuất trong tế bào [4, 6]. − Gen mục tiêu ñược chèn vào vector biểu hiện, vector biểu hiện mang gen mục tiêu ñược cắt bằng enzyme ñể tạo ra dạng thẳng sẽ sát nhập vào bộ gen của nấm men Pichia pastoris theo con ñường tái tổ hợp tương ñồng tạo ra thể biến nạp ổn ñịnh [2], ñây là ñiều mà hệ thống E. coli không thể thực hiện ñược − Có một promoter mạnh AOX1 (lượng protein tạo ra chiếm ñến 30% tổng số protein tế bào). Chất cảm ứng là Methanol - rẻ tiền hơn so với chất cảm ứng của hệ thống biểu hiện E coli (IPTG – ñây là một chất không ñược sử dụng trong sản xuất dược phẩm). − Pichia pastoris có khả năng phát triển ở pH từ 3 tới 7 do ñó có thể ñiều chỉnh pH ñể giảm thiểu tối ña hoạt ñộng của protease ñối với protein tiết ra [11]. − Có thể phát triển với mật ñộ cao hơn nhiều lần so với S. cerevisiae [19] − Có thể biểu hiện protein với hàm lượng từ milligram tới gram cả trong nghiên cứu phòng thí nghiệm lẫn trong sản xuất quy mô công nghiệp [18]. − Với vector biểu hiện pPIC9K có trình tự nhân tố α giúp protein mục tiêu ñược tiết ra ngoài môi trường nên dễ thu nhận hơn so với các hệ thống biểu hiện Luận văn Thạc sĩ TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trang 11 khác, ñồng thời các protein của bản thân loại nấm men này ñược tiết ra môi trường ở mức ñộ thấp nên quá trình tinh sạch và thu nhận hIFNα2b về sau sẽ rất dễ dàng. − Thành phần môi trường nuôi cấy ñơn giản, chi phí lên men thấp. − Có khả năng sử dụng MeOH như nguồn carbon chính nên trong môi trường có nhiều MeOH, vì vậy hạn chế ñược sự nhiễm các loài vi sinh vật khác. − Quá trình lên men có thể thực hiện nhanh chóng ñáp ứng ñáp ứng các yêu cầu cho lên men, các thông số ảnh hưởng ñến quá trình sản xuất protein và hoạt tính của protein như pH, thông khí, lượng CO2 có thể ñược kiểm soát.