Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất HCTC

LOGO LOGO www.trungtamtinhoc.edu.vn TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT ĐỂ SẢN XUẤT HCTC www.trungtamtinhoc.edu.vn NỘI DUNG GIỚI THIỆU 1 2 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY 3 KẾT LUẬN www.trungtamtinhoc.edu.vn GIỚI THIỆU - Nuôi cấy tế bào thực vật là một trong những phương pháp để sản xuất các hợp chất trao đổi đặc trưng ở thực vật hiện nay. - Thực vật sản xuất hơn 30.000 dạng hợp chất hóa học, bao gồm các dược chất, các sắc tố và các chất khác, chúng nhiều hơn 4 lần những chất này thu được ở vi sinh vật. - Nuôi cấy tế bào không bị giới hạn bởi yếu tố môi trường, sinh thái hoặc điều kiện khí hậu và vì thế, các tế bào có thể tăng nhanh về số lượng ở tốc độ sinh trưởng cao hơn khi trồng toàn bộ cây. www.trungtamtinhoc.edu.vn GIỚI THIỆU Ưu điểm của nuôi cấy tế bào thực vật: (1) Tổng hợp các hợp chất thứ cấp có giá trị diễn ra dưới sự điều khiển các yếu tố môi trường nuôi cấy, độc lập với khí hậu và điều kiện đất trồng. (2) Phủ định ảnh hưởng sinh học đến các sản phẩm là hợp chất thứ cấp trong tự nhiên (vi sinh vật và côn trùng) (3) Chọn lọc các giống cây trồng cho nhiều loại hợp chất thứ cấp khác nhau. (4) Tự động hóa điều khiển sự sinh trưởng của tế bào và điều hòa quá trình chuyển hóa, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên. www.trungtamtinhoc.edu.vn Sản phẩm Loài thực vật Sản lượng (% khối lượng khô) Tỷ lệ sản lượng Nuôi cấy Cây tự nhiên Anthocyanin Vitis sp. Euphorbia milli Perilla frutescens 16 4 24 10 0,3 1,5 1,6 13,3 16 Anthraquinone Morinda citrifolia 18 2,2 8 Berberine Coptis japonica Thalictrum minor 13 10 4 0,01 3,3 1000 Rosmarinic acid Coleus blumei 27,0 3,0 9 Shikonin Lithospermum erythrorhizon 14 1,5 9,3 Sản phẩm thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật so sánh với cây tự nhiên www.trungtamtinhoc.edu.vn Tế bào nuôi cấy tích lũy một lượng lớn hợp chất thứ cấp chỉ khi ở những điều kiện đặc biệt, điều đó có nghĩa là hợp chất thứ cấp tích lũy tối ưu trong mô thực vật nuôi cấy phụ thuộc vào: (1) Chọn lựa thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp (tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy). (2) Chọn lựa các dòng tế bào năng suất cao. (3) Bổ sung tiền chất nuôi cấy. (4) Các chất kích kháng bảo vệ thực vật. GIỚI THIỆU www.trungtamtinhoc.edu.vn TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY - Nghiên cứu về sự sản xuất các hợp chất thứ cấp được bắt đầu từ những năm 60. - Trong năm 1961, nó được mô tả lần đầu tiên làm thế nào các yếu tố điều hòa sinh trưởng thực vật có thể điều chỉnh được sự sản xuất 2 couramin (scopolatin và scopoline) trong nuôi cấy tế bào cây thuốc lá. - Chỉ từ sau 1970 thì việc sản xuất các hợp chất thứ cấp mới dành được các động lượng với sự tăng kiến thức về các nhân tố vật lý và hóa học. www.trungtamtinhoc.edu.vn Thông số của các nhân tố hóa học và vật lý như thành phần môi trường, chất kích thích sinh trưởng, pH, nhiệt độ nuôi cấy, sự thông khí, và ánh sáng ảnh hưởng đến hàm lượng các hợp chất thứ cấp. Một vài sản phẩm tích lũy trong tế bào ở mức cao hơn so với ở trong cây trồng tự nhiên khi được nuôi cấy ở điều kiện tối ưu. Các thông số vật lý và yếu tố dinh dưỡng trong một mẻ có thể gần như là yếu tố cơ bản cho việc tối ưu hóa hiệu suất nuôi cấy. TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY www.trungtamtinhoc.edu.vn Ví dụ: ginsenoside từ cây nhân sâm (P. ginseng) (Choi và cs 1994; Franklin và Dixon, 1994); rosmarinic acid từ cây tía tô cảnh (Coleus bluemei) (Ulbrich và cs 1985), shikonin từ cây thuốc thảo dược TQ (L. erythrorhizon) (Takahashi và Fujita, 1991); ubiquinone-10 từ cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) (Fontanel và Tabata, 1987), berberin từ cây Liễu sam (C. japonica) (Matsubara và cs 1989) tích lũy trong tế bào nuôi cấy với hàm lượng cao hơn so với cây tự nhiên. TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY www.trungtamtinhoc.edu.vn PHẦN 1: THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG www.trungtamtinhoc.edu.vn Thành phần môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào. Trong giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy, các chất dinh dưỡng giảm nhanh, sản phẩm trao đổi chất mới bắt đầu được tích tụ và tăng dần. Ba hợp phần của môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình nuôi cấy tế bào thực vật là carbon, nitrogen và phospho. THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG www.trungtamtinhoc.edu.vn Tuy nhiên, cũng không thể coi nhẹ các hợp phần khác của môi trường nuôi cấy, đặc biệt là các chất kích thích sinh trưởng. Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất mặc dù nồng độ của chúng có trong môi trường ở mức độ rất thấp THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG www.trungtamtinhoc.edu.vn THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG Chất kích thích sinh trưởng Nguồn Phosphate Nguồn Nitrogen Nguồn Carbon www.trungtamtinhoc.edu.vn NGUỒN CARBON Nguồn carbon trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật thường được cung cấp dưới dạng carbonhydrate, với những loại đường phổ biến như saccharose và glucose. Chất nền carbon vừa tham gia tổng hợp các thành phần của tế bào vừa cung cấp năng lượng đòi hỏi cho quá trình sinh trưởng và tồn tại của tế bào. Nó cũng cung cấp carbon cần thiết cho sự hình thành sản phẩm thông qua trao đổi trung gian. www.trungtamtinhoc.edu.vn Sự chuyển hóa của carbonhydrate bởi tế bào thực vật bao gồm con đường pentose phosphate (PPP), glycolysis và chu trình acid citric, mà cuối cùng sản xuất các tiền thân của các hợp chất thứ cấp. NGUỒN CARBON www.trungtamtinhoc.edu.vn www.trungtamtinhoc.edu.vn Vì vậy, việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn carbon hữu cơ là điều bắt buộc. Nguồn carbon thông dụng nhất là saccharose, nồng độ thích hợp 2-3%. Gautheret (1959) cho rằng đối với phần lớn các mô và tế bào nuôi cấy, đường saccharose và glucose là nguồn carbon tốt nhất, ở một số trường hợp đặc biệt cũng có thể dùng fructose, galactose và maltose để thay thế. NGUỒN CARBON www.trungtamtinhoc.edu.vn NGUỒN CARBON www.trungtamtinhoc.edu.vn Trong nuôi cấy dịch treo tế bào dừa cạn (C. roseus), khi thay đổi hàm lượng đường sucrose cho thấy có hiệu quả kích thích tích lũy alkaloid ở các nồng độ khác nhau. NGUỒN CARBON www.trungtamtinhoc.edu.vn Nguồn carbon được xem là yếu tố quan trọng trong sự trao đổi chất của tế bào thực vật, ảnh hưởng đến sự tích lũy alkaloid ở nuôi cấy tế bào huyền phù cây mộc hoa trắng (Holarrhena antidysenterica), anthocyanin từ tế bào huyền phù cây nho (V. vinifera), và shikonin khi nuôi cấy tế bào L. erythrorhizon (thuốc thảo dược Trung Quốc). Khi nuôi cấy tế bào huyền phù nhân sâm (Panax spp.) để sản xuất đồng thời ginseng saponin và ginseng polysaccharide, cả hai chất này đều có khả năng chống ung thư và có hoạt tính miễn dịch, sự thay đổi saccharose trong môi trường nuôi cấy cho thấy có ảnh hưởng lớn đến việc cải thiện hiệu suất của quá trình nuôi cấy. NGUỒN CARBON www.trungtamtinhoc.edu.vn Sự pha trộn giữa nitrate và amonium được dùng trong tất cả các môi trường chuẩn như là một nguồn nitrogen. NGUỒN NITROGEN www.trungtamtinhoc.edu.vn Nguồn nitrogen cũng rất quan trọng đối với sự hình thành các hợp chất trao đổi ở tế bào thực vật, điều này đã được nghiên cứu ở nuôi cấy tế bào huyền phù Mộc hoa trắng H. antidysenterica để sản xuất alkaloid, ở tế bào huyền phù cây nho (V. vinifera) để hình thành anthocyanin và trong sản xuất shikonin bằng nuôi cấy tế bào L. erythrorhizon. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen lên động học quá trình sinh trưởng tế bào, sự tiêu thụ chất dinh dưỡng, sự sản xuất ginseng saponin và polysaccharide khi nuôi cấy tế bào huyền phù nhân sâm (P. ginseng) đã được nghiên cứu. NGUỒN NITROGEN www.trungtamtinhoc.edu.vn Tỷ lệ NO3 -/NH4 + và lượng nitrogen tổng số đưa vào ban đầu trong môi trường được thay đổi. Sự sinh trưởng của tế bào tốt nhất ở nồng độ là 60 mM và tỷ lệ NO3 -/NH4 + cao hơn. Chỉ sử dụng nitrate hoặc kết hợp nitrate và ammonium (tỷ lệ 2:1) cung cấp như nguồn nitrogen, nồng độ nitrogen 10 mM được xem là thích hợp cho sự tích lũy sinh khối tế bào. Nitrate là nguồn nitrogen thuận lợi cho sự sinh trưởng của tế bào nhân sâm, tốc độ sinh trưởng tế bào là 0,11/ngày và mật độ tế bào khô là 13 g/L đạt được ở 10 mM nitrate. NGUỒN NITROGEN www.trungtamtinhoc.edu.vn Zenk và cs cho thấy rằng sản xuất anthraquinone bởi tế bào cây Nhàu Morindra citrifolia giảm khi mức KNO3 biến đổi trên hoặc dưới 2,0 đến 4,5 g/l. Sinh tổng hợp indole alkaloid ở cây Cửu Lý Hương châu Phi Peganum harmala giảm khi ammoniac hoặc glutamine được thay thế cho nitrate. Trái ngược với kết quả trên, hàm lượng caffeine của tế bào cây Chè Camellia sinensis tăng khoảng 4 lần khi phản ứng với ammoniac. Việc thêm vào KNO3 và NH4NO3 ức chế anthocyanin tích lũy 90% và sự tổng hợp alkaloid 80%. NGUỒN NITROGEN www.trungtamtinhoc.edu.vn Việc thêm vào các nguồn nitrogen hữu cơ khác nhau, như là casein hydrolysate, peptone và dịch chiết nấm men (sự bổ sung các nitrogen hữu cơ phức tạp) riêng lẽ hoặc phối hợp với amino acid cũng cho các kết quả trái ngược trong sự nuôi cấy tế bào khác nhau. Khi nuôi cấy L.erythrorhizon cho rằng thấy sẽ giảm sự tổng hợp của 1,4– naphthoquinone khi casein hydrolysate được thêm vào môi trường. Nồng độ cao của dịch chiết nấm men dẫn đến tăng sự tổng hợp của diosgenin với làm giảm sự sinh trưởng tế bào ở củ Còi Dioscorea deltoidea. Do đó, sự biến đổi dinh dưỡng nitrogen tác động trực tiếp hoặc gián tiếp tới hàm lượng của hợp chất thứ cấp. NGUỒN NITROGEN www.trungtamtinhoc.edu.vn Sự liên quan của phosphate vô cơ trong điều chỉnh sự chuyển hóa của hợp chất là được thiết lập tốt trong quá trình quang hợp, hô hấp (glycosis) và là yếu tố cần thiết cho sự tổng hợp acid maleic và phospholipid. Nhiều sản phẩm thứ cấp được tổng hợp qua phosphoryl hóa trung gian, chẳng hạn như terpenes, terpenoid, và phenylpropanoid, mà rồi sau đó giải phóng phosphate. NGUỒN PHOSPHO www.trungtamtinhoc.edu.vn Tăng phosphate có liên quan với tăng sự sản xuất alkaloid ở Dừa cạn Catharanthus roseus, tăng anthraquinone ở cây Nhàu Morinda citrifolia và tăng diosgenin ở củ Còi Dioscorea deltoidea. Giảm phosphate ở một mặt khác tương ứng với tăng alkaloids, anhocyanin và phenolics ở C. roseus, tăng alkaloid ở cây Cửu lý hương Peganum harmala và tăng solasodine ở Cà lá xẻ Solanum lanciatum. Tăng hoặc giảm phosphate không ảnh hưởng đến sự tích lũy alkaloid phrotoberberine ở Hoàng liên gai Berberis sp. NGUỒN PHOSPHO www.trungtamtinhoc.edu.vn Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên tế bào thực vật được nuôi cấy là rõ ràng trong sự sinh trưởng, trao đổi chất và sự phân hóa. Nồng độ và tỉ lệ của chất điều hòa sinh trưởng chi phối trực tiếp đến sự phân hóa. Có 2 loại chất điều hòa sinh trưởng được đòi hỏi bởi tế bào thực vật, đó là auxin và cytokinin (IAA, IBA, NAA, 2,4 D, 2,4,5-T, BA, kinetin, 2iP, zeatin, thidiazuron). Thỉnh thoảng gibberellins được đòi hỏi cho tế bào nào đó song song với cytokinin hoặc cùng với hoặc không cùng với auxin. CHẤT ĐIỀU HÕA SINH TRƯỞNG www.trungtamtinhoc.edu.vn www.trungtamtinhoc.edu.vn Giảm nồng độ của 2,4-D trong môi trường hoặc thay thế nó bằng một auxin khác sẽ làm tăng sự tích lũy của hợp chất thứ cấp, ví dụ như alkaloid trong nuôi cấy sợi thuốc lá, Ephedra và sắc tố (shitokin trong nuôi cấy Mộc hoa trắng Lithospermum erythrorhizon. Trong callus của Nicotin tabacum, Bright Yellow được nuôi cấy khoảng 5 năm trong sự có mặt của 2,4-D, không có alkaloid được phát hiện, trong khi nicotine, anatabine và anabasine dễ dàng tìm thấy trong callus trên môi trường với IAA. Với sự dịch chuyển của callus từ môi trường này môi trường có 2,4 D sang IAA và ngược lại đã được chứng minh là sự tổng hợp nicotin trong nuôi cấy mô là được hoạt hóa bởi sự bổ sung IAA và bị ức chế bởi 2,4 D. CHẤT ĐIỀU HÕA SINH TRƯỞNG www.trungtamtinhoc.edu.vn Người ta quan sát thấy callus đã phát triển trên môi trường 2,4-D cho hàm lượng glutamic và aspartic thấp, các amino acid liên quan đến sự sinh tổng hợp alkaloid và có lẽ đây là lí do cho mức alkaloid thấp trong mô nuôi cấy. Nồng độ cao của auxin ức chế và nồng độ thấp thì cho phép sản xuất các hợp chất trong nuôi cấy tế bào cây Lạc Arachis hypogaea, Dương địa hoàng Digitalis lanata. Sự sinh trưởng và sự sản xuất carotenoid trong nuôi cấy tế bào carrot được tối ưu tại 10mg/l 2,4-D. Trong phạm vi nào đó, tăng nồng độ của auxin trong môi trường có ảnh hưởng bất lợi với hàm lượng alkaloid của mô. CHẤT ĐIỀU HÕA SINH TRƯỞNG www.trungtamtinhoc.edu.vn Ảnh hưởng của cytokinin là tương tự với auxin, ví dụ như, biến đổi các phản ứng với các nồng độ được thay đổi với các nguyên lý hoạt động khác nhau. 1). Hoạt động của việc sản xuất các hợp chất: scopolin và scopoletin trong mô của thuốc lá và carotenes trong tế bào của cây Thầu dầu Ricinus, ajmalicine trong dừa cạn C. roseus 2). Ức chế các hoạt chất: anthraquinone trong mô của thuốc lá.. Tăng mức cytokinin trong môi trường cũng ảnh hưởng đến sự phân hóa tế bào và sự sản xuất các hoạt chất có liên quan với sự phân hóa được biểu hiện tăng cường trong nuôi cấy. CHẤT ĐIỀU HÕA SINH TRƯỞNG www.trungtamtinhoc.edu.vn Ảnh hưởng tổng hợp của auxin và cytokinin phối hợp được cho rằng ủng hộ sự sinh trưởng của tế bào được nuôi cấy nhưng ảnh hưởng của chúng đến hợp chất thứ cấp là độc lập. Ở dừa cạn C. Roseus, BA (benzyladenin) làm tăng hiệu suất alkaloid cao trong sự vắng mặt của auxin nhưng không làm tăng sinh trưởng. Trong trường hợp của cây Thảo quyết minh Cassia tora năng suất tối ưu của anthraquinones đạt được với môi trường chưa 10-5M kinetin và 10-7M 2,4 –D. Tuy nhiên, năng suất tổng số sắc tố cho mỗi bình nuôi cấy được cao nhất khi phối hợp 10-8M 2,4 –D và 10-5M kinetine. CHẤT ĐIỀU HÕA SINH TRƯỞNG www.trungtamtinhoc.edu.vn - Nồng độ cao của auxin trong môi trường riêng có 2,4 D ức chế chuyển hóa thứ cấp (cũng như sự phân hóa tế bào) - Nồng độ cao của phosphate trong môi trường làm sinh trưởng tế bào và nồng độ thấp làm tăng chuyển hóa thứ cấp. - Mức cacborhydrate thấp (sucrose) thuận lợi cho sự tăng sinh của tế bào trong khi nồng độ cao kìm hãm tế bào sinh trưởng và tăng sự hình thành sản phẩm thứ cấp. KẾT LUẬN www.trungtamtinhoc.edu.vn - Trong một vài trường hợp nào đó, hàm lượng nitrogen cao trong môi trường làm tăng sinh tế bào trong khi nồng độ thấp tăng sự hình thành sản phẩm thứ cấp. - Tăng sự tổng hợp của sản phẩm thứ cấp xảy ra trong suốt pha ổn định của nuôi cấy khi các hợp chất sơ cấp và sự tăng sinh tế bào tạm dừng lại. KẾT LUẬN www.trungtamtinhoc.edu.vn PHẦN 2: CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY www.trungtamtinhoc.edu.vn 2. CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY Không khí pH Nhiệt độ Ánh sáng Khối lượng mẫu ban đầu www.trungtamtinhoc.edu.vn - Ánh sáng là sự hình thành từ năng lượng bức xạ, ví dụ bức xạ điện từ có chiều dài bước sóng đặc biệt. Ánh sáng khả kiến mà chúng ta có thể nhìn thấy, là nằm ở vùng bước sóng có chiều dài hẹp của quang phổ từ 380 đến 760 µm. - Ánh sáng có 2 mặt đặc trưng, trưng bày các thuộc tính bước sóng (sự khúc xạ, nhiễu xạ, sự giao thoa và hiện tượng phân cực) và tính hạt (ánh sáng được phát ra trong vì số năng lượng và photon riêng lẻ). ÁNH SÁNG www.trungtamtinhoc.edu.vn Các hóa chất tự nhiên có sẵn trong thực vật bị ảnh hưởng bởi cả cường độ và chất lượng ánh sáng. - Ánh sáng xanh cảm ứng sự tạo thành anthocyanin tối đa trong tế bào huyền phù Haplopappus gracilis. - Ánh sáng trắng cảm ứng sự tổng hợp anthocyanin ở dừa cạn Catharanthus roseus và Populus sp. - Ngược lại, ánh sáng xanh hay trắng ức chế hoàn toàn quá trình sinh tổng hợp naphthoquinone trong nuôi cấy callus loài mộc hoa trắng Lithospermum erythrorhizon. ÁNH SÁNG www.trungtamtinhoc.edu.vn Tia cực tím (UV, 280-320 nm) được cho rằng là kích thích sự tổng hợp flavone glycoside ở nuôi cấy tế bào huyền phù Petroselinum hortense. Ở cây cửu lý hương R.graveolens, 2-nonanone, 2- nonanyl acetat và 2-nonanol được sản xuất hàm lượng lớn khi nuôi cấy trong bóng tối, trong khi 2-undecanone, 2-undecanyl acetate và 2-undecanol là được sản xuất với hàm lượng cao khi nuôi cấy thực hiện dưới ánh sáng. ÁNH SÁNG www.trungtamtinhoc.edu.vn www.trungtamtinhoc.edu.vn Cường độ ánh sáng mạnh có tác dụng kìm hãm sự tổng hợp nicotine trong tế bào thuốc lá (Nicotiana tabacum) trong khi nuôi cấy chúng trong tối liên tục lại tăng cường sự sinh trưởng, tổng hợp và tích lũy nicotine, có thể nguyên nhân là do sự hấp thụ đường nhanh hơn, nhưng cũng có thể là do kết quả của sự ức chế. ÁNH SÁNG www.trungtamtinhoc.edu.vn Theo nghiên cứu của Nozue và cs (1985), ánh sáng lại kích thích sự tích lũy anthocyanin ở tế bào huyền phù cây khoai lang (Ipomoea batatas). Sự tổng hợp anthocyanin bắt đầu xảy ra từ 24-48 giờ sau khi tế bào tiếp xúc với ánh sáng. Tần số các tế bào có chứa anthocyanin quan sát dưới kính hiển vi tăng lên nhanh chóng khoảng 80% tổng số tế bào nuôi cấy sau 5 ngày chiếu sáng. Nói cách khác, không có sự tổng hợp anthocyanin ở các tế bào nuôi cấy trong tối ÁNH SÁNG www.trungtamtinhoc.edu.vn Nuôi cấy mô tế bào thường được thực hiện ở nhiệt độ 25-2800C . Nhiệt độ cao được cho rằng chỉ kích thích sự hình thành sản phẩm trong trường hợp anthocyanin ở cây dương Populus. Nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến nhiều loại cơ chất được tổng hợp, chẳng hạn như độ bão hòa của các acid béo. Sự bảo quản trong tủ ấm của tế bào huyền phù đậu tương ở nhiệt độ thấp (1500C) dẫn đến sự tăng lên của acid linoleic và linolenic trong lipid của tế bào, đặc biệt là phosphatidyl choline và phosphatidyl ethanolamine. NHIỆT ĐỘ www.trungtamtinhoc.edu.vn Nghiên cứu bởi Courtois và Guern (1980) trên nuôi cấy tế bào C. roseus rộng rãi đã chứng minh ảnh hưởng của nhiệt độ. Họ cho rằng sự sản xuất indole alkaloid tăng gấp 2 lần khi tế bào được ủ tại nhiệt độ 1600C thay vì 2700C. Tuy nhiên, sự sinh trưởng thấp hơn 3 lần tại nhiệt độ thấp (dưới 1600C) . Tế bào thực vật chịu những biến đổi sinh học và chuyển hóa chất phản ứng lại sự thay đổi của nhiệt độ nuôi cấy. NHIỆT ĐỘ www.trungtamtinhoc.edu.vn Giá trị pH điều chỉnh mức độ phân ly các thành phần của môi trường, nó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp của tế bào không giống nhau. Có những giá trị pH mà ở đó tế bào vẫn phát triển bình thường nhưng các chất thứ cấp ít hoặc hoàn toàn không tạo thành. pH môi trường thấp sẽ hoạt hóa các enzyme hydrolase dẫn tới kìm hãm sinh trưởng đồng thời kích thích sự hóa già của tế bào trong mô nuôi cấy. Giá trị pH ban đầu của môi trường nuôi cấy luôn trong khoảng 5,5-5,9. Giá trị pH sẽ thay đổi trong quá trình khử trùng môi trường và trong quá trình nuôi cấy. pH giảm nhanh chóng xuống còn 4,0-4,5 trong vòng 24-48 giờ nuôi cấy. pH www.trungtamtinhoc.edu.vn Nuôi cấy mô cà rốt Daucus carota sản xuất anthocyanin khi sinh trưởng ở pH 5,5 ít hơn khi sinh trưởng ở pH 4,5. pH của môi trường cũng đóng vai trò quan trọng trong sự chuyển đổi sinh học của β-methyl digitoxin bằng một vài chuỗi của Dương địa hoàng Digitalis lanata. Phản ứng này được thực hiện bởi enzyme và tất cả các enzyme có một pH tối ưu. Rao và cs (2008) đã nghiên cứu ảnh hưởng của pH lên sự tích lũy sinh khối và berberine của tế bào T. cordifolia. Kết quả cho thấy rằng khi tăng pH từ 4 đến 6, cả sinh khối và hàm lượng berberine đều tăng trong lên, kết quả này cũng tương tự như khi nuôi cấy tế bào huyền phù bươm bướm đỏ đuôi công Plumbago rosea. pH www.trungtamtinhoc.edu.vn Sự trao đổi của nuôi cấy trong bình lắc chất lỏng hoặc trong bioreactor là nhân tố quan trong ảnh hưởng đến sự sản xuất hợp chất thứ cấp. Điều kiện kị khí tác động trực tiếp tới hợp chất sơ cấp và sự sản xuất hợp chất thứ cấp một