Tiểu luận Sử dụng phương pháp rapd nghiên cứu tính đồng dạng di truyền dòng măng cụt ở Bến Tre

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Đề tài SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP RAPD NGHIÊN CỨU TÍNH ĐỒNG DẠNG DI TRUYỀN DÒNG MĂNG CỤT Ở BẾN TRE CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Ts. TRẦN NHÂN DŨNG TRỊNH MINH CHÂU Viện NC & PT Công nghệ Sinh học MSSV: 3042672 Lớp: Công nghệ Sinh học K.30 Năm 2008 LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ................................................................................................ Trang 1 MỤC LỤC................................................................................................................ 2 DANH SÁCH BẢNG .............................................................................................. 4 DANH SÁCH HÌNH................................................................................................ 5 TỪ VIẾT TẮT ......................................................................................................... 6 TÓM LƯỢC ............................................................................................................. 7 CHƯƠNG 1. ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................... 8 CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .................................................................. 9 2.1 Những thông tin cơ bản về cây măng cụt .................................................. 9 2.1.1 Phân loại ............................................................................................... 9 2.1.2 Đặc điểm thực vật học ......................................................................... 9 2.1.3 Vai trò và ứng dụng của cây măng cụt trong cuộc sống .................... 11 2.1.4 Nguồn gốc và hiện trạng cây măng cụt ở Việt Nam.......................... 11 2.2 Kỹ thuật phân tử và một số nghiên cứu liên quan về cây măng cụt ........ 12 2.2.1 Kỹ thuật PCR ..................................................................................... 13 2.2.2 Dấu phân tử RAPD ............................................................................ 15 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 17 3.1 Phương tiện nghiên cứu ........................................................................... 17 3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................... 17 3.1.2 Dụng cụ, thiết bị................................................................................. 17 3.1.3 Nguyên vật liệu .................................................................................. 17 3.1.4 Hóa chất ............................................................................................. 17 3.2 Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 18 3.2.1 Ly trích DNA ..................................................................................... 18 3.2.2 Phản ứng PCR.................................................................................... 18 3.2.3 Phân tích kết quả ................................................................................ 19 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 20 4.1 Trích DNA .............................................................................................. 20 4.2 Kết quả phản ứng PCR với mồi RAPD .................................................. 21 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................. 26 5.1 Kết luận .................................................................................................... 26 5.2 Đề nghị..................................................................................................... 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 27 PHỤ LỤC ............................................................................................................... 30 DANH SÁCH BẢNG Bảng 1. Các mồi RAPD sử dụng trong phân tích đa hình. .......................... Trang 19 Bảng 2. Kết quả đo nồng độ DNA (trích phụ lục) ................................................. 21 Bảng 3. Kết quả RAPD dòng măng cụt ở Bến Tre (trích phụ lục) ........................ 22 Bảng 4. Các mồi RAPD được sử dụng trong phân tích tương quan di truyền ...... 23 Bảng 5. Kết quả phân tích tương quan di truyền dòng măng cụt ở Bến Tre (trích phụ lục)................................................................................................................... 25 DANH SÁCH HÌNH Hình 1. Kết quả kiểm tra nhanh DNA sau khi trích..................................... Trang 21 Hình 2. Kết quả PCR mồi A13 các mẫu từ 1 10 ................................................. 23 Hình 3. Kết quả PCR mồi OPS05 các mẫu từ 1 13............................................. 24 Hình 4. Kết quả PCR mồi OPN09 các mẫu từ 1 14 ............................................ 24 Hình 5. Giản đồ phân nhóm dòng măng cụt ở Bến Tre ......................................... 26 TỪ VIẾT TẮT bp Base pair DNA Deoxyribonucleotide ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long ĐNB Đông Nam Bộ PCR Polymerase Chain Reaction QTL Qantitative Trait Loci RAPD Random Amplified Polymorphic DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism BiH2O Nước cất hai lần EB Extraction buffer EDTA Ethylenediamine-tetraacetic acid OD Optical density RNase Ribonuclease, enzime phân hủy RNA rpm Round per minute, vòng/ phút SDS Sodium dodecyl sulphate TE Tris-EDTA TÓM LƯỢC Phân tích RAPD 28 dòng măng cụt ở tỉnh Bến Tre với 7 mồi (A13, SO15, SN20, SN06, A02, OPS05, OPN09), kết quả khuếch đại được 51 băng, trong đó có 38 băng đa hình chiếm tỷ lệ 74,51%. Mồi SN20 cho kết quả khuếch đại và tỷ lệ băng đa hình cao nhất. Từ kết quả phân tích RAPD sử dụng phần mềm Biodiversity professional phân tích tương quan di truyền và vẽ giản đồ phân nhóm dòng măng cụt ở tỉnh Bến Tre. Qua phân tích di truyền cho thấy dòng măng cụt ở Bến Tre có tương quan di truyền cao với hệ số tương quan di truyền dao động từ 63,77 đến 100, và hệ số tương quan di truyền trung bình là 85,07. Từ khóa: RAPD, Dấu phân tử, đa hình, dòng măng cụt, đa dạng di truyền, Phả hệ, Phổ diện DNA. Keywords: RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA), Marker, polymorphism Varieties of mangosteen, Genetic diversity, Phylogenetic, DNA profile. CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bến Tre nổi tiếng với các loại cây đặc sản có giá trị kinh tế cao như măng cụt, sầu riêng, xoài cát Hòa Lộc, cam xoàn, bưởi da xanh, …Theo thống kê năm 2007, tỉnh Bến Tre có gần 41.000 ha trồng cây ăn trái với sản lượng khoảng 380.000 tấn mỗi năm. Trong số rất nhiều giống cây trồng, Bến Tre chọn 4 loại cây: sầu riêng, măng cụt, bưởi da xanh, cam xoàn để làm hướng phát triển chủ lực sau này. Tuy nhiên, hiện nay trong quá trình trồng nông dân ở đây đã thường chọn các giống cây từ nhiều nguồn khác nhau dựa vào cây bố mẹ có năng suất cao và sinh trưởng tốt chứ không phải giống đã được tuyển chọn từ các trung tâm sản xuất giống. Chính sự đa dạng phong phú và không ổn định về nguồn gốc của các giống cây ăn trái này đã đưa đến một vấn đề là liệu chúng có thực sự đồng đều về di truyền với nhau hay không dù tên gọi giống nhau và không phân biệt được bằng mắt thường dựa trên các đặc tính hình thái. Đa dạng trong cấu trúc gen của các giống cây đã và đang được nghiên cứu rộng rãi nhằm giúp phân biệt được những cây là cùng loài hay khác loài hoặc có quan hệ xa gần về mặt di truyền. Trên cơ sở phương pháp PCR, Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) được sử dụng hiệu quả để đánh giá tương quan di truyền của giống cây. Đề tài “Sử dụng phương pháp RAPD nghiên cứu tính đồng dạng di truyền dòng măng cụt ở Bến Tre” sử dụng kỹ thuật RAPD nhằm làm rõ được vấn đề trên sẽ giúp chúng ta ngăn chặn được những thiệt hại về mặt kinh tế do cây giống thiếu chất lượng gây ra như năng suất kém, chất lượng sản phẩm không đồng đều, khó khăn cho công tác sau thu hoạch,… đồng thời cũng giúp xác định được những giống cây đạt chất lượng làm căn cứ cho công tác chọn và sản xuất giống cây trồng đạt chất lượng và đồng nhất. Mục tiêu đề tài: Xác định sự tương quan di truyền của dòng măng cụt ở Bến Tre dựa trên phổ diện RAPD. CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Những thông tin cơ bản về cây măng cụt. 2.1.1 Phân loại Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Malpighiales Họ: Clusiaceae Chi: Garcinia Loài: G. mangostana Măng cụt tên khoa học Garcinia mangostana L., thuộc họ Bứa Guttiferae là họ có tới 35 giống và hơn 400 loài phân bố ở vùng nhiệt đới (Phạm Hoàng Hộ,1970). 2.1.2 Đặc điểm thực vật học Thân và Rễ: Cây măng cụt có kích thước trung bình, dáng đẹp, khi cây trưởng thành cao 10-25 m, với đường kính thân 0,6-0,8 m. Măng cụt ở Đồng bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) sau 30 năm trồng thường cao 6-8 m và tán rộng 6-10 m. Dáng cây thẳng đứng và vững chắc, tán hình chóp nón, cành từ thân đâm ra với một bán kính đồng đều. Cây tăng trưởng chậm (nhất là những năm đầu), thường mọc thẳng với tán ở trên. Vỏ thân cây măng cụt có màu nâu sẫm, thường chứa tanin, mangostin và amiliasin dùng làm dược liệu (trị tiêu chảy, kiết lị…). Mangostin là một lọai xanthin có khả năng chống lại nhiều loại nấm và vi khuẩn. Chất này có nhiều trong thân, lá và vỏ quả măng cụt, gỗ thân nặng và bền, thường làm đồ mộc và trang trí. Rễ phát triển chậm và yếu, độ rộng chỉ bằng 2/3 độ rộng của tán cây, rễ cây măng cụt lại không có hệ thống lông hút nên khả năng hấp thụ nước hạn chế (Nguyễn Thị Thanh Mai, 2005). Lá: Lá đơn to, hình bầu dục, hơi dài, lá dày mọc đối. Phiến lá nguyên, thuôn dài, dày và có gân giữa, nỗi rõ. Lá xanh sẫm và bóng ở mặt trên, xanh vàng và mốc ở mặt dưới có 30-40 đôi đường gân song song kéo dài tới đường lá. Dưới ánh sáng mặt trời lá có màu xanh pha vàng hoặc vàng pha xanh. Lá dài 12-15 cm, rộng 7-10 cm, lá măng cụt có khả năng quang hợp rất kém (Nguyễn Thị Thanh Mai, 2005). Hoa: Trong điều kịên thuận lợi, cây ra hoa vào năm thứ 6-7 sau khi gieo. Nếu bất lợi cây chỉ ra hoa sau 10-12 năm, thậm chí đến 15-20 năm nếu trồng ở nhiệt độ thấp (Vũ Công Hậu, 1987). Hoa thường mọc ở đầu cành. Ở miền Nam măng cụt thường ra hoa vào tháng 1-3 dương lịch và cho trái chín vào tháng 5-8 dương lịch (khoảng 104-108 ngày sau khi nở hoa). Hoa phát triển ở cành từ 2 năm trở lên, là những hoa không hoàn toàn, về hình thái là những hoa lưỡng tính, nhưng về chức năng chỉ có những hoa cái trên đó. Cũng có nhị đực mang 1-3 bao phấn (dài 5-6 mm), hoàn toàn bất thụ. Hạt chỉ phát triển được nhờ những hoa bất định (do đó, cây con trồng từ hạt hoàn toàn giống cây mẹ). Bầu noãn không có cuống, xếp thành hình tròn có 4-8 buồng. Nuốm không có vòi nhụy mang nhiều thùy, có 4-8 thùy tùy số buồng (Nguyễn Thị Thanh Mai, 2005). Quả và hạt: Quả là quả nang còn mang đài hoa ở cuống và nuốm nhụy ở chóp quả. Vỏ quả khi non có màu xanh đọt chuối. Khi chín, vỏ đỏ dần rồi chuyển sang tím , rồi tím sẫm. Quả hình cầu, đáy phẳng, đường kính 3,5-7 cm, nặng 75- 100 g. Vỏ quả láng, dày 0,8-1cm, màu tím hay tím nâu ở mặt ngoài và tím bên trong, chứa một lọai dịch đắng màu vàng và tiết ra khi quả non bị tổn thương. Dịch trong quả gồm mangostanstrin, phytosterine và tanin, được dùng trong dược liệu. Phần thịt bên trong quả chứa 5-7 hạt phát triển. Hạt dài khoảng 2 cm, vị chua ngọt (độ brix 17-19%). Quả măng cụt thường có 2-3 hạt phát triển, phần thịt trái chứa 25-30%. Trong phần thịt trái chứa 19,8% chất khô hòa tan, 4,3% đường khử, 17,5% đường tổng số, 0,5% protein. Ngoài ra còn có lipid, chất xơ, tro, acid ascorbic và một số khóang chất như canxi, lân, kali, sắt cùng vitamin B1, B2 và C. Phẩm chất trái có thể thay đổi do điều kiện khí hậu khác nhau (Nguyễn Thị Thanh Mai, 2005). 2.1.3 Vai trò và ứng dụng của cây măng cụt trong cuộc sống. Trái măng cụt thơm ngon cũng còn cống hiến nhiều vị thuốc. Từ lâu, ở Á châu, bên Ấn Độ, hệ thống khoa học đời sống ayurvedic đã kê nó vào nhiều thang thuốc cổ truyền, đặc biệt chống viêm, chữa tiêu chảy, ức chế dị ứng, làm giản phế quản trong điều trị hen suyển. Nó cũng được xem như là những thuốc chống dịch tả, bệnh lỵ, kháng vi khuẩn, kháng vi sinh vật, chống suy giảm miễn dịch. Người Thái dùng nó để chữa vết thương ngoài da. Người Mã Lai, Phi Luật Tân dùng nước sắc vỏ chữa lỵ, đau bụng, đi tiêu lỏng, bệnh vàng da. Theo Đông y, vỏ quả măng cụt có vị chua chát, tính bình, đi vào hai kinh phế và đại tràng, có công năng thu liễn, sáp trường, chi huyết, dùng trị tiêu chảy, ngộ độc thức ăn (Võ Quang Yến- 2005). Đứng về mặt ứng dụng, măng cụt được dùng trong thuốc tẩy, thuốc đánh răng, mỹ phẩm có tính chất kháng vi sinh vật. a-mangostin có công hiệu trên Helicobacter pylori ở nồng độ 1,56 µ g/ml. a- và g-mangostin ức chế glucosyl transferase phát xuất từ trùng sâu răng Streptococcus sobrinus và collagenase do vi khuẩn viêm lợi Porphyromonas gingivalis gây chảy mũi nên được dùng trong thuốc đánh răng, có khả năng ngừa chặn sâu răng và mảng răng. Mangosten được trộn với nhiều hóa chất khác như cetyl alcool, cetyl phosphat, dimethicon, eicosen, disodium, magnesium stearat, dipropylen glycol, triethanolamin,… để làm một loại thuốc bảo vệ chống ánh nắng mặt trời. Nhờ tính chất ức chế hoạt động phosphodiesterase, ở nồng độ 50 µ g/ml trong một dung dịch 5% dimethyl sulfoxyd, nó được dùng để làm thuốc kích thích tiêu mỡ (Võ Quang Yến- 2005). 2.1.4 Nguồn gốc và hiện trạng cây măng cụt ở Việt Nam Cây măng cụt nguồn gốc Mã Lai, Nam Dương, từ Malacca qua Moluku, ngày nay bắt gặp khắp Đông Nam Á, ở Ấn Độ, Myanmar cũng như ở Sri Lanka, Philippines, được các nhà truyền giáo đạo Gia tô di thực vào miền Nam nước ta (Đỗ Tất Lợi-1986), rồi trồng nhiều ở các tỉnh Tây Ninh, Gia Định, Thủ Dầu Một. Hiện nay, ở nước ta măng cụt được trồng nhiều ở Đồng bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) và Đông Nam Bộ (ĐNB). 2.2 Kỹ thuật phân tử và các nghiên cứu liên quan về cây măng cụt Biến dị di truyền trong những quần thể có thể được phát hiện thông qua dấu phân tử protein và DNA (Paterson et al. 1990). Dấu phân tử là cơ sở phân loại học và hình thái của cây. Những dấu phân tử thường rất được việc vì chúng có thể áp dụng một cách dễ dàng và không đòi hỏi khắc khe về kỹ thuật nhưng chúng biến đổi trong quá trình phát triển bởi yếu tố môi trường. (Bai et al. 2000). Dấu phân tử protein, còn được gọi là isoenzymes trên cơ sở đa hình các đoạn protein được phát hiện bằng điện di. Trong định danh và phân tích biến đổi số lượng gene, dấu phân tử isoenzyme bị giới hạn bởi số lượng hiện hữu các loci và sự thay đổi điện tích của protein (Murphy et al. 1996). Dấu phân tử DNA là phương pháp nhanh và đáng tin cậy để đánh giá tương quan di truyền bộ gene của các sinh vật. (Thormann et al. 1994). Kỹ thuật RAPD (Random amplified poly-morphic DNA) (Williams et al. 1990) đã được sử dụng cho phân tích đa dạng di truyền (Hasizume et al. 1993), vẽ bản đồ gene (Ohmori et al. 1995) và phân tích QTL (Gran-dillo and Tanskley 1996) ở rất nhiều giống cây trồng. Khả năng phân tích của kỹ thuật RAPD cao hơn vài lần so với dấu phân tử protein và nó đơn giản hơn nhiều, ít phụ thuộc vào kỹ thuật hơn RFLP và các kỹ thuật tương tự khác. Ramage et al. (2004) khảo sát tương quan di truyền giữa 37 dòng măng cụt và giữa 11 dòng của 8 loài khác thuộc chi Garcinia bằng dấu phân tử RAF (Randomly Amplified DNA Fingerprinting). Kết quả cho thấy đa dạng di truyền giữa măng cụt và các loại khác thuộc chi Garcinia, 26 (70%) dòng không phát hiện dấu phân tử khác biệt ở hơn 530 loci, 8 (22%) dòng cho khác biệt rất thấp (0.2-1%), và 3 dòng (8%) cho kết quả thật sự khác biệt. So sánh với các loài thuộc chi Garcinia khác thì 3 nhóm măng cụt khác biệt 63-70%. Dường như biến đổi di truyền cao thường không phổ biến đối với cây măng cụt, khi cây măng cụt được biết như là loài cây sinh sản vô tính, không phụ thuộc vào sự thụ tinh. (Koltunow et al. 1995). Những biến đổi có thể đến từ việc tích lũy những đột biến tự nhiên. Các đột biến bên trong đóng vai trò thiết yếu trong sự hình thành loài và khai hóa trong nhân giống cây trồng như chuối và cây mã đề (Buddenha-gen 1987). Carman (2001) cho rằng sinh sản vô tính là kết quả của lai xa từ 2 bố mẹ khác nhau về tính trạng kiểu hình liên quan đến sinh sản. Theo Yaa-cob và Tindal (1995) măng cụt (G. mangostana) là con lai của G. hombrioniana và G. Malaccensis , và cũng có thể cây măng cụt đã không có nguồn gốc từ lai đơn giữa cặp bố mẹ, vì Đông Nam Á là trung tâm đa dạng của Garcinia. Thomas (1977) báo cáo sự khác biệt di truyền của G. hombrioniana và G. Malaccensis. Khả năng về sự phát triển của cây măng cụt tổ tiên đã không được truyền lại bằng lai đơn dòng, có thể dẫn đến sự khác biệt giữa các quần thể măng cụt riêng biệt tạo ra. Sobir Roedhy Poerwanto (2007) đã sử dụng phân tích RAPD (Prabo-wo 2002; Mansyah 2002) trên 21 cây măng cụt để nghiên cứu biến dị di truyền quần thể măng cụt trên đảo Java. Tổng cộng 40 mồi RAPD đã được sử dụng và 39 mồi khuếch đại thành công các đoạn DNA từ genome cây măng cụt; trên cơ sở đó, 5 mồi (SB13, SB19, OPH12, OPH13 và OPH18) được chọn cho phân tích RAPD. Phân tích RAPD cho thấy 5 mồi khuếch đại 51 băng (trung bình 5,1 băng/ mồi) và 42 băng đa hình chiếm tỷ lể 82,4% (trung bình 8,4 băng/ mồi). 2.2.1 Kỹ thuật PCR Polymerase Chain Reaction (PCR) được Kary Mullis và cộng sự phát minh, công bố tháng 10 năm 1985, là công nghệ được sử dụng rộng rãi và có tác động lớn tạo bước nhảy vọt trong sinh học phân tử và kỹ thuật gen. Với công nghệ này, một trình tự DNA ban đầu có thể được nhân lên hàng tỷ bản sao chỉ trong vài giờ. Thực chất đây là phương pháp tạo dòng in vitro (không cần sự hiện diện của tế bào) nhờ vào vai trò của enzyme, khuếch đại một đoạn DNA cho trước. Một phản ứng PCR thông thường gồm DNA mẫu, enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (T4 DNA polymerase, Taq DNA polymerase, Vent DNA polymerase, Pfu DNA polymerase,…), cặp mồi (là các oligonucleotide), dNTPs (deoxynucleotide triphosphates), dung dịch đệm (buffer) và Mg++. Các thành phần của phản ứng được trộn đều và được đưa vào một chu trình nhiệt. Chu trình nhiệt đặt phản ứng vào một chuỗi nhiệt độ với những khoảng thời gian khác nhau. Chuỗi nhiệt độ với những khoảng thời gian khác nhau này được xem là một chu kỳ nhân gen (Zakaria Ahmed, 2006). Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: - Giai đoạn biến tính: nhiệt độ được lên 95o C hoặc cao hơn trong thời gian 15 giây đến 2 phút. Trong giai đoạn này 2 mạch phân tử DNA tách rời nhau. - Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ được hạ thấp xuống ở khoảng từ 40-60oC để các mồi bắt cặp với các mạch đơn DNA khuôn. Giai đoạn này khoảng 30-60 giây. - Giai đoạn tổng hợp: quá trình tổng hợp mạch DNA mới bắt đầu khi nhiệt độ phản ứng được tăng lên đến điều kiện thuận lợi nhất cho enzyme DNA polymerase khoảng 70-72oC. Enzyme DNA polymerase xúc tác hoạt động tổng hợp gắn thêm các nucleotide vào cuối đoạn mồi ở đầu 3’OH. Thời gian cho giai đoạn tổng hợp khoảng 1-2 phút. Một phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ liên tục. Sản phẩm tạo ra ở chu kỳ trước lại làm khuôn ở chu kỳ kế tiếp, số lượng bản sao DNA tạo thành tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ. 10 chu kỳ có thể tạo ra một ngàn bản sao từ 1 DNA mẫu; 20 chu kỳ từ một DNA mẫu cho ra hơn một triệu bản sao. Sau 20-40 chu kỳ, có thể đem các sản phẩm DNA đi phân tích kích thước, chất lượng, giải trình tự,… hoặc sử dụng vào các mục đích nghiên cứu xa hơn (Zakaria Ahmed, 2006). 2.2.2 Dấu phân tử RAPD (RAPD marker) Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) do William phát minh năm 1990, Welsh và cộng sự hoàn thiện năm 1991. Dấu phân tử RAPD là những đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên từ phản ứng PCR bằng mồi đơn có trình tự ngẫu nhiên. Nguyên tắc: Không giống phân tích PCR truyền thống, RAPD không đòi hỏi phải biết trước trình tự DNA của đối tượng nghiên cứu: những mồi với chiều dài 10 nucleotide có trình tự giống nhau sẽ khuếch đại hay không khuếch đại một đoạn DNA của bộ gen, phụ thuộc vào vị trí bắt cặp bổ sung của nó với DNA khuôn. Ví dụ, sẽ không có đoạn DNA nào được khuếch đại nếu mồi bắt cặp quá xa nhau hoặc đầu 3’OH của mồi kh