Tối ứu hóa một số điều kiện phản ứng trong phương pháp VNTR – MIRU định kiểu gene các chủng Mycobacterium tuberculosis phân lập tại Việt Nam

~ 35 ~ …………………………………………………………………………………………………. 3. Kết quả 3.1. Tối ứu hóa một số điều kiện phản ứng trong phương pháp VNTR – MIRU định kiểu gene các chủng Mycobacterium tuberculosis phân lập tại Việt Nam 9 Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR Hình 3.1: Kết quả PCR khác biệt gradient nhiệt độ bắt cặp mồi Iw-07 & Iw-08 Sản phẩm chính tại các nhiệt độ lai (1) 65, (2) 63, (3) 59, (4) 55, (5) 53, (6) 50 độ C (T2) thang 1kbp; (T1) thang 100bp PCR cho kết quả âm tính tại các nhiệt độ lai 65, 63 độ C cho thấy những nhiệt độ này quá ngặt nghèo để phản ứng có thể xảy ra. Tại nhiệt độ 53, 50 độ C vạch sản phẩm chính khoảng 500bp lẫn với các vạch sản phẩm phụ gồm có primer dimmer và các sản phẩm không chuyên biệt. Tại nhiệt độ 55 cho sản phẩm nhiều, các vệt sản phẩm phụ ít. Nồng độ MgCl2 là nhân tố chủ yếu ảnh hưởng đến hiệu quả hoạt động của Taq DNA polymerase. Các thành phần phản ứng, bao gồm bản mẫu DNA, các chất phức có mặt trong mẫu (như là EDTA hay citrate), dNTPs và proteins có thể ảnh hưởng đến lượng Mg tự do trong hỗn hợp phản ứng. Thiếu lượng Mg cần thiết Taq DNA polymerase sẽ bị bất hoạt. Ngược lại, quá nhiều Mg tự do sẽ giảm độ hoạt động chính xác của enzyme làm tăng lượng sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu. Vì những lí do đó rất cần thiết tối ưu hóa nồng độ MgCl2 cho từng PCR. Đối với cặp mồi Iw-01 & Iw-02 bước khảo sát gradient nhiệt độ cho thấy sản phẩm phụ nhiều nên chúng tôi tiến hành chạy gradient nồng độ MgCl2 , sau đó chọn nồng độ 3,5mM để như là nồng độ cho ra sản phẩm PCR chấp nhận được . T2 T1 1 2 3 4 5 6 ~ 36 ~ …………………………………………………………………………………………………. Hình 3.2: Kết quả chạy điện di gradient nồng độ MgCl2 Iw-01, Iw-02 Nồng độ MgCl2: (1)1,5mM; (2) 2,0mM; (3) 2,5mM; (4) 3,0mM; (5) 3,5mM; (6) 4,0mM; (7) 4,5mM; (8) 5,0mM; (T1) thang 1kbp; (T2) thang 500bp 9 Điều chỉnh điều kiện chạy mẫu trong ống điện di mao quản máy DNA sequencer so với thông số mặc định chương trình chạy điện di mao quản (4) Bảng 3.1: Các thông số nhiệt độ, cường độ dòng điện, điện thế dùng cho máy DNA sequencer khi phân giải mẫu Nhiệt độ chạy mẫu 60 độ C Thể tích nạp mẫu vào ống mao quản 184 bước Cường độ dòng điện tối đa 100 micro Amps Cường độ dòng điện hoạt động 100 micro Amps Dung sai điện thế 0,6 kVolts Điện thế ban đầu 15 kVolts Thời gian chạy đầu 180 giây Điện thế nạp mẫu 1 kVolts Thời gian nạp mẫu 22 giây Điện thế chạy mẫu 15 kVolts Số lần đổi điện thế 10 Thời gian giữa 2 lần đổi điện thế 60 giây Thời gian nhận tín hiệu 1 giây Thời gian chạy mẫu * 4000 giây * thông số thay đổi so với mặc định của máy. Phải thay đổi thông số này do sản phẩm PCR trong thí nghiệm này (có thể lên đến 1kb), có kích thước lớn hơn so với khả năng phân tích mẫu thông thường của máy là khoảng 500bp. 1 2 3 4 5 6 7 8 T1 T2 ~ 37 ~ …………………………………………………………………………………………………. X Hình 3.4: Biểu diễn mẫu với 3 sản phẩm PCR được nhuộm 3 loại dye: xanh dương (FAM), xanh lá cây (HEX), đen (NED). X: hỗn hợp primer dimer Hình 3.3: Biểu diễn thang đo ROX với các nấc thang dao động từ 50 bp – 1000 bp ~ 38 ~ …………………………………………………………………………………………………. 3.2. Đánh giá mức độ áp dụng của kỹ thuật định kiểu gene dựa trên VNTR- MIRU Chín mươi lăm mẫu trong nghiên cứu được rút ra trên tập hợp 450 mẫu của bệnh nhân lao màng não, lao phổi từ khắp các địa bàn Tp Hồ Chí Minh trong khoảng thời gian 2000 – 2004, trong đó bao gồm 35 M.tb kiểu gene Beijing, 18 M.tb kiểu gene Việt Nam được rút ra ngẫu nhiên, tỉ lệ các thành phần tương xứng với thành phần kiểu gene tập hợp 450 mẫu, trong đó có khoảng 37% là M.tb kiểu gene Beijing, 20% M.tb kiểu gene Việt Nam (nhánh nhỏ của họ Indo-Oceanic). PCR được thực hiện trên 31 loci, chia thành 16 nhóm trên 95 mẫu, và lặp lại trên 10 mẫu để kiểm chứng độ lặp lại cao của thí nghiệm. Tuy đây là một khối lượng công việc lớn, nhưng nhờ công đoạn cuối có thể tiến hành bằng máy giải trình tự tự động DNA analyzer tiến hành đọc 1 lần 16 mẫu nhờ 16 đầu mao quản đã giúp công việc của nguời thao tác được giảm lược nhiều. Hình 3.5 biểu diễn sự phân bố số chủng thuộc các allele trên từng locus, sự phân nhóm biểu hiện 3 nhóm chính: [A]: nhóm có nhiều loại allele (số loại allele lớn hơn 5) và có 1 allele trội (số chủng thuộc allele đó lớn hơn 35 trong số 95 chủng). Kết quả PCR cho thấy khả năng sử dụng tính đa hình tại những vị trí này để sàng lọc [B]: nhóm nhiều loại allele phân bố đồng đều. Kết quả PCR tại những vị trí này cho thấy tính đa hình cao [C]: nhóm ít các allele (số loại allele nhỏ hơn 5). Kết quả PCR tại những vị trí này không đa dạng, phản ảnh tính đa hình thấp trên quần thể mẫu này ~ 39 ~ …………………………………………………………………………………………………. Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn phân bố số chủng thuộc các allele trên từng locus Locus Số lần lặp lại của các trình tự lặp A B B A A ~ 40 ~ …………………………………………………………………………………………………. A B C A C C ~ 41 ~ …………………………………………………………………………………………………. C C C C A B ~ 42 ~ …………………………………………………………………………………………………. B C C C C C ~ 43 ~ …………………………………………………………………………………………………. C A C C C A A ~ 44 ~ …………………………………………………………………………………………………. 3.2.1. Khả năng định kiểu gene (Typability): Khả năng định kiểu gene của kỹ thuật là phần trăm các chủng vi khuẩn dương tính khi thử nghiệm trên từng dấu hiệu sinh học. Bảng 3.2: thống kê khả năng định kiểu gene của kỹ thuật trên một số dấu hiệu sinh học có xuất hiện kết quả âm tính. Locus 2059 3007 2165 2461 577 1955 2163a 3820 4120 Số mẫu cho kết quả âm (n= 95) 1 1 11 87 2 1 2 1 1 Typability(%) 98,92 98,92 88,17 6,45 97,85 98,92 97,85 98,92 98,92 Kết quả cho thấy dấu hiệu sinh học ở loci 2461 với khả năng định kiểu gene quá thấp trên quần thể mẫu này không thể sử dụng cho các nghiên cứu xa hơn tại đây. Bàng 3.3: Một số lỗi kĩ thuật thường gặp ở phương pháp VNTR – MIRU Hiện tượng Giải thích Cách khắc phục Hiện tuợng nhiễu nhiều màu trong khoảng đọc 0-90 bp đầu tiên Sự tạo thành primer dimer, các primer gắn màu bắt cặp với nhau Khi đọc kết quả bỏ qua phần 0 – 90 bp đầu tiên Tín hiệu nhiễu và stutter peaks Sự khuếch đại không hoàn toàn các trình tự lặp có thẻ phát sinh nhiều sản phẩm phụ với kích thuớc nhỏ hơn sản phẩm chính bằng vài trình tự lặp lại Sản phẩm khuếch đại thật sự cần tìm chính là sản phẩm lớn nhất. Cần loại bỏ tất cả những peak có chiều cao nhỏ hơn 32% peak trong loại sản phẩm chính phụ khuếch đại được Peak đôi Xuất hiện khi lượng sản phẩm khuếch đại quá nhiều Sản phẩm khuếch đại thực là peak nhỏ, đứng sau peak lớn truớc đó khoảng 0 – 10bp 3.2.2. Độ lặp lại của kỹ thuật (Reproducibility) Độ lặp lại của kĩ thuật định kiểu gene dựa trên phần trăm chủng vi khuẩn cho kết quả giống nhau bất kể số lần lặp lại thí nghiệm. 31 dấu ấn sinh học được khuếch đại lặp lại trên 10 mẫu trong tổng số 95 mẫu cho thấy không có sự khác biệt trong kết quả, chứng minh độ lặp lại cao trong khoảng thời gian thí nghiệm của kỹ thuật định kiểu gene trên các dấu ấn sinh học này. ~ 45 ~ …………………………………………………………………………………………………. 3.2.3. Allelic diversity: Chỉ số phân biệt để tính độ đa dạng kiểu gene dựa trên từng vị trí VNTR Bảng 3.4: thống kê giá trị đa dạng kiểu gene trên từng vị trí loci Locus Alias Số lượng allele Khoảng dao động số lượng các đoạn lặp PIC cho tất cả các mẫu (n=95) PIC cho kiểu gene Beijing (n=35) PIC cho kiểu gene Việt Nam (n=18) 580 MIRU 4, ETR D 5 2 - 6 0,632 0,000 0,636 2996 MIRU 26 8 1 - 8 0,722 0,700 <0,1 802 MIRU 40 5 1 - 5 0,518 0,393 0,296 960 MIRU 10 5 2 - 7 0,649 0,302 <0,1 1644 MIRU 16 4 1 - 4 0,546 0,405 <0,1 3192 MIRU 31 7 1 - 9 0,539 0,348 <0,1 154 MIRU 2 5 3 - 8 0,177 0,202 <0,1 2531 MIRU 23 5 2 - 6 0,121 0,109 <0,1 4348 MIRU 39 4 1 - 4 0,502 0,434 <0,1 2059 MIRU 20 6 0 - 6 0,160 0,211 <0,1 2687 MIRU 24 2 1 - 2 0,480 0,056 <0,1 3007 MIRU 27, QUB-5 5 0 - 4 0,538 0,668 <0,1 2165 ETR A 8 0 - 7 0,862 0,668 0,654 2461 ETR B 5 0 - 7 <0,1 577 ETR C 12 0 - 16 0,839 0,780 0,451 424 Mtub04 6 1 - 7 0,630 0,426 <0,1 2401 Mtub30 3 2 - 4 0,504 0,460 <0,1 3690 Mtub39 4 1 - 4 0,630 0,454 <0,1 2347 Mtub29 2 3 - 4 0,476 0,108 <0,1 3171 Mtub34 3 2 - 4 0,519 0,382 <0,1 1451 QUB-1451 5 4 - 9 0,401 0,304 <0,1 1895 QUB- 5 4 - 9 0,401 0,304 <0,1 PICi là khả năng mang độ đa dạng kiểu hình (Polymorphic Information Content) của dấu ấn sinh học i Pij là tần suất của dạng j xác định nhờ dấu ấn sinh học i trên tổng số n dạng nhận danh được ~ 46 ~ …………………………………………………………………………………………………. 1895 1955 Mtub21 9 3 - 12 0,693 0,653 0.512 4156 QUB-4156 4 4 - 7 0,621 0,459 <0,1 2163a QUB-11A 15 4 - 19 0,862 0,705 <0,1 2163b QUB-11B 10 3 - 14 0,742 0,694 <0,1 3336 QUB-3336 9 6 - 16 0,516 0,211 <0,1 3232 QUB-3232 13 1 - 16 0,645 0,676 0,704 3820 VNTR 3820 15 0 - 20 0,852 0,762 0,444 4052 QUB-26 9 0 - 9 0,741 0,518 0,500 4120 VNTR 4120 8 7 - 14 0,700 0,756 <0,1 * Những loci được tô vàng cho thấy HGI cao, từ 0,6 trở lên, đạt yêu cầu cho độ phân giải tốt; những loci được tô xám cho thấy HGI cao nhất. Những loci với độ đa dạng cao nhưng vẫn có mức độ ổn định nhất định, đủ để làm marker phân biệt giữa các chủng, đặc biệt là bên trong M.tb kiểu gene Beijing và Indo-Oceanic (Việt Nam): Các loci 2996, 2165, 577, 2163a, 2163b, 3820, 4120 cho thấy khả năng biểu thị độ đa dạng cao (lớn hơn hoặc bằng 0,7), có thể được áp dụng để phân biệt các chủng có mối liên hệ di truyền gần. VNTR 3232 có thể dùng để phân biệt các M.tb kiểu gene Việt Nam trong họ Indo- Oceanic. 3.2.4. Độ phân giải của kỹ thuật (Discriminatory power) Độ phân giải của một kỹ thuật định kiểu gene dựa trên khả năng phân biệt các chủng không có mối liên hệ di truyền với nhau, xác định bằng các chủng được nhận diện bằng kỹ thuật đang đánh giá và tần số tương đối của các chủng này. Chỉ số độ đa dạng dựa trên khả năng 2 chủng không liên hệ về mặt di truyền được xếp vào các nhóm di truyền khác nhau. Khả năng này được tính dựa trên chỉ số độ dạng Simpson (còn gọi là Hunter – Gaston [Hunter-Gaston discriminatory index (HGI) calculation, Hunter & Gaston, 1988]) với công thức: ~ 47 ~ …………………………………………………………………………………………………. Bảng 3.5: Sự phân bố kiểu genes vào các nhóm tương đồng (cluster) dựa trên các cách phối hợp loci Các cách phối hợp các loci cho việc định kiểu gene 18 loci 31 loci 24 loci 15 loci + 3 Hypervariable loci 15 loci 12 loci Old 12 loci & ETR Old 12 loci Spoligotype 1 (unique) 93 93 93 91 85 80 86 64 26 2 0 0 0 1 4 5 2 10 3 3 0 0 0 0 0 1 1 1 1 5 0 0 0 0 0 0 0 0 2 6 0 0 0 0 0 0 0 1 0 16 0 0 0 0 0 0 0 0 1 A lle le (đ ặc tr ưn g bở i s ố lầ n lặ p lạ i c ác tr ìn h tự lặ p) 32 0 0 0 0 0 0 0 0 1 HGI 1 1 1 0.9997 0.9990 0.9981 0.9988 0.9934 0.8501 Độ phân giải của chủng trong quần thể này đạt mức tối đa khi sử dụng các tổ hợp 31 loci, 24 loci và ít nhất là 18 loci. Với tổ hợp 18 loci chứng tỏ là tổ hợp số loci nhỏ nhất có khả năng phân biệt các chủng trong họ Beijing, trong đó những M.tb kiểu gene Beijing giống nhau nhất đạt độ tương đồng (similarity) 98,2%. N: tổng số chủng trong tập hợp mẫu s: tổng số các kiểu gene trong tập hợp mẫu nj: số chủng thuộc vào kiểu gene thứ j ~ 48 ~ …………………………………………………………………………………………………. Bảng 3.6: Các cách phối hợp các loci để phân giải chủng (x):loci được sử dụng, (-): loci không được sử dụng trong các cách phối hợp Locus Alias Old 12 loci Old 12 loci & ETR 12 loci 15 loci 15 loci + 3 HV 24 loci 31 loci 18 loci 580 MIRU 4, ETR D x x - x x x x x 2996 MIRU 26 x x x x x x x x 802 MIRU 40 x x x x x x x x 960 MIRU 10 x x x x x x x x 1644 MIRU 16 x x x x x x x x 3192 MIRU 31 x x x x x x x x 154 MIRU 2 x x - - - x x - 2531 MIRU 23 x x - - - x x - 4348 MIRU 39 x x - - - x x - 2059 MIRU 20 x x - - - x x - 2687 MIRU 24 x x - - - x x - 3007 MIRU 27, QUB-5 x x - - - x x - 2165 ETR A - x x x x x x x 2461 ETR B - x - - - x x - 577 ETR C - x x x x x x x 424 Mtub04 - - x x x x x x 2401 Mtub30 - - - x x x x x 3690 Mtub39 - - x x x x x x 2347 Mtub29 - - - - - x x - 3171 Mtub34 - - - - - x x - 1451 QUB-1451 - - - - - - x - 1895 QUB-1895 - - - - - - x - 1955 Mtub21 - - x x x x x x 4156 QUB-4156 - - - x x x x x 2163a QUB-11A - - - - - - x - 2163b QUB-11B - - x x x x x x 3336 QUB-3336 - - - - - - x x 3232 QUB-3232 - - - - x - x x 3820 VNTR 3820 - - - - x - x x 4052 QUB-26 - - - x x x x x 4120 VNTR 4120 - - - - x - x - ~ 49 ~ …………………………………………………………………………………………………. 18 loci 10 0 95908580757065605550 90.2 83.4 89.9 77.9 80.1 72.5 98.2 95.8 97.4 95.6 91.7 89.7 97.2 96.5 93.8 89.5 92.7 85.1 88.3 83.1 97.7 96.4 95.8 98.2 97.1 93.7 96.3 92.2 90.9 93.3 88.7 87.6 84.2 80.1 70.2 98.7 97.4 98.7 96.9 91.9 95.4 95.5 92.3 89.9 92.4 86.7 98.4 97.9 95.3 94.5 93 81.2 98.6 99 98.1 95.4 92.7 97 94.1 92 90.6 79 69.3 56.6 18 loci M 01 -F M 01 -H M 01 -N M 02 -F M 02 -H M 02 -N M 05 -F M 05 -N M 06 -F M 06 -N M 06 -H M 09 -N M 09 -H S 11 S 12 S 13 S 14 S 15 2 1 3 4 1 3 3 7 3 4 2 5 6 3 16 3 10 9 4 1 2 5 1 3 3 7 7 2 2 5 6 3 13 6 11 8 2 2 1 3 1 3 3 7 3 4 1 4 6 7 12 8 8 7 2 7 3 3 3 5 4 9 3 3 3 6 6 6 12 6 9 9 2 6 1 3 3 3 3 7 4 2 1 4 6 7 9 3 8 7 2 2 1 3 1 3 3 7 3 4 2 5 6 3 14 3 10 0 2 3 4 3 3 3 1 3 3 2 2 4 5 4 8 3 8 3 2 4 3 3 3 5 4 9 3 4 4 6 5 7 9 4 14 9 2 4 3 3 3 5 4 9 4 4 2 6 5 7 9 4 14 8 2 3 2 3 3 5 3 7 4 2 2 7 5 7 9 5 14 9 2 4 3 2 3 5 4 9 4 4 2 7 5 8 9 6 14 9 2 4 3 2 3 3 4 9 4 4 2 7 5 8 9 7 15 7 2 2 3 3 3 5 3 7 4 4 2 7 5 4 9 7 14 7 2 7 3 3 3 5 4 9 2 4 2 11 5 8 9 7 14 9 2 6 3 3 3 5 2 5 4 4 2 7 5 5 9 3 14 9 2 7 3 3 3 5 4 5 4 4 2 7 5 7 9 3 13 9 2 7 3 3 3 5 3 7 5 2 2 7 5 7 9 3 14 9 2 7 3 2 3 4 4 9 4 4 2 7 5 8 9 3 14 8 2 2 3 4 4 6 4 9 2 2 2 7 4 4 9 3 11 6 2 2 3 4 3 9 4 9 4 2 2 7 5 7 9 3 14 9 2 5 4 7 2 4 4 8 5 2 1 6 4 6 12 3 12 9 2 4 3 5 2 4 4 9 4 4 2 5 4 7 12 6 12 5 2 4 3 3 3 6 1 3 4 4 3 10 5 8 9 3 15 9 2 4 3 2 3 5 1 3 4 4 2 7 5 8 9 3 14 9 2 2 1 3 3 5 1 3 4 4 2 6 5 7 9 3 14 9 2 4 3 3 3 5 1 3 4 4 2 6 7 9 9 3 13 8 2 7 3 3 3 5 1 2 4 4 1 5 5 8 9 3 14 9 2 7 3 2 3 5 1 3 4 4 2 7 5 8 9 4 14 9 2 7 3 3 3 5 1 3 4 2 2 7 5 8 9 3 12 9 2 7 3 3 3 5 1 3 4 4 3 7 5 8 9 8 17 9 2 7 3 3 3 5 1 3 4 4 4 10 5 8 9 6 15 9 2 7 3 3 3 5 4 1 4 2 2 10 5 8 9 3 14 9 2 4 3 3 3 5 1 3 3 4 2 6 5 4 9 3 14 4 2 4 3 3 4 5 0 1 4 2 2 6 6 5 9 3 20 9 2 4 2 3 1 3 0 0 2 2 2 4 5 5 9 3 9 6 2 1 3 2 3 5 1 3 4 4 2 7 5 7 9 9 14 9 3 2 3 4 3 5 6 4 2 2 3 8 4 4 9 3 11 7 3 2 3 4 2 5 7 4 2 2 3 7 4 4 9 3 11 7 2 2 2 4 3 5 7 4 2 2 3 7 4 4 9 1 11 7 3 2 2 4 2 5 7 4 2 2 2 7 4 4 8 3 9 7 3 2 1 4 2 5 7 4 2 2 3 7 4 4 9 3 10 8 3 2 5 3 3 5 7 4 2 2 3 7 4 3 10 3 9 6 6 2 3 4 2 5 7 4 2 2 3 7 4 4 9 3 11 7 6 2 3 4 2 5 5 4 2 4 3 7 4 4 9 3 9 7 6 2 3 4 2 5 7 4 2 2 3 8 4 4 11 3 9 5 6 2 1 4 2 5 7 3 2 2 3 7 4 4 14 3 9 7 2 2 3 4 2 4 6 4 2 2 3 7 4 4 9 3 11 2 3 2 3 3 2 5 7 3 2 4 3 7 4 4 9 4 9 4 6 2 3 4 2 5 7 4 2 2 3 7 4 4 9 9 11 7 6 2 3 4 3 5 7 4 2 2 3 7 4 4 9 8 9 7 5 2 3 4 2 4 7 4 2 2 3 6 4 4 9 7 9 7 6 2 3 4 2 5 7 4 2 2 3 7 4 4 9 10 9 5 3 2 3 4 2 5 6 3 2 2 3 7 4 4 9 8 9 7 6 2 3 4 2 5 7 4 2 4 3 7 4 4 9 6 9 6 5 2 3 4 2 5 2 4 2 2 3 6 4 4 9 3 9 7 6 2 2 4 2 5 2 4 2 2 3 7 4 4 9 3 9 7 6 2 2 4 2 5 2 4 2 2 3 7 4 4 9 3 11 7 6 2 3 4 3 5 2 5 2 2 3 7 4 4 9 3 11 7 6 2 3 4 3 5 2 4 2 2 3 7 4 4 10 3 15 7 4 2 4 4 2 6 4 4 2 2 4 7 4 3 8 3 11 7 3 2 3 4 3 5 2 4 2 2 3 7 4 4 9 3 11 7 2 2 3 4 2 4 2 5 2 2 3 7 4 4 8 3 9 6 3 2 3 4 2 5 2 4 2 2 1 8 4 4 9 3 8 7 629 811 607 653 736 610 652 609 618 608 611 635 601 603 584 724 655 643 576 617 613 645 636 647 632 633 583 735 667 586 587 670 620 623 592 630 646 654 598 650 737 595 631 668 616 628 658 666 615 625 659 657 656 672 582 626 599 627 590 660 596 641 634 HAAR T1 53 T3 37 BEIJI BEIJI T1 53 T1 20 BEIJI BEIJI BEIJI BEIJI BEIJI EAI1_ BEIJI BEIJI BEIJI BEIJI BEIJI EA14 BEIJI non non BEIJI BEIJI BEIJI BEIJI BEIJI BEIJI BEIJI BEIJI BEIJI BEIJI BEIJI BEIJI T1 12 BEIJI EA15 EA14 beijin EA EA EA14 ZERO EA14 EA14 EA15 EA15 EA14 EA14 EA14 EA14 EAI1_ EA14 EA14 EA14 EA14 EA ZERO EA15 non ZERO MAN EA14 Hình 3.6: Cây biểu diễn mối tương đồng giữa 93 chủng dựa trên VNTR – MIRU 18 loci. ~ 50 ~ …………………………………………………………………………………………………. 97 94.1 97.5 93.9 90.6 94.2 81.9 93.5 96.8 82.8 83.1 79.9 90 83.9 79.2 93.8 97 88.9 76 88.4 82.2 68.6 59.7 52 85 96.9 98.2 92.3 69.3 57.8 5.5 3 2 3 4 3 5 2 4 2 2 3 7 4 4 9 3 11 7 2 2 3 4 2 4 2 5 2 2 3 7 4 4 8 3 9 6 3 2 3 4 2 5 2 4 2 2 1 8 4 4 9 3 8 7 6 2 3 4 3 5 2 4 2 2 3 6 4 4 9 6 9 7 5 2 3 4 2 5 2 4 2 2 3 7 4 4 9 6 11 7 5 2 3 4 2 5 2 4 2 2 3 7 4 4 6 6 11 7 3 2 2 4 3 4 4 9 1 2 2 12 4 3 9 3 12 9 5 2 3 4 2 5 4 9 2 4 4 10 4 4 9 3 9 7 2 7 3 3 3 5 4 1 2 4 3 6 6 6 12 16 11 8 2 6 2 3 3 5 4 1 4 3 3 6 7 8 9 13 13 8 3 2 3 4 3 5 2 4 2 2 3 7 4 4 9 12 9 6 6 2 3 4 3 5 2 4 2 2 3 7 4 4 9 14 9 7 4 2 2 2 3 3 0 0 4 2 1 3 5 4 13 6 6 5 2 6 3 2 3 3 2 5 2 4 2 5 5 4 15 6 8 7 2 4 4 4 3 3 0 2 2 4 3 6 6 6 11 3 6 8 2 6 1 2 3 1 0 1 4 2 2 4 4 7 10 8 8 7 2 5 3 2 3 3 1 2 2 2 2 5 5 5 10 6 8 9 2 2 1 4 2 3 0 1 2 4 2 6 6 8 10 10 6 9 4 4 2 2 2 3 0 1 4 2 1 3 5 8 12 3 6 6 4 5 2 2 3 3 1 3 2 2 1 3 5 6 13 3 6 5 4 5 2 2 3 3 0 1 4 2 1 3 5 14 13 3 6 9 4 5 2 2 3 3 0 1 4 2 1 3 5 14 13 3 6 5 2 8 3 3 3 5 1 3 4 4 2 6 4 8 9 3 5 8 2 7 3 3 2 5 4 1 4 4 2 7 5 6 10 3 6 9 2 7 3 2 2 4 1 3 4 4 2 7 5 8 9 3 0 8 2 4 3 3 3 5 1 2 7 2 2 7 5 7 9 10 1 9 4 3 2 2 3 3 0 16 1 2 1 3 5 10 13 7 6 9 2 7 4 3 2 4 0 13 3 4 2 6 6 13 8 6 9 9 3 2 3 4 3 5 4 15 2 2 3 7 4 4 9 3 9 7 3 2 3 4 2 2 4 13 2 2 3 7 4 4 9 3 9 7 3 2 2 4 2 5 7 15 3 2 3 7 4 4 9 6 9 7 3 2 1 4 2 5 7 15 2 2 3 5 4 4 9 7 10 7 2 4 3 3 3 5 4 9 4 4 2 5 7 8 9 3 2 4 641 634 619 651 593 663 671 585 604 589 612 642 738 600 606 639 614 661 664 602 662 579 597 588 622 624 649 594 648 637 665 621 M. EA. EA. ZE. ZE. EA . EA . BE. BE. EA. EA . EA. H3. non non H3 . L. L. non T1 . non BE. BE. BE. BE. T1 . BE. EA. EA. EA . EA. BE. Cây biểu diễn mối tương đồng (dendrogram) Số lần lặp lại các đoạn trình tự lặp trên 18 loci M ã ng hi ên c ứu Sp ol ig ot yp e