Tiểu luận Sản xuất vitamin B12 trên quy mô công nghiệp

Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 1 MỤC LỤC PHẦN I: TỔNG QUAN .......................................................................................................... 4 I. GIỚI THIỆU CHUNG...................................................................................................... 4 II. VITAMIN B12 ............................................................................................................. 5 1. Giới thiệu chung .......................................................................................................... 5 2. Tính chất của vitamin B12 ............................................................................................ 5 3. Sản xuất vitamin B12 trên quy mô công nghiệp ....................................................... 7 PHẦN II: NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT ................................................................................ 9 I. VI SINH VẬT ................................................................................................................ 9 1. Yêu cầu về nguyên liệu ............................................................................................... 9 2. Vi sinh vật sản xuất vitamin B12 ............................................................................... 9 II. RỈ ĐƢỜNG .................................................................................................................... 14 III. HÈM RƢỢU ................................................................................................................. 15 IV. DỊCH WHEY ................................................................................................................ 16 PHẦN III: SẢN XUẤT .......................................................................................................... 19 I. QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VITAMIN B12 TỪ VI SINH VẬT .... 19 1. SƠ ĐỒ KHỐI .............................................................................................................. 19 2. SƠ ĐỔ THIẾT BỊ ........................................................................................................ 20 II. GIẢI THÍCH C[C GIAI ĐOẠN ................................................................................. 21 1. NHÂN GIỐNG ......................................................................................................... 21 2. CHUẨN BỊ MÔI TRƢỜNG LÊN MEN ................................................................ 24 3. LÊN MEN .................................................................................................................. 26 4. LY TÂM ..................................................................................................................... 30 5. ACID HÓA ................................................................................................................ 31 6. HẤP PHỤ .................................................................................................................. 32 7. GIẢI HẤP .................................................................................................................. 34 8. CÔ ĐẶC ..................................................................................................................... 35 9. KẾT TINH ................................................................................................................. 36 10. LY TÂM ..................................................................................................................... 38 11. SẤY ............................................................................................................................. 39 Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 2 Phần IV: SẢN PHẨM ............................................................................................................ 41 Phần V: THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ ............................................................................... 45 I. Nghiên cứu kh{m ph{ ra bí ẩn cuối cùng của qu{ trình sinh tổng hợp ............... 45 II. Kỹ thuật đột biến gen vi sinh vật sản xuất vitamin B12 ......................................... 46 III. Nghiên cứu việc ổn định thuốc viên nén vitamin B1+B6+B12: ............................ 51 IV. Sản phẩm Tempeh ....................................................................................................... 53 PHẦN VI: PHỤ LỤC ............................................................................................................ 60 I. Folic acid & vitamin B12 injection .............................................................................. 60 II. Vitamin B12 1000µg/1ml-Thuốc tiêm ........................................................................ 60 III. Viên nén vitamin B12 .................................................................................................. 61 PHẦN VII: TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 62 Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 3 Lời mở đầu Vitamin B12 là một loại vitamin rất cần thiết cho cơ thể con ngƣời. Trong cơ thể, nó tồn tại dƣới dạng bốn dẫn xuất m| ngƣời ta gọi là cobalamin và hoạt động nhƣ c{c yếu tố enzyme. Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng của viatmin B12 trong việc chữa trị bệnh thiếu máu ác tính và các bệnh về viêm dây thần kinh. Vitamin B12 chỉ có nhiều trong các thực phẩm đi từ nguyên liệu động vật, thực vật chứa rất ít vitamin B12. Vì thế nhu cầu tổng hợp viatmin B12 trên quy mô công nghiệp là thiết yếu, để bổ sung vitamin B12 cho những ngƣời ăn chay trƣờng và chữa các loại bệnh do thiếu vitamin B12. Trong công nghiệp, vitamin B12 hoàn toàn đƣợc tổng hợp bởi các vi sinh vật. Chúng em xin c{m ơn thầy Lê Văn Việt Mẫn đã tạo điều kiện cho chúng em có dịp tìm hiểu và thực hiện đề tài tiểu luận Sản xuất vitamin B12 trên quy mô công nghiệp, để chúng em đ{p ứng yêu cầu và nắm vững hơn những kiến thức của môn học Công nghệ lên men. Trong quá trình thực hiện mặc dù chúng em đã cố gắng hết sức nhƣng cũng không thể tránh khỏi sai sót, c{m ơn thầy đã tận tình giúp đỡ và sửa chữa để bài làm của chúng em đƣợc hoàn chỉnh hơn. Nhóm thực hiện Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 4 PHẦN I: TỔNG QUAN I. GIỚI THIỆU CHUNG Vitamin l| chất hữu cơ không cung cấp năng lƣợng cho tế b|o trong qu{ trình ph{t triển. Tuy nhiên, vai trò của vitamin lại vô cùng quan trọng cho hoạt động sống của tế b|o: vitamin thúc đẩy c{c qu{ trình trao đổi chất v| l| th|nh phần không thể thiếu đƣợc trong cấu tạo của nhiều loại enzym. Do đó việc nghiên cứu, sản xuất vitamin trở nên rất cần thiết. Vitamin đƣợc sử dụng chủ yếu ở ba lĩnh vực:  Y học.  Thực phẩm cho ngƣời.  Thức ăn gia súc. C{c nh| khoa học đã {p dụng nhiều phƣơng ph{p kh{c nhau trong công nghệ sản xuất vitamin. Bao gồm c{c phƣơng ph{p sau:  Chiết rút từ nguồn nguyên liệu thực vật v| động vật.  Tổng hợp hóa học.  Tổng hợp sinh học. Cả ba phƣơng ph{p đều có những ƣu v| nhƣợc điểm riêng, v| mỗi phƣơng ph{p cho ra những vitamin riêng. Do đó để sản xuất vitamin từ c{c nguồn nguyên liệu v| phƣơng ph{p kh{c nhau, ngƣời ta thƣờng nhắm v|o hiệu quả của phƣơng ph{p, trong đó gi{ th|nh đóng vai trò quan trọng cho việc quyết định phƣơng ph{p sản xuất. Công nghệ sản xuất vitamin theo phƣơng ph{p sinh học chỉ tập trung v|o một số vitamin đặc trƣng v| có hiệu quả nhất, bao gồm vitamin B12, vitamin B2, hỗn hợp vitamin D2 và các vitamin nhóm B khác. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 5 II. VITAMIN B12 1. Giới thiệu chung  Thuật ngữ vitamin B12 rất rộng, dùng để chỉ những hợp chất có chứa cobalamin vì trong ph}n tử của nó có chứa kim loại Coban. Tại hội nghị quốc tế về hóa sinh năm 1961, c{c nh| b{c học đã đề nghị gọi tên nhóm vitamin B12 là corinoit. Hiện nay ngƣời ta biết khoảng 100 loại chất tƣơng tự vitamin B12 trong số đó có c{c chất quan trọng thƣờng gặp nhƣ cyancobalamin (B12), hydroxycobalamin (B12 ‚b‛), nitritocobalamin (B12 ‚c‛). Hợp chất corinoit bị loại mất coban đƣợc gọi l| corin, còn acid corinic là corin có cả c{c nh{nh bên. Dạng tự nhiên của những hợp chất cobalamin l| adenosylcobalamin, methylcobalamin và hydroxocobalamin.  Cyanocobalamin, đƣợc định nghĩa l| vitamin B12, l| một hợp chất cobalamin bền vững, đƣợc sản xuất ở quy mô công nghiệp nhƣng không tìm thấy trong tự nhiên. Vitamin B12 l| một vitamin quan trọng để chữa bệnh thiếu m{u nguy hiểm v| bệnh viêm d}y thần kinh ngoại biên, đồng thời nó cũng l| một vitamin quan trọng cần bổ sung trong khẩu phần ăn động vật v| cả con ngƣời.  Bởi vì tổng hợp vitamin B12 bằng phƣơng ph{p hóa học khó khăn v| tốn kém nên ngƣời ta thƣờng sản xuất vitamin B12 đại trà bằng phƣơng pháp lên men vi sinh vật gi{n đoạn hoặc kết hợp gi{n đoạn và liên tục. 2. Tính chất của vitamin B12  Vitamin B12 có công thức hóa học là C63H90N14O14PCo.  Cấu trúc hóa học của vitamin B12 bao gồm: - Một mặt phẳng chứa các vòng pyrol và nguyên tử coban chiếm vị trí trung tâm của c{c vòng đó. - Phần thứ hai của phân tử là một nhóm nucleotid thẳng góc với mặt phẳng, trên phần nucleotid này bao gồm thành phần bazơ nitơ l| dimetyl benzimidazol và thành phần đƣờng là -D-ribofuranoza. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 6 Hình 1: Cấu trúc phân tử vitamin  Vitamin B12 thƣờng ở dạng kết tinh, có kích thƣớc rất nhỏ, m|u đỏ sẫm, không có mùi và vị.  Tan trong nƣớc, trong các dung dịch trung tính, cồn; không tan trong eter, acetol, benzen, clorofoc.  Chúng bền nhiệt khi ở dạng cyamit, nhƣng khi tiếp xúc với kim loại nặng thì rất dễ mất hoạt tính, vitamin B12 không bền trong môi trƣờng pH kiềm. Có thể nói vitamin B12 có ý nghĩa rất quan trọng trong qu{ trình trao đổi chất: nếu thiếu hoặc không đủ vitamin B12 trong cơ thể con ngƣời v| động vật sẽ g}y ra hiện tƣợng rối loạn trao đổi chất hydratcacbon v| axit béo. Cụ thể:  Vitamin B12 tham gia v|o việc sinh tổng hợp enzym metyl malomye – CoA - mutase v| rất nhiều enzym quan trọng kh{c. C{c enzym n|y tham gia v|o c{c phản ứng chuyển metyl v| qu{ trình tổng hợp methionin, cholin, thimin. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 7  Vitamin B12 tham gia v|o việc đảm bảo hoạt động của c{c cơ quan tạo ra m{u v| l|m tăng cƣờng c{c phản ứng bảo vệ cơ thể. Thiếu vitamin sẽ dẫn tới sự tho{i hóa mỡ ở gan.  Cùng với methionin, vitamin B12 tham gia v|o qu{ trình trao đổi nhóm methyl. Vitamin B12 giúp cơ thể tổng hợp methionin từ homosistein. Hình 2. Phân tử vitamin B12 3. Sản xuất vitamin B12 trên quy mô công nghiệp  Khi vitamin B12 đƣợc sản xuất theo quy mô công nghiệp thì ta phải quan tâm, kiểm so{t đến c{c yếu tố nhƣ giống vi sinh vật, cơ chất sử dụng, qu{ trình phản ứng v| qu{ trình thu nhận, tinh chế sản phẩm. Bản chất của qu{ trình sản xuất theo quy mô công nghiệp l| sản phẩm của qu{ trình có định hƣớng rõ r|ng, qui trình sản xuất đƣợc kiểm so{t từ kh}u sản xuất giống đến qu{ trình lên men v| cuối cùng l| qu{ trình thu nhận sản phẩm.  Nhƣ vậy qu{ trình lên men công nghiệp thực chất l| thực hiện v| kiểm so{t những công việc sau:  Tạo giống v| n}ng cao chất lƣợng giống. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 8  Tính to{n, thiết kế, chế tạo c{c thết bị lên men phù hợp với công nghiệp v| sản phẩm.  Thực hiện c{c kĩ thuật trong lên men.  T{ch, thu nhận v| tinh chế sản phẩm. - Để l|m đƣợc việc đó cần phải giải quyết hai vấn đề sau: a) Kỹ thuật lên men: nghiên cứu điều kiện tối ƣu trong qu{ trình lên men nhƣ thiết bị, công nghệ…nhằm đạt đƣợc hiệu suất cao cho c{c sản phẩm mong muốn. b) Kỹ thuật thu hồi sản phẩm sau lên men v| chế biến th|nh c{c dạng thƣơng phẩm, nghiên cứu c{c điều kiện trích ly, tinh chế nhằm thu đƣợc c{c chất có hoạt tính sinh học dạng tinh khiết. Nhiều kỹ thuật trong công nghiệp hóa học nhƣ: lọc, kết tủa, ly t}m, kết tinh, hấp phụ, chƣng cất, sấy… đều đƣợc sử dụng ở đ}y. Điều kiện kh{c nhau cần lƣu ý tới l| c{c chất có hoạt tính sinh học thƣờng không bền vững với c{c điều kiện nhiệt độ, pH v| c{c yếu tố vật lý khác. - Điều kiện v| phƣơng ph{p nuôi cấy vi sinh vật có ảnh hƣởng đến sự hình thành thành phần và tính chất của chất lỏng canh trƣờng. Các chế độ sinh tổng hợp cần hƣớng tới kết quả thu nhận môi trƣờng có chất nền và những tạp chất khác còn lại là tồi thiểu và có nồng độ các sản phẩm mong muốn là cực đại. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 9 PHẦN II: NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT Sản xuất vitamin B12 trong công nghiệp đi từ nguyên liệu vi sinh vật v| rỉ đƣờng hay hèm rƣợu, dịch whey. I. VI SINH VẬT 1. Yêu cầu về nguyên liệu Trong công nghệ lên men, giống vi sinh vật đóng vai trò hết sức quan trọng, ảnh hƣởng đến năng suất, chất lƣợng v| gi{ th|nh của sản phẩm. Nhƣ vậy, giống vi sinh vật sử dụng trong công nghệ lên men vitamin B12 phải thỏa mãn những yêu cầu sau:  Giống vi sinh vật đó phải cho ra vitamin B12 có chất lƣợng v| số lƣợng cao hơn hẳn c{c sản phẩm phụ kh{c.  Năng suất cao.  Phải có khả năng đồng hóa c{c nguyên liệu rẻ tiền v| dễ kiếm.  Sản phẩm của qu{ trình phải dễ d|ng t{ch ra khỏi c{c tạp chất môi trƣờng v| sinh khối vi sinh vật giống.  Vi sinh vật phải thuần khiết.  Vi sinh vật phải có tính thích nghi cao, đặc biệt phải thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp, sự ổn định nhiệt độ, {p suất thẩm thấu, pH...  Giống phải có tốc độ sinh sản v| ph{t triển mạnh trong điều kiện môi trƣờng công nghiệp.  Tốc độ trao đổi chất mạnh để nhanh tạo ra sản phẩm mong muốn.  Giống phải ổn định trong bảo quản v| điều kiện bảo quản dễ d|ng. 2. Vi sinh vật sản xuất vitamin B12 - Hiện nay, khoa học đã kh{m kh{ ra rất nhiều vi sinh vật có thể tham gia qu{ trình sinh tổng hợp vitamin B12 . Một số quy trình sản xuất vitamin đƣợc biết đến l| quy trình sản xuất vitamin từ vi khuẩn Propionic, từ xạ khuẩn Actinomyces olivacens, v| vi khuẩn sinh khí metan. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 10 - Một số vi khuẩn có khả năng sản xuất vitamin: Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Bacillus megaterium, Clostridium sticklandii, Clostridium tetanomorphum, Clostridium thermoaceticum, Corynebacterium XG, Eubacterium limosum, Methanobacterium arbophilicum, Methanobacterium ivanovii, Methanobacterium ruminantium, Methanobacterium thermoautotrophicum, Methanosarcina barkeri, Propionibacterium freudenreichii, Propionobacterium shermanii, Protaminobacter ruber, Pseudomonas denitrificans, Pseudomonas putida, Rhizobium meliloti, Rhodopseudomonas sphaeroides, Salmonella typhimurium, Spirulina platensis, Streptomyces antibioticus, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces griseus, Streptomyces olivaceus..., ngoài ra còn có các giống thuộc xạ khuẩn Actinomyces Hình 3: Vi khuẩn Propionibacterium freudenreichii - Trƣớc đ}y, ngƣời ta sử dụng chủ yếu Streptomyces griseus để sản xuất vitamin trên quy mô công nghiệp nhƣng hiện nay vi khuẩn Propionibacterium shermanii và Pseudomonas denitrificans đã thay thế ho|n to|n vi khuẩn Streptomyces. - Nguyên nhân: Vitamin B12 l| sản phẩm phụ trong sản phẩm Streptomixin nhờ Streptomyces griseus hay l| sản phẩm phụ của qu{ trình sản xuất Clotetracyclin nhờ Str. Aureofaciens. C{c qu{ trình n|y thƣờng tạo đƣợc lƣợng vitamin B12 là 2 mg/l dịch nuôi cấy nên rất khó t{ch. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 11 Việc sản xuất dựa v|o Propionibacterium shermanii hay P. freudenreichii cho hiệu suất vitamin cao hơn. Tế b|o của c{c vi khuẩn n|y chứa một lƣợng vitamin khoảng 20 mg/l. 2.1. Vi khuẩn propionic a. Phân loại vi khuẩn propionic - Đặc điểm chung:  Vi khuẩn propionic là loại vi khuẩn Gram dƣơng, không di động, không sinh bào tử, kị khí không bắt buộc.  Chúng có hình cầu, xếp th|nh đôi hoặc chuỗi.  Nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu của vi khuẩn là 300C.Lƣợng G+C trong DNA của chúng nằm trong khoảng 53-67 mol%. - Phân loại: vi khuẩn Propionic đƣợc phân loại thành 2 nhóm:  Nhóm vi khuẩn propionic sống trong sản phẩm sữa. Chúng phát triển trong môi trƣờng phômai và sữa. Trên cơ sở tính tƣơng đồng của DNA trong thành phần cấu tạo của thành tế bào, nhóm vi khuẩn propionic sống trong sản phẩm sữa đƣợc phân loại thành 6 loài: Propionibacterium freudenreichii, P. jensenii, P.theonii, P.acidipropionici, P.coccoides và P.cyclohexanicum.  Nhóm vi khuẩn propionic sống trên da. Môi trƣờng sống chính của giống propionic sống trên da l| da ngƣời.Nhóm vi khuẩn sống trên da đƣợc phân loại thành 6 loài: P.acnes, P.avidium, P.granulosum, P.lymphophilums, P.propionicum và Propioniferax innocua. Nhóm vi khuẩn sống trên da có dạng que, kị khí.  Tr{i ngƣợc với vi khuẩn propionic sống trên da, nhóm vi khuẩn propionic sống trong sản phẩm sữa không sản sinh indole và không thể hóa lỏng gelatin. Hơn thế nữa, hai nhóm này có thể đƣợc phân biệt rõ dựa vào các đặc điểm sinh lý học của nó. Do đó, hai nhóm vi khuẩn propionic này khác nhau chủ yếu dựa trên môi trƣờng sống tự nhiên của chúng. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 12 b. Đặc điểm của vi khuẩn Propionibacterium shermanii Hình 4. Vi khuẩn Propionibacterium shermanii Trong các giống vi khuẩn tham gia tổng hợp vitamin B12 có giống Propionibacterium shermanii là giống có nhiều ƣu điểm nhất và có thể đƣa v|o sản xuất công nghiệp. Vi khuẩn này có một số đặc điểm quan trọng đƣợc tóm tắt nhƣ sau:  Chúng có khả năng lên men acid lactic, glycerol, glucose, fructose, manit, lactose.  Khoảng pH hoạt động 4,5 - 7,5, pH tối ƣu cho việc sinh tổng hợp vitamin B12 là 5,8-7,5.  Nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp vitamin B12 là 28 - 300C.  Các chất dinh dƣỡng cho sự phát triển bao gồm muối amon, nƣớc amoniac, CoCl2 hoặc Co(NO3)2; các kim loại nhƣ Fe, Cu, Zn, Mn thƣờng làm giảm quá trình sinh tổng hợp vitamin B12.  C{c vitamin l|m tăng hiệu suất tổng hợp B12 bao gồm thiamin, biotin, acid nicotinic, acid tolic. 2.2 Xạ khuẩn Actinomyces Trong tất cả các giống thuộc Actinomyces có giống Actinomyces olivaceus có khả năng tổng hợp vitamin B12 cao hơn cả v| chúng đƣợc sử dụng để sản xuất vitamin B12 theo quy mô công nghiệp. Một số đặc điểm quan trọng của giống xạ khuẩn n|y đƣợc tóm tắt nhƣ sau:  Xạ khuẩn Act. Olivacens thuộc loại hiếu khí. Công nghệ lên men thực phẩm GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn 13  Chúng phát triển mạnh và sinh nhiều vitamin B12 trong môi trƣờng chứa glucose, tinh bột, mật rỉ, bã rƣợu. Trong thành phần môi trƣờng này cần cho thêm các muối amon, muối coban và CaCO3.  Sinh tổng hợp vitamin B12 chỉ xảy ra mạnh sau 24 giờ nuôi cấy.  Trong quá trình lên men, xạ khuẩn tạo ra hai pha rất rõ rệt: o Pha tạo thành sinh khối. o Pha tạo thành vitamin B12.  Thƣờng pha tạo thành vitamin B12 chỉ mạnh khi kết thúc quá trình tăng sinh khối.  pH ban đầu môi trƣờng nên điều chỉnh vào khoảng 7. Ở pha thứ nhất, pH sẽ giảm xuống khoảng 6,5 v| bƣớc sang pha thứ hai pH sẽ tăng dần lên 8,2 - 8,7.  Thổi khí có ảnh hƣởng rất lớn đến sự tổng hợp vitamin B12, do đó trong quá trình lên men bắt buộc phải có thổi khí mạnh.  Nhiệt độ cho sự phát triển và sinh tổng hợp vitamin B12 là 28-300C.  Thời gian lên men là 60 - 120 giờ (trung bình là 60 - 96 giờ). 2.3 Vi khuẩn sinh metan Trong thiên nhiên có rất nhiều vi sinh vật tham gia lần lƣợt nhiều phản ứng tạo ra khí metan. Khí metan là loại khí có thể đốt đƣợc, đồng thời nó là loại khí tạo ra hiện tƣợng hiệu ứng nhà kính lớn nhất. Cùng với sự tạo thành khí metan, vi sinh vật còn tổng hợp đƣợc số lƣợng vitamin B12 lớn. Đặc điểm chung của vi khuẩn sinh khí metan đƣơc tóm tắt nhƣ sau:  Chúng thuộc vi khuẩn Gram (-).  Chúng không c