Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa ex vivo của cao trà xanh giàu Epigallocatechin-3-gallate (EGCG)

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 130 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA EX VIVO CỦA CAO TRÀ XANH GIÀU EPIGALLOCATECHIN-3-GALLATE (EGCG) Trần Lê Tuyết Châu*, Nguyễn Thị Thu Vân*, Trần Thị Vân Anh*, Dương Phước An*, Trần Phi Hoàng Yến* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Các sản phẩm chứa polyphenol chiết xuất từ trà, đặc biệt là epigallocatechin-3-gallate (EGCG) – thành phần có hoạt tính sinh học hữu hiệu nhất trong nhóm hợp chất catechin của trà xanh, rất có giá trị về mặt khoa học và thương mại. Việc nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của cao trà xanh giàu EGCG rất cần thiết để góp phần khẳng định vai trò của trà xanh trong việc phòng và chữa trị nhiều loại bệnh khác nhau. Mục tiêu: Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa của cao trà xanh giàu EGCG trên chuột nhắt. Phương pháp: Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa thông qua hai chỉ số Malonyldialdehyd (MDA) và protein carbonyl. Kết quả: Với liều 60 mg EGCG/ kg thể trọng chuột, thử nghiệm 14 ngày đã thể hiện hoạt tính chống oxy hóa rõ rệt hơn thử nghiệm 7 ngày thông qua sự giảm hàm lượng MDA và protein carbonyl của nhóm thử thuốc so với nhóm tiêm CCl4 (p < 0,01) trên mô hình gây viêm gan cấp tính bằng CCl4 (0,4 mL/ kg). Kết luận: Liều 60 mg EGCG/ kg thể trọng chuột thể hiện rõ hoạt tính chống oxy hóa của cao trà xanh. Từ khóa: Camellia sinensis, trà xanh, chống oxy hóa, MDA, protein carbonyl. ABSTRACT ANTIOXIDATIVE ACTIVITY EX VIVO OF GREEN TEA EXTRACTS ENRICHED EPIGALLOCATECHIN-3-GALLATE (EGCG) Tran Le Tuyet Chau, Nguyen Thi Thu Van, Tran Thi Van Anh, Duong Phuoc An, Tran Phi Hoang Yen * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 130 - 134 Background: The product contains polyphenols, especially epigallocatechin-3-gallate (EGCG) - the most abundant catechin in green tea, are very valuable in scientific and trade. Researching the antioxidant effect of green tea is needed to confirm the role of green tea in preventing and treating many different diseases. Objective: The purpose of our work is to study the antioxidant effect of EGCG on mice. Methods: The antioxidative activity of mice liver were evaluated by determining malonyldialdehyd and protein carbonyl. Results: The antioxidant effect of EGCG after administering it perorally to mice at dose 60 mg/ kg mice body weight for 14 days is better than 7 days by decreasing malonyldialdehyd and protein carbonyl on the model of acute hepatitis caused by CCl4 (0.4 mL/ kg). Conclusion: Dose 60 mg EGCG/ kg mice body weight was showed the antioxidant effect. Key words: Camellia sinensis, green tea extract, antioxidant, MDA, protein carbonyl. *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. Trần Lê Tuyết Châu ĐT: 0903645131 Email: tuyetchau@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 131 ĐẶT VẤN ĐỀ Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) là thành phần có hoạt tính sinh học mạnh nhất trong nhóm hợp chất catechin của trà xanh, rất có giá trị về mặt khoa học và thương mại – đang được sản xuất với quy mô công nghiệp tại các nước có vùng trồng trà tập trung lớn như Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ Tiềm năng của các sản phẩm chứa polyphenol chiết xuất từ trà để ngăn ngừa hoặc cải thiện các bệnh mãn tính hiện đang là đối tượng nghiên cứu khoa học(3). Một số cơ chế đã được đề xuất để giải thích các tác dụng có lợi của trà, ví dụ: ức chế gốc tự do và chống oxy hóa(2). Các bằng chứng in vitro cho thấy polyphenol trong trà có tác dụng chống oxy hóa trực tiếp hoặc gián tiếp còn nhiều hạn chế. Vì vậy việc nghiên cứu trên động vật thí nghiệm để đánh giá tính chất chống oxy hóa của polyphenol dùng đường uống là rất cần thiết. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Cao trà xanh Cao chiết ethanol từ búp trà xanh (hàm lượng EGCG ≥ 60%) đã được tiêu chuẩn hóa. Động vật thử nghiệm Chuột nhắt trắng, đực, giống Swiss albino, trọng lượng 20±2 g (khoảng 5 – 6 tuần tuổi) do Viện Vaccin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang cung cấp. Nguyên liệu, hóa chất khảo sát Chất chuẩn 1,1’,3,3’-tetramethoxypropan, chất chuẩn Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) 98% được mua từ công ty Sigma-Aldrich (Singapore), Acid trichloracetic, Ethyl acetate, Methanol được mua từ công ty Merck (Đức). Xác định Malonyl dialdehyd (MDA)(4) Malonyl dialdehyd (MDA) là sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxy hoá lipid màng tế bào gây ra bởi các gốc tự do. MDA phản ứng với acid thiobarbituric tạo phức màu hồng có hấp thu cực đại ở bước sóng 532–535 nm. Đo độ hấp thu của phức suy ra lượng MDA trong mẫu. Hoạt tính chống oxy hoá được đánh giá là tỉ lệ phần trăm của lượng MDA giảm đi ở mẫu thử so với mẫu gây viêm gan cấp. Phương pháp xác định protein carbonyl(1) Protein carbonyl là một sản phẩm được sinh ra trong quá trình oxy hóa protein, phản ứng với 2,4-dinitrophenylhydrazin (DNPH) tạo sản phẩm có màu vàng, đo quang ở bước sóng 370 nm. Bảng 1. Hỗn hợp phản ứng định lượng protein carbonyl Thành phần Ống chứng Ống thử 100 mM PBS (pH 7,2) 320 μl 320 μl 80 mM FeSO4.7H2O 20 μl 20 μl 8 mM FeCl3.6H2O 20 μl 20 μl 4 M KCl 20 μl 20 μl 0,4 M MgCl2.2H2O 20 μl 20 μl Dịch ly tâm 200 μl 200 μl Nước cất 120 μl 120 μl Tổng cộng 720 μl 720 μl Bố trí thí nghiệm Nhóm I (nhóm sinh lý) Được nuôi ở điều kiện bình thường và cho chuột cách ly với thức ăn 16 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm. Nhóm II (nhóm chứng) Tiêm phúc mô liều duy nhất dung môi pha CCl4 trong cùng điều kiện và cho chuột cách ly với thức ăn 16 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm. Nhóm III (tiêm CCl4) 24 giờ trước khi kết thúc thí nghiệm, tiêm phúc mô liều duy nhất CCl4 (0,4 mL CCl4/ kg thể trọng chuột) và cho chuột cách ly với thức ăn 16 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm. Nhóm IV (thử thuốc) Cho chuột uống cao trà xanh với liều 60 mg EGCG/ kg trong 7 ngày hoặc 14 ngày, tiêm phúc mô liều duy nhất CCl4 (0,4 mL/ kg) vào Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 132 ngày cuối cùng và cho chuột cách ly với thức ăn 16 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm. Lưu ý: các giai đoạn trong thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa (lấy mẫu, cân, nghiền mẫu...) đều được tiến hành ở 0 – 4oC. Xử lý và phân tích số liệu Số liệu thực nghiệm được biểu diễn dưới dạng Mean ± SEM. Sử dụng phương pháp phân tích ANOVA 1 hoặc 2 yếu tố với Fisher’s PLTS Test. Ý nghĩa thống kê được xác định khi p < 0,01. KẾT QUẢ Phương trình đường chuẩn MDA Bảng 2. Kết quả xây dựng đường chuẩn định lượng MDA STT Hàm lượng MDA chuẩn (nmol/ mL) Độ hấp thu (A) 1 1,25 0,0514 2 2,50 0,0787 3 5,00 0,1519 4 10,00 0,2808 5 15,00 0,4211 6 20,00 0,5351 7 30,00 0,7883 y = 0,0258x + 0,0215 R2 = 0,9994 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 0 5 10 15 20 25 30 35 Hàm lượng MDA (nmol/ ml) Đ ộ hấ p th u Hình 1. Đường chuẩn định lượng MDA Kết quả định lượng MDA và protein carbonyl Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) của các mẫu thử nghiệm được tính theo tỉ lệ phần trăm của lượng MDA hoặc protein carbonyl giảm đi ở mẫu thử so với mẫu tiêm CCl4 để gây viêm gan cấp. Mô hình 7 ngày Bảng 3. Hàm lượng MDA và protein carbonyl trong mô hình 7 ngày Nhóm n Hàm lượng MDA (nmol/ mL) HTCO (%) Hàm lượng protein carbonyl (nmol/ mL) HTCO (%) I 6 8,817 ± 2,127 7,408 ± 1,024 II 6 9,470 ± 0,795 7,886 ± 1,199 III 6 29,651 ± 1,138 0 19,839 ± 0,398 0 IV 6 15,885 ± 2,136 46,43 (∗∗p < 0,01) 14,923 ± 1,106 24,78 (∗∗p < 0,01) Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 133 Hình 1. Hàm lượng MDA và protein carbonyl trong mô hình 7 ngày Nhận xét Hàm lượng MDA ở nhóm uống cao trà xanh (60 mg EGCG/ kg thể trọng chuột) giảm có ý nghĩa thống kê so với nhóm tiêm CCl4 (p < 0,01), HTCO đạt 46,43%. Hàm lượng protein carbonyl ở nhóm uống cao trà xanh (60 mg EGCG/ kg thể trọng chuột) giảm có ý nghĩa thống kê so với nhóm tiêm CCl4 (p < 0,01), HTCO đạt 24,78%. Bảng 4. Hàm lượng MDA và protein carbonyl trong mô hình 14 ngày Nhóm n Hàm lượng MDA (nmol/ mL) HTCO (%) Hàm lượng protein carbonyl (nmol/ mL) HTCO (%) I 6 8,928 ± 0,486 7,196 ± 0,546 II 6 9,697 ± 0,907 7,492 ± 1,618 III 6 29,699 ± 0,861 0 20,392 ± 0,979 0 IV 6 14,792 ± 1,379 50,19 (∗∗p < 0,01) 13,658 ± 1,513 33,02 (∗∗p < 0,01) Hình 2. Hàm lượng MDA và protein carbonyl trong mô hình 14 ngày Nhận xét Hàm lượng MDA ở nhóm uống cao trà xanh (60 mg EGCG/ kg thể trọng chuột) giảm có ý nghĩa thống kê so với nhóm tiêm CCl4, HTCO đạt 50,19%, thể hiện rõ khả năng chống oxy của EGCG. Hàm lượng protein carbonyl ở nhóm uống cao trà xanh (60 mg EGCG/ kg thể trọng chuột) 0 5 10 15 20 25 30 35 M D A c on ce nt ra tio n (n m ol / m l) I II III IV Group * ** H àm lư ợ ng M D A (n m ol / m L) Nhóm 0 5 10 15 20 25 30 I II III IV Group * ** Pr ot ei n ca rb on yl c on ce nt ra tio n (n m ol / m l) H àm lư ợ ng p ro te in c ar bo ny l ( nm ol / m L) Nhóm Group M D A c on ce nt ra tio n (n m ol / m l) 0 5 10 15 20 25 30 35 * ** I II III IV H àm lư ợ ng M D A (n m ol / m L) Nhóm 0 5 10 15 20 25 Pr ot ei n ca rb on yl c on ce nt ra tio n (n m ol / m l) Group I II III IV * ** H àm lư ợ ng p ro te in c ar bo ny l ( nm ol / m L) Nhóm Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 134 giảm có ý nghĩa thống kê so với nhóm tiêm CCl4, HTCO đạt 33,02%. BÀN LUẬN Việc khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của cao trà xanh giàu EGCG thông qua hai chỉ số MDA và protein carbonyl cho thấy với liều 60 mg EGCG/ kg thể trọng chuột đã thể hiện HTCO rõ rệt (p < 0,01). Số liệu thực nghiệm còn cho thấy rằng khi chuột được uống cao trà xanh dự phòng ở cả hai mô hình 7 ngày và 14 ngày đều thể hiện hoạt tính chống oxy hóa. KẾT LUẬN Cao trà xanh (liều 60 mg EGCG/ kg thể trọng chuột) thể hiện hoạt tính chống oxy hóa rõ rệt trên sự giảm hàm lượng MDA và protein carbonyl của nhóm thử thuốc so với nhóm tiêm CCl4 để gây viêm gan cấp (p < 0,01). Cảm ơn: Đề tài này được tài trợ kinh phí từ quỹ nghiên cứu khoa học của Chương trình Vườn ươm và sáng tạo KHCN trẻ - Thành đoàn Tp.HCM. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Chevion M, Berenshtein E, Stadtman ER (2000), “Human studies related to protein oxidation: protein carbonyl content as a marker of damage”, Free Radic Res. 33 Suppl:S99-108. 2. Higdon JV, Frei B (2003), “Tea catechins and polyphenols: health effects, metabolism, and antioxidant functions”, Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 43:89-143. 3. McKay DL, Blumberg JB (2002), “The role of tea in human health: an update”, J. Am. Coll. Nutr. 21:1-13. 4. Vladimirov XG, 1987, Khimiko farmaxevticheckii Zuranal, Vol. 3, pg. 236 – 249.