Tinh sạch protein bằng phương pháp tủa (tiếp theo)

Tinh sạch protein bằng phương pháp tủa (tt) 3. Tủa protein bằng phương pháp điểm đẳng điện Khi thay đổi pH của môi trường, mức độ tủa của protein cũng thay đổi. Ở pH thấp, protein tích điện dương vì nhóm amide bị proton hóa (thu nhận proton). Ở giá trị pH cao, protein tích điện âm vì các nhóm carbocyl trong phân tử protein bị mất đi proton (mất H+). Tại giá trị pI (Isoelectrics point - điểm đẳng điện), protein không tích điện. Điều này làm giảm tính tan của protein vì protein không còn khả năng tương tác với môi trường, khi đó, các phân tử protein sẽ tách ra khỏi môi trường. Hiện tượng này được giải thích bằng phương trình Cohn. Đồ thị biểu diễn độ hòa tan của 2 protein khác nhau thay đổi theo pH Hình 2. Tỷ lệ protein tủa theo pH ) Phương pháp này thường dùng cho các protein đậu nành (có điểm đặng điện khoảng 4.6) 4. Tủa protein bằng các non – ionic polymer Phương pháp này được thực hiện bằng cách cho thêm non – ionic vào trong dung dịch protein. Khi thêm vào, số lượng các phân tử nước có thể tương tác được với protein giảm xuống. Người ta thường sử dụng dextrans và polyethylen glycols. 0 µi = µi + RT (ln mi + fii mi + fij + mj) Trong đó 0 µi : điện thế hóa học chuẩn của phần tử i µi: điện thế hóa học của phần tử i R: hằng số khí T: nhiệt độ tuyệt đối mi, mj: nồng độ molar của phần tử i và j fii: hệ số tương tác của phần tử i fij: hệ số tương tác giữa phần tử i và j Khi protein tồn tại ở nồng độ cao, hay pH môi trường vượt ra ngoài điểm đẳng điện mới xảy ra quá trình tương tác giữa các cấu tử trong protein. Muốm thêm loại non – ionic polymer nào vào trong dung dịch protein tùy thuộc vào trọng lượng phân tử của protein đó. Cũng tương tự như tủa protein bằng phương pháp điểm đẳng điện. Tại 1 giá trị pH nào đó (sau khi thêm non – ionic polymer) thì khả năng hòa tan của protein cũng giảm xuống. Các ion non – ionic polymer thường sử dụng là các dung môi hữu cơ như Ethanol hay Acetone. Các dung môi khác ít sử dụng vì khó thao tác và có thể gây biến tính protein. Chú ý: - Nhiệt độ thấp làm tăng hiệu quả tủa và giảm sự biến tính protein. - Nồng độ ion: 0.05 – 0.2. - Đối với chất tan có trọng lượng phân tử càng cao thì lượng dung môi cần cho quá trình tủa càng ít. Theo Scopes (1982), khi bắt đầu tủa protein bằng Acetone, nên tuân theo công thức sau: [(v/v)%] = 1.8 - 0.12 ln [MW] Trong đó (v/v)% là thể tích dung môi cần cho quá trình tủa – tính theo % MW: trọng lượng phân tử của chất tan Nếu trong hỗn hợp có sự hện diện của 2 protein, tính tan của protein này sẽ giảm vì sự hiện diện của protein kia. Thuận lợi của phương pháp tủa bằng cách sử dụng non – ionic polymers là protein sản phẩm bền, và có thể sử dụng ở nhiệt độ phòng. 5. Tủa bằng ion kim loại Trong phương pháp tủa này, ion kim loại sẽ gắn với một phần của phân tử protein. Thuận lợi của phương pháp này là có thể tủa được protein trong một dung dịch rất loãng. Các ion kim loại có thể chia làm ba nhóm. Các ion như Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Zn2+ và Cd2+ sẽ gắn chặt vào các acid carboxylic và các hợp chất có chứa nitrogen. Các ion như Ca2+, Ba2+, Mg2+ và Pb2+ sẽ gắn với nhóm chức acid carboxylic. Các ion như Ag2+, Hg2+, và Pb2+ sẽ gắn chặt với các nhóm có chứa lưu huỳnh. MỘT SỐ PROTOCOL THAM KHẢO Tủa protein bằng acetone 1. Làm lạnh acetone xuống – 200C. 2. Chuyển mẫu protein vào trong các tube eppendorff thích hợp. 3. Thêm 4 lần thể tích acetone lạnh vào tube. 4. Vortex, ủ ở - 200C trong 60 phút. 5. Ly tâm ở 13.000 – 15.000 x g trong vòng 10 phút. 6. Cẩn thận loại bỏ dịch nổi. Tránh chạm tới phần cặn protein. (Nếu muốn loại bỏ hoàn toàn các chất tạp nhiễm, có thể lặp lại các bước từ 2 – 6) trước khi tiến hành bước 7) 7. Để cho acetone bay hơi tự do ở nhiệt độ phòng trong vòng khoảng 30 phút. Tủa bằng Acetone/TCA (Trichloroacetic acid) 1. Chuẩn bị dung dịch TCA 10% trong aceton. Bảo quản ở - 200C cho đến khi sử dụng. 2. Thêm 10 thể tích TCA 10% trong acetone vào mẫu. Vortex. Ủ ở - 200C ít nhất 3h (tốt nhất nên ủ qua đêm). 3. Ly tâm ở 15 000 x g trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi. 4. Thêm 1 thể tích acetone lạnh ( - 200C). Vortex. Để ở - 200C ít nhất 10 phút. 5. Ly tâm 15000 x g trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi. 6. Để cặn khô tự nhiên trong không khí. Tủa bằng TCA/DOC (Deoxycholate) 1. Chuẩn bị dung dịch DOC 2%. 2. Trộn mẫu với DOC 2% theo tỉ lệ 1/1000. Ủ trên đá 30 phút. 3. Thêm TCA 100% vào mẫu sao cho nồng độ cuối cùng của TCA là 15%. Vortex ngay (để tránh các khối tủa lớn hình thành có thể manh theo các phần tử tạp nhiễm). 4. Để yên ít nhất 1h. Tốt nhất là ủ qua đêm. 5. Ly tâm 15 000 x g trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi có chứa TCA và các chất tạp nhiễm 6. Thêm Ethanol lạnh hay Acetone lạnh vào cặn để rửa. 7. Vortex kỹ cho cặn tan hoàn toàn. Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. 8. Ly tâm 15 000 x g trong 10 phút. Cẩn thận loại bỏ dịch nổi. 9. Lặp lại bước rửa, ly tâm, loại dịch nổi. 10. Làm khô cặn. Tủa bằng Chloroform/Methanol 1. Thêm 4 thể tích Methanol vào mẫu. Vortex kỹ. 2. Thêm 1 thể tích Chloroform. Vortex. 3. Thêm 3 thể tích nước. Vortex. 4. Ly tâm 15 000 x g trong 2 phút. (Lúc này, protein có thể còn trên phần dịch nổi). Loại đi phần nước ở lớp trên. 5. Thêm 4 thể tích Methanol. Vortex. 6. Ly tâm 15 000 x g trong 2 phút. Cẩn thận loại bỏ hoàn toàn dịch nổi. Tránh chạm đến phần cặn. 7. Làm khô mẫu bằng buồng hút chân không hay bằng không khí.