Tiểu luận Sản xuất Scleroglucan từ giống Sclerotium

MỤC LỤC 1. GIỚI THIỆU VỀ SCLEROGLUCAN ............................................................................... 3 1.1. Cấu trúc hóa học ........................................................................................................ 3 1.2. Tính chất của scleroglucan......................................................................................... 3 2. NGUYÊN LIỆU VÀ CON GIỐNG .................................................................................. 5 2.1. Mật rĩ .......................................................................................................................... 5 2.2. Nước ........................................................................................................................... 7 2.3. Phụ liệu: ..................................................................................................................... 9 2.3.1. Acid citric........................................................................................................... 9 2.3.2. Acid sulfuric H2SO4 ........................................................................................... 9 2.3.3. NaOH ................................................................................................................. 9 2.3.4. Ammonium sulfate (NH4)2SO4 .......................................................................... 9 2.3.5. Potassium chloride KCl ..................................................................................... 9 2.3.6. Ferrous sulfate FeSO4.7H2O ............................................................................ 10 2.3.7. K2HPO4 ............................................................................................................ 10 2.3.8. Sodium nitrate NaNO3 ..................................................................................... 10 2.3.9. Manganese Sulfate MgSO4·7H2O.................................................................... 10 2.3.10. Sucrose ............................................................................................................. 10 2.3.11. Ethanol ............................................................................................................. 11 2.3.12. Dịch chiết malt ................................................................................................. 11 2.3.13. Dịch chiết nấm men ......................................................................................... 11 2.4. Vi sinh vật sử dụng .................................................................................................. 11 3. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ ........................................................................................... 14 3.1. Quy trình .................................................................................................................. 14 3.2. Giải thích quy trình .................................................................................................. 15 3.2.1. Xử lý mật rĩ ...................................................................................................... 15 3.2.2. Chuẩn bị môi trường ........................................................................................ 16 3.2.3. Nhân giống ....................................................................................................... 17 3.2.4. Lên men ........................................................................................................... 18 3.2.5. Trung hòa, pha loãng, gia nhiệt ....................................................................... 24 3.2.6. Đồng hóa .......................................................................................................... 24 3.2.7. Ly tâm .............................................................................................................. 25 3.2.8. Tinh sạch: ......................................................................................................... 26 3.2.9. Sấy.................................................................................................................... 27 3.2.10. Nghiền .............................................................................................................. 28 4. SẢN PHẨM ..................................................................................................................... 30 5. THÀNH TỰU .................................................................................................................. 31 5.1. Tăng cường sự tổng hợp scleroglucan với Sclerotium rolfsii bằng cách sử dụng tiền chất .................................................................................................................................. 31 5.2. Hoàn lưu sinh khối nấm men kết hợp giới hạn lượng oxy cung cấp để tăng lượng scleroglucan tổng hợp được cũng như giảm lượng oxalic acid hình thành. ........................ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................................... 33 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Thành phần hóa học trong rỉ đường mía (có 80% chất khô) ........................................ 5 Bảng 2: Thành phần vitamin chứa trong rỉ đường mía và rỉ đường củ cải (tính theo mg/ 100 g rỉ đường) .................................................................................................................................... 6 Bảng 3: Một số chỉ tiêu mật rĩ ................................................................................................... 6 Bảng 4: Các chỉ tiêu cảm quan và hóa lý của nước ................................................................... 8 Bảng 5: Chỉ tiêu vi sinh của nước uống (quy định số 80/778/EEC) .......................................... 8 Bảng 6: Ảnh hưởng của nồng độ UMP, UDPG và thời gian bổ sung lên luộng scleroglucan và sinh khối tạo thành bởi S.rolfsii ............................................................................................... 32 DANH MỤC HÌNH Hình 1: Cấu trúc phân tử của scleroglucan ................................................................................ 3 Hình 2: Rỉ đường từ mía ............................................................................................................ 5 Hình 3: Hình thái sợi nấm S.rolfsii .......................................................................................... 12 Hình 4: Thiết bị xử lý nhiệt mật rĩ. .......................................................................................... 15 Hình 5: Thiết bị ly tâm làm sạch mật rĩ. .................................................................................. 16 Hình 6: Thiết bị phối trộn ........................................................................................................ 17 Hình 7: Con đường sinh tổng hợp scleroglucan ...................................................................... 19 Hình 8: Quá trình dị hóa glucose và hình thành oxalate. ......................................................... 20 Hình 9: Thiết bị lên men bề sâu. .............................................................................................. 23 Hình 10: Thiết bị đồng hóa bằng cánh khấy ............................................................................ 25 Hình 11: Máy ly tâm lắng nằm ngang. .................................................................................... 26 Hình 12: Thiết bị lọc khung bản .............................................................................................. 27 Hình 13: Thiết bị sấy chân không ............................................................................................ 28 Hình 14: Thiết bị nghiền búa ................................................................................................... 29 Hình 15: Ảnh hưởng tiền chất nồng độ lên lượng sclerglucan và sinh khối tạo thành bởi S.rolfsii ..................................................................................................................................... 31 Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 3 1. GIỚI THIỆU VỀ SCLEROGLUCAN Scleroglucan là polymer sinh học, là polysaccharide ngoại bào được nghiên cứu, do giống Sclerotium tiết ra. Tên thương mại là polytran® (Pullsbury Co.), biopolymer CS® (CECA S.E, France)… Scleroglucan được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau, một trong những lĩnh vực đó là thực phẩm. 1.1. Cấu trúc hóa học Scleroglucan là một polysaccharide trung tính mà khi thủy phân hoàn toàn sẽ tạo ra D-glucose. Polymer này là một chuỗi β-D-(1,3)-glucopyranosyl, và cứ mỗi ba phân tử đường có 1 nhánh β-D-(1,6)-glucopyranosyl. Hình 1: Cấu trúc phân tử của scleroglucan Khối lượng phân tử và chiều dài chuỗi polymer phụ thuộc vào canh trường vi sinh vật sử dụng. Thông thường phân tử khối trung bình từ (1,3 ÷ 3,2)x105 tới (0,3 ÷ 6,0)x106Da. 1.2. Tính chất của scleroglucan Tính chất của scleroglucan ảnh hưởng bởi khối lượng phân tử và phương pháp thu nhận. Thêm nữa, tính chất của dung dịch scleroglucan cũng khác nhau tùy thuộc vào mức độ sử dụng. Biopolymer CS-6 chứa 60 ÷ 70% scleroglucan, trong khi CS-11 là sản phẩm đã tinh chế, chứa 85 ÷ 90% polysaccharide. Tính hòa tan: Scleroglucan phân tán trong nước tương đối dễ ở nhiệt độ phòng do sự hiện diện của nhóm β-D-(1,6)-glucopyranosyl và giảm khả năng tạo gel. Scleroglucan được tinh chế tan tốt trong nước nóng và cả nước lạnh để hình thành dung dịch giả dẻo chịu được nhiệt độ cao, khoảng pH rộng và nhiều chất điện giải, trong khi nếu tách sản phẩm thô từ canh trường lên men sẽ có độ nhớt thấp. Sự khuấy trộn, nhiệt độ, pH, và nồng độ ảnh hưởng tới tốc độ hình thành độ nhớt. Độ nhớt của dung dịch chịu rất ít ảnh hưởng bởi sự biến động của nhiệt độ. Trong khoảng nhiệt độ 10 ÷ 90oC, độ nhớt của nó chỉ biến đổi 0,5 ÷ 2%. Độ nhớt của dung dịch scleroglucan không bị ảnh hưởng khi pH = 1 ÷ 11. Trong dung dịch có dimethylsulphoxide, hay dung dịch có pH= 12,5 hoặc cao hơn, hay có nhiệt độ lớn hơn 900C, thì độ nhớt giảm do cấu trúc xoắn bậc 3 bị phá vỡ hình thành các chuỗi xoắn đơn. Scleroglucan hình thành gel bền khi có mặt muối Crom và borax ở pH = 10 ÷ 11, có thể bị kết tủa khi thêm muối ammonium bậc 4 khi trong điều kiện kiềm Khả năng tương thích với các ion: Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 4 Scleroglucan hydrate sơ bộ tương thích với chất điện ly như NaCl 5%, Na2SO4 5%, CaCl2 20%, Na2HPO4 10%. Tuy nghiên khi nồng độ các chất điện ly tăng cao, dung dịch có thể gel hóa và kết chùm lại. Scleroglucan có tính tương thích với hầu hết các chất làm đông như alginate, xanthan, dẫn xuất cellulose. Scleroglucan vẫn giữ được tính hòa tan khi dung dịch chứa 50% glycol và polyol, độ nhớt của dung dịch tăng cao chỉ khi nồng độ polyol trên 20%. Tính lưu biến: Giả dẻo là đặc tính quan trọng của dung dịch scleroglucan, tính lưu biến của dung dịch scleroglucan 0,8% không đáng kể, trừ khi nhiệt độ giảm xuống dưới 10oC. Vì tính giả dẻo cao đó mà trạng thái keo của dung dịch được giữ vững. Theo đó, dung dịch 1,2 ÷ 1,5% gum tinh khiết sẽ gel hóa ở khoảng 25oC, nhưng ở dưới 10oC, ngay cả những dung dịch rất loãng từ chất tạo gel có cấu trúc phức tạp sẽ đông kết khi để yên trong một thời gian dài. Cấu trúc gel rối rắm này sẽ nhanh chóng bị phân tán khi khuấy trộn. Tính lơ lửng: Bản thân trong hệ giả dẻo đã có kết hợp khả năng làm lơ lửng những chất tinh khiết với sự chảy dễ dàng của huyền phù. Scleroglucan sạch với 0,1 ÷ 0,2% làm bền huyền phù 5 ÷ 10% những chất tinh khiết như kẽm oxit, kết tủa calci carbonate, và sulphamerazine. Độ nhớt huyền phù kết hợp scleroglucan với bentonite là sự điều phối. Theo đó, độ nhớt biểu kiến của 0,15% gum tinh khiết và 5% bentonite là khoảng 300cps, nhưng khi trộn cả hai cái đó có độ nhớt > 4000. Mặc dù không phải chất tạo nhũ tương bậc một trong các chất hoạt động bề mặt, scleroglucan làm giảm năng lượng phân tán khi hình thành độ bền nhũ tương. Thêm nữa, việc ngăn cản sự đông tụ là cơ sở cho tính bền này. Sinh lý học: Những nghiên cứu khi cho chó và chuột ăn thử trong thời gian dài không cho thấy biểu hiện của việc ngộ độc, máu bất thường, hay những bệnh lý ở các mô. Những kiểm tra về mắt và da trên heo, thỏ và người không chứng tỏ những phản ứng đáng kể hoặc gây kích ứng. với gà và chó, scleroglucan trong bữa ăn làm giảm lượng cholesterol và tăng cường sự bài tiết chất béo. Giống những β-glucan khác, scleroglucan thể hiện khả năng chống ung thư, nhưng nó hiệu quả hơn những polysaccharide khác như curdlan và β-glucan. Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 5 2. NGUYÊN LIỆU VÀ CON GIỐNG 2.1. Mật rĩ 2.1.1. Giới thiệu: Rỉ đường là thứ phẩm của công nghiệp đường thu được ở công đoạn kết tinh đường. Có hai loại rỉ đường: rỉ đường mía và rỉ đường củ cải. Ở Việt Nam chỉ dùng rỉ đường mía. So với rỉ đường củ cải thì rỉ đường mía có lượng saccharose thấp hơn nhưng lượng đường khử cao hơn. Thành phần của rỉ đường mía phụ thuộc vào giống mía, thổ nhưỡng, điều kiện canh tác và công nghệ sản xuất. Lượng chất khô trong rỉ đường mía chiếm 75 ÷ 85% khối lượng; trong đó chất khô đường chiếm tới 60% (chủ yếu là saccharose và đường khử, một lượng nhỏ raffinose, 5% acid niconitic và không có betain). Số còn lại là các hợp chất vô cơ và hữu cơ. Trong các hợp chất vô cơ có các ion: K+, Na+, Cl- , Ca2+, Mg2+, SO32-…, các hợp chất hữu cơ có pectin, furfurol, acid hữu cơ, các chất màu, acid amin, vitamin. Tuy nhiên hàm lượng các chất chứa nitơ là rất thấp, cần bổ sung khi sử dụng. Hình 2: Rỉ đường từ mía Rỉ đường mía thường có màu nâu sẫm, mùi thơm ngọt hơi chua giống như mùi trái cây, có chứa acid bay hơi 0,6 ÷ 0,9 % khối lượng. Rỉ đường mía khác với rỉ đường củ cải về thành phần hóa học. Rỉ đường mía chứa ít đường saccharose hơn và nhiều đường nghịch đảo hơn, chứa ít hàm lượng Nitơ, chứa ít đường raffinose hơn và có màu sậm hơn so với rỉ đường từ củ cải. Hàm lượng khoáng trong rỉ đường từ củ cải chiếm 8,5 ÷ 14% khối lượng. Thành phần chính trong tro là K2O (chiếm 60 ÷ 70%), CaO (4,5 ÷ 7%), MgO (1%), P2O5 thấp (0,2 ÷ 0,6%) do phần lớn phospho đã được tách ra khỏi củ cải trong quá trình trích ly đường. Hàm lượng vitamin (mg/100 g rỉ đường) trong rỉ đường mía và củ cải lần lượt là 10,5 và 10,4. Bảng 1: Thành phần hóa học trong rỉ đường mía (có 80% chất khô) Các chất thành phần Hàm lượng % trong rỉ đường Các chất thành phần Hàm lượng % trong rỉ đường Saccharose 42 SiO2 0,5 Đường khử 30 SO3 1,6 Chất hữu cơ phi đường 10 Cl2 0,4 Chất tro 8 Na2O + Fe2O3 + Al2O3 0,2 Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 6 Trong đó: K2O 3,5 P2O5 0,2 CaO 1,5 N tổng 0,5 ÷ 2,2 MgO 1 N amin (không thủy phân) 0,2 ÷ 0,5 Các chất keo 0,2 ÷ 1,0 Bảng 2: Thành phần vitamin chứa trong rỉ đường mía và rỉ đường củ cải (tính theo mg/ 100 g rỉ đường) Thành phần Rỉ đường mía Rỉ đường củ cải Thiamine Riboflavine Pyridoxine Nicotinic acid Pantothenic acid Folic acid Biotin Inositol 0,16 0,3 1,15 2,1 3,6 0,06 0,13 158 0,18 ÷ 0,26 0,02 ÷ 0,08 0,3 ÷ 0,45 3,9 ÷ 5,2 0,06 ÷ 0,08 0,01 ÷ 0,03 0,0035 ÷ 0,006 90 ÷ 120 Những đặc tính quan trọng của rỉ đường phù hợp với quá trình lên men ứng dụng trong công nghiệp: - Chứa hàm lượng đường cao. - Ngoài đường saccharose còn chứa nhiều chất hữu cơ, vô cơ, các vitamin và các chất kích thích sinh trưởng, đặc biệt là vitamin H - Ngoài ra xét về mặt kinh tế, rỉ đường là thứ phẩm của ngành công nghiệp đường nên giá thành nguyên liệu rẻ, nguồn cung cấp dồi dào. Vì rỉ đường là môi trường dinh dưỡng khá lý tưởng nên dễ bị vi sinh vật xâm nhập và phát triển, thường gặp nhất là những vi sinh vật gây màng và gây chua, dẫn tới làm giảm chất lượng của rỉ đường. Đôi khi, số lượng vi sinh vật có thể lên đến trên 104VSV/g rỉ đường. Thông thường, vi sinh vật trong rỉ đường gồm có Bacillus (chiếm trên 90% số lượng vi sinh vật), vi khuẩn sinh acid như E.Coli, Pseudomonas..., 1 vài loài nấm men như Candida, và đôi khi có nấm mốc như Penicillium, Aspergillus... Vi sinh vật ảnh hưởng xấu đến hiệu suất lên men. Vì vậy, trong sản xuất ta hay dùng fluosilicate natri 2‰ so với trọng lượng mật rỉ để bảo quản. 2.1.2. Chỉ tiêu chất lượng mật rỉ Bảng 3: Một số chỉ tiêu mật rĩ Thành phần Chỉ tiêu Chất khô ≥ 75% khối lượng Hàm lượng saccharose 31 ÷ 50% pH 4,5 ÷ 6,0 Hàm lượng Nitơ tổng ≥ 1,4% Số lượng vi sinh vật ≤ 15000 VSV/ 1g nguyên liệu Xử lý rỉ đường: Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 7 Rỉ đường trước khi đem sử dụng cần phải được xử lý: - Acid hóa bằng H2SO4 tới pH bằng 2,8 ÷ 3 và gia nhiệt trong 6 giờ, ở nhiệt độ 90 ÷ 95oC. Lượng acid cho vào khoảng 5% khối lượng. Hoặc có thể gia nhiệt có thể tới 120oC trong 10 phút, 110oC trong 30 phút, hoặc 80 ÷ 95oC trong vòng 45 ÷ 60 phút, khi gia nhiệt thì khuấy đều. - Bổ sung nguồn N cùng các chất kháng khuẩn, khuấy đều. Nguồn N là urê hoặc amonium sulfate. - Để yên khoảng 4 giờ để lắng cặn. 2.2. Nước Nước ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất lên men cùng chất lượng sản phẩm thu được và thường cần một lượng rất lớn trong quá trình lên men. Tính chất: • Nhiệt độ đông đặc: 0oC • Nhiệt độ sôi: 100oC • Chỉ số khúc xạ (ở 20oC) so với không khí: 1,333 • Nhiệt nóng chảy: 6,012 KJ/mol • Nhiệt hóa hơi: 44,01 KJ/mol • Độ nhớt: 1,004 MPa.s • Nhiệt dung riêng ở áp suất 0,101 MPa của: o Nước đá (0oC): 1,039 J/kg.K o Nước (15oC): 4,185 J/kg.K o Hơi (100oC): 2,039 J/kg.K • Độ dẫn nhiệt của: o Nước đá (0oC): 2,34 W/m.K o Nước (45oC): 64,5 W/m.K o Hơi (100oC): 0,0231 W/m.K Những chỉ tiêu quan trong của nước cần quan tâm là chỉ tiêu hóa lý, chỉ tiêu cảm quan và chỉ tiêu vi sinh. 2.2.1. Chỉ tiêu hóa lý và cảm quan Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 8 Bảng 4: Các chỉ tiêu cảm quan và hóa lý của nước 2.2.2. Chỉ tiêu vi sinh vật Bảng 5: Chỉ tiêu vi sinh của nước uống (quy định số 80/778/EEC) Stt Chỉ tiêu Thể tích mẫu phân tích Mức khuyến cáo Mức cao nhất cho phép Phương pháp đổ hộp (sử dụng membrance vi lọc) Phương pháp MPN 1 Tổng số vi khuẩn hiếu khí 1000 10 cfu (ở 37oC) 100 cfu (ở 27oC) 2 Coliforms tổng số 100 0 MPN < 1 3 Coliform phân 100 0 MPN < 1 4 Faecal streptococci 100 0 MPN < 1 5 Sulphite reducing clostridia 20 0 MPN < 1 Tiểu luận môn công nghệ lên men GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Page 9 2.3. Phụ liệu: 2.3.1. Acid citric • Mô tả: Tinh thể không màu hay bột trắng, đối với acid citric hạng 1 cho phép có ánh vàng. Dung dịch acid citric trong nước cất nồng độ khối lượng khoảng 20g/dm3, phải trong suốt.Vị chua, không có vị lạ, không mùi. • Độ tinh sạch: > 99,5%. • Ẩm: < 0,5%. • Kim loại nặng: < 5ppm • Sắt: < 50ppm. • Oxalic: < 100ppm. • Chloride: < 50ppm. • Sulfate: <150ppm • Tạp chất cơ học: không cho phép. 2.3.2. Acid sulfuric H2SO4 Mô tả: là một acid mạnh, dạng lỏng, màu từ trắng sang vàng ngà cho đến vàng nâu. Tan vô hạn trong nước. • Độ tinh sạch: > 98% • Sắt: < 50ppm 2.3.3. NaOH Mô tả: dạng rắn hoặc tinh thể • Độ tinh sạch: > 99%. • Na2CO3: < 0,5%. • NaCl: < 0,05%. • Fe: < 6ppm. 2.3.4. Ammonium sulfate (NH4)2SO4 Mô tả: Tinh thể không màu hoặc trắng, bị phân hủy ở 280oC, 1 gram tinh thể hòa tan được trong 1,5 ml nước, không tan trong cồn, pH dung dịch 0,1M khoảng 4,5 ÷ 6. • Độ tinh sạch: > 99%. • Kim loại nặng: <10 mg/kg. • Hàm lượng tro: < 0,25%. • Selenium: < 0,003%. 2.3.5. Potassium chloride KCl Mô tả: Tinh thể không màu hoặc bột trắng, không mùi, vị mặn. Dung dịch trung tính, 1 gram tan đươc trong 2,8ml nước ở 25oC