Tiểu luận Enzyme Amylase

Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM Khoa Công Nghệ Thực Phẩm  Bài tiểu luận Lớp 08DTP06 Sinh viên thực hiện : 1/ Nguyễn Lê Hoàng 2/ Hoàng Ngọc Duy Quang 3/ Nguyễn Thị Kim Vân 4/ Nguyễn Ngọc Trung 5/ Lê Nguyễn Nhân Luân Tháng 5/2010 - 1 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 MỤC LỤC Giới thiệu chung .............................................................................................3 A. Giới thiệu I. Khái niệm Enzyme ......................................................................................4 II. Enzyme Amylase là gì ...............................................................................4 III. Lịch sử phát hiện .......................................................................................5 B. Tổng quan về Enzyme Amylase I. Phân loại .....................................................................................................6 II. Hệ Enzyme Amylase ..................................................................................7 1. Enzyme α -Amylase ...............................................................................7 2. Enzyme β -Amylase ................................................................................11 3. Enzyme γ -Amylase ................................................................................13 4. Oligo 1,6-glucosidase ............................................................................14 5. Enzyme pullulanase ...............................................................................15 6. α-glucosidase hay maltase .....................................................................14 III. Cơ chất ......................................................................................................15 1. Tinh bột ..................................................................................................15 2. Glycogen ................................................................................................16 IV. Công nghệ lên men và thu nhận Enzyme Amylase ..................................17 1. Nguồn thu nhận .....................................................................................17 2. Thu nhận Enzyme Amylase từ thực vật ................................................19 3. Thu nhận Enzyme Amylase từ vi sinh vật .............................................22 V. Phương pháp xác định hoạt độ ...................................................................28 1. Đơn vị đo hoạt độ ..................................................................................28 2. Xác định hoạt độ Enzyme α-Amylase theo Rukhliadeva ......................28 3. Xác định hoạt độ Enzyme glucoamylase ( γ -Amylase ) ........................29 4. Điều kiện cần và đủ để thu nhận Amylase có hoạt lực cao ...................29 C. Ứng dụng Enzyme Amylase I.Ứng dụng trong sản xuất Bia ........................................................................3 3 II.Ứng dụng trong sản xuất Bánh mì ..............................................................3 7 III. Ứng dụng trong sản xuất Siro ....................................................................3 8 IV.Ứng dụng trong sản xuất cồn .....................................................................4 1 V. Ứng dụng trong sản xuất bánh kẹo ............................................................42 VI.Ứng dụng trong sản xuất Glucose và Mật .................................................4 3 VII.Ứng dụng trong chế biến thức ăn gia súc .................................................4 3 VIII. Ứng dụng trong công nghiệ p dệt ...........................................................43 Tài liệu tham khảo .....................................................................................4 5 - 2 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Giới thiệu chung Tinh bột, cùng với protein và chất béo là một thành phần quan trọng bậc nhất trong chế độ dinh dưỡng của loài người cũng như nhiều loài động vật khác. Người La Mã gọi là amilum, một từ bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp (amilon ). Trong quá trình tiêu hóa chúng bị thủy phân thành đường glucose là chất tạo nên nguồn năng lượng chính trong thực phẩm. Ngoài ra tinh bột còn giữ vai trò quan trọng trong công nghiệp thực phẩm do những tính chất hóa lý của chúng. Tinh bột thường được dùng làm chất tạo độ nhớt sánh cho các thực phẩm dạng lỏng, là tác nhân làm bền cho thực phẩm dạng keo, là các yếu tố kết dính và làm đặc để tạo độ cứng, độ đàn hồi cho nhiều loại thực phẩm. Bên cạnh đó, tinh bột còn được dùng trong các ngành công nghiệp khác như sản xuất giấy, rượu, .... Nhiều nước trên thế giới sử dụng nguồn tinh bột từ khoai tây, lúa mì, ngô (sắn), còn riêng ở nước ta thì sử dụng gạo và khoai mì là nguồn tinh bột chủ yếu. Trong chế biến tinh bột và đường, công đoạn quan trọng nhất là thuỷ phân tinh bột về các đường đơn giản. Sau đó, chủ yếu trên cơ sở đường đơn nhờ lên men, người ta sẽ nhận được rất nhiều sản phẩm quan trọng như: rượu cồn, rượu vang, bia, các loại acid hữu cơ, amino acid,… Trước đây người ta hay dùng acid hoặc H2SO4 để thủy phân tinh bột. Nhưng kết quả cho thấy, thuỷ phân bằng acid rất khó kiểm soát và thường tạo nhiều sản phẩm không mong muốn và không đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm trong khi giá thành lại cao. Cho nên hiện nay để thủy phân tinh bột người ta thường sử dụng Enzyme Amylase thu nhận từ thực vật hoặc các loại vi sinh vật. Ngoài ra, Amylase còn có nhiều ưu điểm hơn khi sử dụng acid để thuỷ phân tinh bột như năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử dụng, giảm chi phí cho quá trình tinh sạch dịch đường. Nguồn Amylase có thể lấy từ mầm thóc, mầm đại mạch ( malt ), hạt bắp nảy mầm, hay từ nấm mốc,… Trong đó Amylase được thu nhận từ malt với số lượng nhiều nhất, chủ yếu dùng trong sản xuất bia. Nguyên liệu cho sản xuất Enzyme thường là gạo, bắp, khoai mì,… đây là những nguồn nguyên liệu rẻ tiền có thể tìm thấy dễ dàng ở nước ta. Cho nên đây là một lợi thế và là hướng phát triển mạnh có thể làm cơ sở cho nhiều ngành khác phát triển. - 3 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 A. Giới Thiệu I. Khái niệm Enzyme: Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất. Sự trao đổi chất ngừng thì sự sống không còn tồn tại. Quá trình trao đổi của một chất là tập hợp của rất nhiều các phản ứng hóa học phức tạp. Các phản ứng này có liên quan chặt chẽ với nhau và điều chỉnh lẫn nhau. Enzyme là hợp chất protein xúc tác cho các phản ứng hóa học đó. Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định và đảm bảo cho các phản ứng xảy ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng trong cơ thể sống. Enzyme có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống. Chính do những tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên Enzyme còn được gọi là các chất xúc tác sinh học (biocatalysators) nhằm để phân biệt với các chất xúc tác hóa học Chúng là chất xúc tác sinh học không chỉ có vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng, phát triển của mọi sinh vật mà nó còn giữ vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen và bảo vệ mội trường. II. Enzyme Amylase là gì? Amylase là một hệ Enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật . Các Enzyme này thuộc nhóm Enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước. RR’ + H-OH  RH + R’OH Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrin hạn chế. Các Enzyme Amylase có trong nước bọt (còn được gọi là ptyalin), trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn. Trong nước bọt của người có ptyalin nhưng ở một số loại động vật có vú thì không có như ngựa, chó, mèo... Ptyalin bắt đầu thủy phân tinh bột từ miệng và quá trình này hoàn tất ở ruột non nhờ Amylase của tuyến tụy (còn được gọi là amylopsin). Amylase của malt thủy phân tinh bột lúa mạch thành disaccharide làm cơ chất cho quá trình lên men bởi nấm men. Amylase là một trong những loại Enzyme được ứng dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y tế, và nhiều lĩnh vực kinh tế khác, đặc biệt là trong ngành công nghiệp thực phẩm. - 4 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 III. Lịch sử phát hiện 1814: Kirchoff, Saint Petercburg chứng minh hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ từ 4000C – 6000C. Năm 1833, Payen và Perso (Pháp) thêm cồn vào dịch chiết này, thu được kết tủa có khả năng phân giải tinh bột thành đường, và đặt tên là Diastase (xuất phát từ tiếng Hy Lạp, diastatics, có nghĩa là phân giải, đó là Amylase). Sau này theo đề nghị của Duclo, Enzyme phân giải tinh bột được gọi là Amylase. Năm 1851: Leuchs đã phát hiện nước bọt cũng có khả năng phân giải tinh bột thành đường. Sau đó, các Enzyme Amylase trong nước bọt, trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn bắt đầu được quan tâm nghiên cứu. Năm 1862, Danilevxki đã tách được Amylase của tuyến tụy bằng phương pháp hấp thụ chọn lọc. Năm 1949, Schwimmer đã xác định được số chu chuyển của α-Amylase là 19000. Năm 1950, Englard và Singer cho biết số chu chuyển của β -Amylase là 250000. Đến năm 1952, người ta đã thu được 72 Enzyme ở trạng thái kết tinh trong đó có 4 Enzyme α-Amylase. Năm 1971, Uxtinilov và cộng sự bằng phương pháp điện di trên gel poliacrylamid đã xác định được sự có mặt của một lượng lớn α-Amylase và glucoamylase trong canh trường nấm mốc và một lượng nhỏ các phân đoạn có hoạt lực dextrinase và transglucosilase. Hiện nay các nước trên thế giới sản xuất hàng trăm tấn chế phẩm Enzyme, trong đó Nhật là nước có truyền thống lâu đời nhất, sau đó đến Anh, Pháp, Mỹ, Đan Mạch, Thụy Điển,... đặc biệt hãng Novo của Đan Mạch là 1 trong những hãng sản xuất Enzyme nổi tiếng trên thế giới. Bên cạnh đó trong những năm gần đây các nước Đông Âu và Trung Quốc cũng bắt đầu nghiên cứu và sản xuất Enzyme. Nếu như ở Tây Âu mạch nha từ lúa mạch là nguồn Enzyme chủ yếu cho việc chuyển hóa tinh bột thành đường, thì ở Viễn Đông Amylase thường được sản xuất từ nấm mốc trên môi trường nuôi cấy là các loại ngũ cốc có chứa tinh bột. Như hãng Novo đã có nhiều chế phẩm Enzyme Amylase đang được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp như: Công nghiệp sản xuất rượu bia, công nghiệp sản xuất bột giặt, công nghiệp giấy… - 5 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 B. Tổng quan về Enzyme Amylase I . Phân loại : Hiện nay, có sáu loại Enzyme Amylase được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase ( Enzyme nội bào ) và Exoamylase ( Enzyme ngoại bào ). - Endoamylase : gồm có α-Amylase (EC 3.2.1.1) và nhóm Enzyme khử nhánh. Nhóm Enzyme khử nhánh này được chia thành hai loại: khử trực tiếp là pullulanase ( hay α-dextrin 6-glucanohydrolase ) (EC 3.2.1.41); khử gián tiếp là transglucosylase (hay oligo-1,6- glucosidase) (EC 3.2.1.20) và amylo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.10). Các Enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide. - Exoamylase. Đây là những Enzyme thủy phân tinh bột tử đầu không khử của chuỗi polysaccharide. Nhóm này gồm có: + β-Amylase (EC 3.2.1.2) + Amyloglucosidase (glucoamylase hay γ-Amylase) (EC 3.2.1.3) Các loại Enzyme endoAmylase và exoAmylase * Sự khác biệt giữa các loại Enzyme Amylase: - Các loại Enzyme Amylase không chỉ khác nhau ở đặc tính mà còn khác nhau ở pH hoạt động và tính ổn định với nhiệt - Tốc độ phản ứng của Amylase phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, mức độ polyme hóa của cơ chất. Các Enzyme Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có tính chất, cơ chế tác dụng và sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân khác nhau. - 6 – Amylase Exoamylase β-Amylase γ-Amylase Endoamylase Enzym khử nhánh α-Amylase Khử trực tiếp α-dextrin 6-glucanohydrolase (pullulanase) Khử gián tiếp oligo-1,6-glucosidase (transglucosylase) Và amylo 1,6-glucosidase Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 - Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có thành phần, tính chất, nhiệt độ hoạt động, pH tối ưu và các đặc điểm thủy phân khác nhau. I I. Hệ Enzyme Amylase: 1. Enzyme α-Amylase (α-1,4-glucanohydrolase) (EC 3.2.1.1): a) Cấu tạo: Enzyme α-Amylase là protein có phân tử lượng thấp, thường nằm trong khoảng 50.000 đến 60.000 Dal. Có một số trường hợp đặc biệt như α-Amylase từ loài vi khuẩn Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến 130.000 Dal. Đến nay người ta đã biết rất rõ các chuỗi acid amin của 18 loại α-Amylase nhưng chỉ có 2 loại α-Amylase là taka-Amylase từ Apergillus orysee và α-Amylase của tụy lợn được nghiên cứu kỹ về hình thể không gian cấu trúc bậc 3. Mới đây các nghiên cứu về tính đồng nhất của chuỗi mạch acid amin và về vùng kị nước cho thấy các chuỗi mạch acid amin của tất cả các Enzyme α-Amylase đều có cấu trúc bậc 3 tương tự nhau. Cấu trúc không gian của α-Amylase b) Cơ chế tác dụng của α-Amylase: α-Amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau. α-Amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất ( tinh bột hoặc glycogen ) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. α-Amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc độ rất chậm. - 7 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-Amylase là quá trình đa giai đoạn: + Ở giai đoạn đầu ( giai đoạn dextrin hóa ): Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin ), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh ( các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh ). + Sang giai đoạn 2 ( giai đoạn đường hóa ): Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-Amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác dụng của α- Amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6 - 7 gốc glucose ( vì vậy, người ta cho rằng α-Amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6 - 7 gốc glucopiranose 1 ). + Sau đó, các poliglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α-Amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên ( 72% maltose và 19% glucose ) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%. Tóm lại, dưới tác dụng của α-Amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α-Amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-Amylase là tính chất đặc trưng của nó. Vì vậy, người ta thường gọi loại Amylase này là Amylase dextrin hóa hay Amylase dịch hóa. Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-Amylase: + Giai đoạn dextrin hóa: Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp + Giai đoạn đường hóa: Dextrin tetra và trimaltose di & monosaccharide Amylase oligosacharide poliglucose Maltose maltotriose maltotetrose c) Đặc tính α-Amylase α-Amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại α- Amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. α-Amylase là một protein giàu tyrosine, - 8 – α-Amylase Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 tryptophan, acid glutamic và aspartic. Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử Enzyme: + α-Amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine. + Trọng lượng phân tử của α-Amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da ( Knir 1956; Fisher, Stein, 1960 ). + Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng. + Protein của các α-Amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline. Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH=4,2 - 5,7 ( Bernfeld P, 1951 ). α-Amylase là một metaloEnzyme. Mỗi phân tử α-Amylase đều có chứa 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1 - 6 nguyên tử gam/mol Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của Enzyme, duy trì hoạt động của Enzyme ( Modolova, 1965 ). Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của Enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các Enzyme phân giải protein. Nếu phân tử α-Amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất. α-Amylase bền với nhiệt độ hơn các Enzyme khác. Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lượng Ca trong phân tử và nồng độ Mg2+. Tất cả các Amylase đều bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+. Một số kim loại như : Li+, Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Sn2+, Cr3+, không có ảnh hưởng mấy đến α- Amylase. Một đặc điểm cần lưu ý là hầu hết α-Amylase khá bền với tác động của protease như pepsin, trypsin, papain... Thành phần amino acid của α-Amylase ở nấm mốc Aspergillus như sau ( g/100 g protein ): alamine = 6,8 ; glycine = 6,6 ; valine = 6,9 ; leucine = 8,3 ; Isoleucine = 5,2 ; prolin = 4,2 ; phenylalanine = 4,2 ; tyrosine = 9,5 ; trytophan = 4,0; xetin = 6,5 ; trionin = 10,7 ; cystein + cystine = 1,6 ; glutamic acid = 6,9 ; amide = 1,5 ( Akabori et amilose 1954 ). Không giống các α-Amylase khác, Amylase của Asp.orysee có chứa phần phi protein là polysaccharide. Polyose này bao gồm 8 mol maltose, 1 mol glucose, 2 mol hexosemin trên 1 mol Enzyme ( Akabori et amilose, 1965 ). Vai trò của polyose này vẫn chưa rõ, song đã biết được rằng nó không tham gia vào thành phần của trung tâm hoạt động và nằm ở phía trong phân tử Enzyme. α-Amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị thương tổn. Sản phẩm cuối cùng của thủy phân Amylase là glucose và maltose. Đối với nấm sợi tỉ lệ là 1:3,79 ( Hanrahan, Caldwell, 1953 ) . Fenikxova và Eromsina (1991) cho biết rằng các maltopentose và maltohexose bị thủy phân theo sơ đồ sau: - 9 – Nhóm 4 Enzyme Amylase Lớp 08DTP06 G5 G4 + G1; G6  G2 + G4 hay 2G3 ( chính ) hoặc G5 + G1 ( ít ) α-Amylase của nấm sợi không tấn công liên kết α-1,6 glucoside của amylopectin, nên khi thủy phân nó sẽ tạo thành các dextrin tới hạn phân nhánh. Đây là một cấu trúc phân tử tinh bột do Enzyme α-Amylase phân cắt tạo thành dextrin tới hạn phân nhánh. Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của Amylase nấm sợi chủ yếu là maltose, thứ đến là maltotriose. Nồng độ α-Amylase của VSV tương đối lớn có thể chuyển hóa 70 - 85% tinh bột thành đường lên men. Còn các α-Amylase của nấm mốc thì mức độ đường hóa đến glucose và maltose có thể lên tới 84 - 87%. Điều kiện hoạt động của α-Amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của α-Amylase từ nấm sợi là 4,0 - 4,8 ( có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4,5 - 5,8 ). Theo số liệu của Liphis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm Amylase từ Asp.orysee trong vùng 5,6 - 6,2. Còn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6,0 - 7,0. Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau. α-Amylase của Asp.orysee bền vững đối với acid tốt hơn là α-Amylase của malt và vi khuẩn Bac.subtilis. Ở pH= 3,6 và 0oC, α-Amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15 - 30 phút; α-Amylase vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt lực của α-Amylase của nấm sợi hình như không giảm bao nhiêu ( Fenilxova, Rmoshinoi 1989 ). Trong dung dịch α-Amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH= 5,0 - 5,5 ; α-Amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có thể chịu được pH từ 2,5-2,8. Ở 0oC và pH= 2,5 , nó chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1 giờ. - 10 –