Tổng quan về chi Panax

Tổng quan tài liệu 3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về chi Panax 1.1.1 Đặc điểm [2, 7] Theo Linnaeus (1753), chi Panax gồm nhiều loài dựa trên hình thái học của hoa, trong đó sâm Mỹ (Panax quinquefolius) được dùng làm loài chuẩn. Những nghiên cứu sau này (Candolle, 1830) mô tả nhiều loài thuộc họ Nhân sâm trong Panax. Seemann (1868) thu hẹp định nghĩa Panax thành nhóm thảo mộc có lá kép hình chân vịt có răng cưa, mọc ở đỉnh thân, cụm hoa mang một tán đơn ở tận cùng, hoa nhỏ có 5 cánh, bầu nhụy có 2 hoặc 3 lá noãn, quả mọng khi chín màu đỏ hoặc cam, có 2 – 5 hạt. Cây sống nhiều năm nhờ thân rễ, thân rễ nạc có chiều dài tùy theo số năm sinh trưởng. Khái niệm này được chấp nhận bởi các công trình nghiên cứu sau này (Hams, 1897, 1898; Hara, 1970; Hoo và Tseng, 1973, 1978; Zhou, 1975; Wen và Zimmer, 1996; Choi và Wen, 2000) [29]. Nghiên cứu di truyền học tế bào cho thấy P. ginseng, P. japonicus và P. quinquefolius là tứ bội 4n=48, trong khi P. pseudoginseng, P. notoginseng và P. trifolius là lưỡng bội 2n=24. Vùng phân bố của chi này ở Bắc Bán Cầu, từ Himalaya đến Đông Bắc Trung Quốc, vùng Viễn Đông nước Nga, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt Nam. Sâm có tác dụng tốt và được nhiều người ưa dùng, cho nên một số loài như Nhân sâm đã được trồng hàng nghìn hecta tại Hàn Quốc, Trung Quốc và Bắc Mỹ. Sâm Mỹ (Panax quinquefolius), ngoài mọc hoang tại vùng Đông Bắc, từ miền Nam Quebec đến Minnesota và miền Nam từ Oklahoma đến bang Georgia, hiện nay còn được trồng nhiều tại Ontario và British Colombia (Canada) và khắp Nhật Bản. Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis), còn gọi là sâm Ngọc Linh, sâm Khu Năm (sâm K5) hay cây thuốc giấu, là loại sâm quý được tìm thấy tại miền Trung Trung Bộ Việt Nam, mọc tập trung ở các huyện miền núi Ngọc Linh thuộc huyện Đăk Tô Tổng quan tài liệu 4 tỉnh Kon Tum, huyện Trà My tỉnh Quảng Nam. Các nhà khoa học đang thử nghiêm di thực và trồng sâm Việt Nam ở vùng núi cao từ 1.700 – 2.200m so với mực nước biển. 1.1.2 Phân loại [2, 4, 7] Chi Panax thuộc giới Thực vật (Plantae), ngành Thực vật có hoa (Magnoliophyta), lớp Hai lá mầm (Magnoliopsida), bộ Hoa tán (Apiales), họ Nhân sâm (Araliaceae). Cho đến nay, nhiều nhà phân loại học đã có những nghiên cứu nhất định về các loài thuộc chi Panax. Kể từ năm 1942 cho đến thời gian gần đây, sự phân loại đã có những thay đổi đáng kể. Trong đó, hệ thống phân loại mới nhất của Jun Wen thống kê lại 11 loài và 1 thứ loài của chi Panax. Bảng 1.1 Hệ thống phân loại các loài thuộc chi Panax H.L.Li (1942) H.Hara (1970) C.Hoo (1973) C.Y.Wu (1978) Jun Wen (2001) P. schinseng Nees P. ginseng C.A.Mey P. ginseng C.A.Mey P. ginseng C.A.Mey P. ginseng C.A.Mey P. pseudoginseng Wall P. pseudoginseng Wall P. pseudoginseng Wall P. pseudoginseng Wall P. pseudoginseng Wall subsp. Pseudoginseng var. pseudoginseng var. notoginseng (Burk) Hoo et Tseng P. notoginseng (Burk) Chen P. notoginseng F.H. Chen subsp. japonicus var. japonicus P. japonicus C.A.Mey P. japonicus C.A.Mey Tổng quan tài liệu 5 var. wangianus (Sun) Hoo et Tseng P. wangianus S.C.Sun var. angustatus (Makino) Hara var. major (Burk) Li subsp. Himalaycus Hara var. elagantior (Burk) Wu et Feng var. major (Burk) P. bipinnatifidus Seem var. angustifolius (Burk) Li var. angustifolius (Burk) Jun Wen P. stipuleanatus Tsai et Feng P. stipuleanatus Tsai et Feng P. zingiberensis C.Y.Wu et K.M.Feng P. zingiberensis C.Y.Wu et K.M.Feng P. trifolius L. P. quinquefolius L. P. vietnamensis Ha et Grushv Tổng quan tài liệu 6 1.1.3 Thành phần hóa học [2, 4]  Hợp chất steroid: β-sitosterol, daucosterin (β-sitosteryl1-3-0-β-D- glucopyranosid).  Vitamin B1, B2, C.  Các axit béo: axit panmitic, stearic và linoleic.  Tinh dầu 0,055-0,250%, chủ yếu là panaxen C15H24.  Phytosterin 0,029%, tinh bột 20%, pectin 16-23% và đường 4%. Hai thành phần chính quyết định hoạt tính là saponin và polyacetylen. 1.1.3.1 Hợp chất saponin Saponin có tính chất chung là khi hòa tan vào nước có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch, tạo nhiều bọt, có tính chất phá huyết, độc đối với động vật máu lạnh nhất là đối với cá, tạo thành phức với cholesterol, có vị hắc và làm hắt hơi mạnh. Dưới tác dụng của enzym có trong thực vật hay vi khuẩn hoặc do axit loãng, saponin bị thuỷ phân thành các phần gồm sapogenin và phần đường gồm một hoặc nhiều phân tử đường. Các đường phổ biến là D-glucose, D-galactose, L-arabinose ... Phần sapogenin có thể là sapogeninsteroid hoặc sapogenintriterpenoid. Saponin được xem là thành phần hoạt chất chính trong sâm. Các nhà khoa học đã chiết tách và xác định cấu trúc hơn 100 saponin từ các loài Panax. [4] Tổng quan tài liệu 7 Bảng 1.2 Saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxadiol Tên R1 R2 Ginsenosid-Rb1 Glc2-Glc Glc6-Glc Ginsenosid-Rb2 Glc2-Glc Glc6-Ara(p) Ginsenosid-Rb3 Glc2-Glc Glc6-Xyl Ginsenosid-Rc Glc2-Glc Glc6-Ara(f) Ginsenosid-Rd Glc2-Glc Glc Quinquenosid-R1 Glc2-Glc6-Ac Glc6-Glc Malonyl-ginsenosid-Rb1 Glc2-Glc6-Ma Glc6-Glc Notoginsenosid-R4 Glc2-Glc Glc6-Glc6-Xyl Notoginsenosid-Fa Glc2-Glc2-Xyl Glc6-Glc Notoginsenosid-Fc Glc2-Glc2-Xyl Glc6-Xyl Glc: β-D-glucopyranosyl Ara(p): α-L-arabinopyranosyl Xyl: β-D-xylopyranosyl 26 21 OH 30 1819 29 27 28 1 3 20 (S) R2 O R1 O R1=R2=H: 20(S)-protopanaxadiol Tổng quan tài liệu 8 Bảng 1.3 Saponin dẫn chất của 20(S)-protopanaxatriol Tên R1 R2 Ginsenosid-Rg1 Glc Glc Ginsenosid-nc Glc2-Rha Glc Ginsenosid-nf Glc2-Rha Glc Ginsenosid-Rh1 Glc2-Rha Glc Pseudoginsenosid-RT3 Xyl Glc Notoginsenosid-R1 Glc2-Xyl Glc Notoginsenosid-R2 Glc2-Xyl Glc Notoginsenosid-R3 Glc Glc6-Glc 26 21 OH 30 1819 29 27 28 1 3 20 (S) R2 O HO OR1 R1=R2=H: 20(S)-protopanaxatriol 1.1.3.2 Hợp chất polyacetylen Polyacetylen được phát hiện trong Nhân sâm vào những năm 60. Polyacetylen thường là các hydrocarbon mạch thẳng 17 và 18 carbon. Gần đây, việc nghiên cứu những hợp chất polyacetylen trong các cây họ Nhân sâm cho thấy chúng thể hiện một số đặc tính như: kháng nấm, kháng khuẩn, kháng viêm, kháng ngưng tập tiểu cầu và kháng ung thư. Tổng quan tài liệu 9 Bảng 1.4 Các polyacetylen tìm thấy trong một số loài sâm STT Loài Hợp chất Heptadeca-1-en-4,6-diyn-3,9-diol Heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol Heptadeca-1,4-dien-6,8-diyn-3,10-diol Panaxydol 9,10-epoxy-1,16-heptadecadien-4,6-diyn-3-ol 10-cloro-1,6-heptadecadien-4,6-diyn-3,9,10-triol 9,10-epoxy-1-heptadecen-4,6-diyn-3-ol 3-acetoxy-9,10-epoxy-1,16-heptadecadien-4,6-diyn 3-acetoxy-9,10-epoxy-4,6-heptadecadiyn 1 P. ginseng C.A.Meyer 3-acetoxy-9,10-epoxy-16-heptadecen-4,6-diyn Falcarinol Panaxatriol Panaxydol Heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol Heptadeca-1-en-9,10-epoxy-4,6-diyn-3,8-diol 3-oxo-9,10-epoxy-heptadeca-1-en-4,6-diyn 6,7-epoxy-13-tetradecen-1,3-diyn 2 P. quinquefolium 1,2,9,10-diepoxy-4,6-heptadecadiyn-3-ol 8-acetoxy-9,10-epoxy-1-heptadecen-4,6-diyn-3-ol 10-metoxyheptadeca-1-en-4,6-diyn-3,9-diol 3 P. notoginseng Panaxytriol Heptadeca-1,9(Z)-dien-4,6-diyn-3-ol (Panaxynol, Falcarinol) 10-acetoxy-heptadeca-8(E)-en-4,6-diyn-3-ol Heptadeca-1,8(E)-dien-4,6-diyn-3,10-diol 4 P. vietnamensis Ha et Grushv. Heptadeca-1,8(Z)-dien-4,6-diyn-3,10-diol Tổng quan tài liệu 10 1.1.4 Tác dụng dược lý [4] Nhân sâm đã được sử dụng hơn 2000 năm ở Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản và các nước Đông Nam Á như là một vị thuốc bổ với danh xưng là “vua của các phương thuốc”. Các nghiên cứu về tác dụng dược lý của Nhân sâm đã được thực hiện từ lâu. Những đặc điểm đa dạng về hóa thực vật đã góp phần làm phong phú tác dụng dược lý của Nhân sâm. Mỗi ginsenosid đã được chứng minh là có tác dụng hiệp lực và đối kháng với các ginsenosid khác. Y học cổ truyền phương Đông đã chứng minh Nhân sâm đóng vai trò quan trọng trong việc dự phòng và điều trị những bệnh lý mạn tính, cần điều trị dài ngày như bệnh tiểu đường, ung thư, bệnh xơ vữa động mạch, huyết khối, cao lipid máu, cao huyết áp, thiểu năng tuần hoàn não… do tác dụng tăng cường thể lực và gia tăng sức tự đề kháng không dặc hiệu của cơ thể. Y học hiện đại đã chứng minh Nhân sâm duy trì sự hằng định nội môi của hệ thần kinh trung ương, hệ nội tiết và hệ miễn dịch. Tuy các tác dụng trị liệu không điển hình, tương đối yếu so với các thuốc đặc trị Tây y nhưng việc ít gây tác dụng phụ khi sử dụng dài ngày, nhất là ở những đối tượng bệnh nhân cao tuổi là ưu điểm của Nhân sâm. Các tác dụng dược lý lâm sàng:  Tăng cường chức năng các cơ quan như não, tim, gan, thận, bộ phận sinh dục.  Bình ổn các trạng thái tâm thần.  Ức chế các trạng thái co giật, bị kích động.  Tăng lực, chống mệt mỏi về thể chất và tinh thần.  Kích thích ăn ngon.  Làm sáng mắt.  Giải độc.  Tăng sự minh mẫn và khả năng ghi nhớ.  Kéo dài tuổi thọ. Tổng quan tài liệu 11 Bảng 1.5 Kết quả thử nghiệm lâm sàng của Nhân sâm Thử nghiệm lâm sàng Hiệu lực điều trị Hệ tim mạch- huyết áp  Tác dụng hai pha trên huyết áp: hạ áp trong trường hợp cao huyết áp và tăng áp trong trường hợp hạ huyết áp.  Gia tăng sự co bóp cơ tim, giãn mạch ngoại biên, cải thiện những thông số huyết động của tim, rõ nhất là ở người cao tuổi. Sự ngưng tập tiểu cầu gây các bệnh lý về huyết khối ở não và cơ tim  Ức chế sự sản sinh thromboxan A2: yếu tố gây huyết khối và sung huyết não, cơ tim.  Kích thích sản sinh prostaglandin I2: yếu tố ức chế sự ngưng tập tiểu cầu và gây giãn mạch. Tuần hoàn máu  Giảm độ nhớt của máu, gia tăng tuần hoàn mao mạch dẫn đến cải thiện tuần hoàn máu ở các bệnh nhân tiểu đường, phụ nữ tiền mãn kinh.  Tăng hàm lượng ATP trong hồng cầu. Cao lipid máu  Giảm lipid, triglycerid do làm gia tăng sự hấp thu lipid ở ruột non.  Gia tăng HDL-cholesterol, giảm β-lipoprotein, giảm cholesterol toàn phần. Bệnh tiểu đường  Giảm hàm lượng glucose khi đói, giảm aminoterminalpropeptid.  Cải thiện hàm lượng glycated hemoglobin.  Cải thiện thể chất và tâm thần. Hệ thần kinh trung ương  Tác dụng hai pha trên hệ thần kinh trung ương: kích thích và ức chế.  .Tác dụng giải lo âu, chống trầm cảm. Tổng quan tài liệu 12  Gia tăng các hoạt động não bộ: tăng nhận thức, sự minh mẫn, khả năng ghi nhớ. Sự mệt mỏi và stress  Gia tăng sử dụng oxy, giảm hàm lượng lactat, giảm nhịp tim khi vận động quá sức.  Giảm mệt mỏi thể chất, tăng sự tỉnh táo, độ tập trung khi làm việc ban đêm.  Ổn định huyết áp, thân nhiệt, nhịp tim trong stress do thay đổi nhiệt độ.  Kích thích hoạt năng vỏ thượng thận (tiết ACTH, corticosteron) để đáp ứng và thích nghi với stress. Hệ miễn dịch  Gia tăng số lượng bạch cầu, bạch cầu đa nhân, tế bào giết tự nhiên, tế bào lympho T4 (CD4), T8 (CD8), tế bào T hoạt hóa, tế bào lympho B.  Gia tăng sức đề kháng của cơ thể với các bệnh lý nhiễm trùng hay nhiễm vius.  Giảm tần suất xuất hiện và sự xuất hiện của tế bào ung thư.  Cải thiện thể trạng bệnh nhân bị ung thư. Bảo vệ gan-Giải độc rượu  Cải thiện các triệu chứng lâm sàng (vàng da, chán ăn, đau dạ dày, đau đầu, chóng mặt, nôn ói) và các chỉ số sinh hóa của chức năng gan (bilirubin, transaminase, alkalin phosphatase) trong giai đoạn đầu của viêm gan siêu vi B và các bệnh lí gan mãn tính.  Gia tăng sự chuyển hóa và đào thải rượu trong bệnh lí xơ gan do nghiện rượu. Hoạt động tình dục-Điều hòa nội tiết  Gia tăng khả năng, ham muốn và khoái cảm tình dục.  Hỗ trợ điều trị rối loạn cương dương.  Giảm nhẹ các triệu chứng khó chịu của thời kì tiền mãn kinh và hậu mãn kinh ở phụ nữ. Tổng quan tài liệu 13 1.2 Hệ thống học mức phân tử của Panax [19, 23] Để tiếp cận hệ thống phân loại mới trong hệ thống học mức phân tử của thực vật, người ta tập trung nghiên cứu về các gen RNA ribosom được mã hóa trong nhân (rDNA). Các gen này được sắp xếp trong những đơn vị lặp lại nối tiếp nhau với mỗi đơn vị mang những gen của tiểu phần nhỏ 18S, 5.8S và tiểu phần lớn 26S. Những vùng mã hóa của những gen rDNA 18S, 5.8S và 26S trong nhân được bảo tồn ở mức độ cao ở thực vật và những gen này cho thấy ít có sự khác biệt về trình tự giữa những loài có quan hệ gần và có ích cho những công trình nghiên cứu phát sinh loài giữa các sinh vật có quan hệ xa. Bên trong mỗi đơn vị lặp lại, những vùng được bảo tồn được ngăn cách bởi hai vùng đệm trong vùng được phiên mã (Internal Transcribed Spacer region – ITS) ITS1 và ITS2, những vùng này có tỉ lệ khác biệt cao hơn, thích hợp cho những nghiên cứu phát sinh loài giữa các sinh vật có quan hệ gần. Hình 1.1 Vùng gen RNA ribosom (rDNA) 1.3 Các phương pháp phân biệt loài dựa trên DNA [3, 5, 17, 21, 30] Một trong những phương pháp đáng tin cậy nhất trong việc xác định thảo dược là phân tích DNA bởi vật liệu di truyền là duy nhất cho mỗi cá thể bất chấp hình dạng ngoài của chúng và ít bị ảnh hưởng bởi tuổi, điều kiện sinh lý, yếu tố môi trường, thu hoạch, bảo quản và chế biến. DNA chiết từ lá, thân hay rễ đều mang cùng thông tin di truyền, có thể chiết DNA từ mô còn tươi hay đã khô. DNA được chiết thì ổn định và có thể giữ ở -20oC trong thời gian dài (khoảng 3 – 5 năm), do đó loại bỏ sự giới hạn về thời gian trong phân tích. Chỉ sử dụng một lượng rất ít mẫu cũng có hiệu quả, đây là một thuận lợi trong việc phân tích những dược liệu đắt tiền hoặc có giới Tổng quan tài liệu 14 hạn. Các phương pháp DNA có thể được chia làm ba loại: các phương pháp dựa trên phản ứng chuỗi polymerase (PCR), dựa trên sự lai và dựa trên giải trình tự. 1.3.1 Các phương pháp dựa trên PCR [15, 16, 27] PCR dùng khuếch đại vùng mong muốn trên bộ gen, sau đó điện di trên gel được thực hiện để xác định kích thước của sản phẩm. Phương pháp PCR có thuận lợi là độ nhạy cao trên một số lượng mẫu rất ít. Tuy nhiên, các chất ức chế PCR (như các polyphenol, sắc tố và các polysaccharid) có thể hiện diện trong mẫu DNA, do đó cản trở PCR. Ngoài ra, PCR có thể bị ngoại nhiễm do độ nhạy cao của nó. DNA từ vi khuẩn hay nấm nhiễm trong những mẫu dược liệu không được bảo quản đúng cách có thể được nhân lên cùng lúc. 1.3.1.1 PCR-Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (PCR-RFLP) [9, 10, 14, 24] PCR-RFLP dùng các endonuclease để cắt các sản phẩm PCR có trình tự đa hình. Đoạn PCR lớn bị cắt thành những đoạn nhỏ đa hình và được biểu hiện trên băng điện di. PCR-RFLP được ứng dụng trên Panax, Fritillaria pallidiflora, Atractylodes và Codonopsis. Việc dò tìm các sản phẩm PCR bằng cách dùng các enzym giới hạn khác nhau có thể thay thế việc giải trình tự để tìm ra sự đa hình giữa các mẫu. Phương pháp này có độ lặp lại cao hơn các phương pháp dùng mồi ngẫu nhiên nhưng nó bị giới hạn mức độ đa hình giữa các cá thể trong cùng loài. Các vùng giới hạn bị mất có thể liên quan tới sự thoái hóa của DNA. Ngoài ra, sự hiện diện của các chất ức chế enzym có thể làm sự phân cắt không hoàn toàn. 1.3.1.2 Đa hình chiều dài đoạn DNA nhân bản (AFLP) [13] AFLP được Zabeau và Vos dùng đầu tiên vào năm 1993. Gồm các bước sau:  Cắt DNA bộ gen bằng một hay vài enzym giới hạn và nối vào các adapter.  Khuếch đại có chọn lọc một vài đoạn giới hạn dùng các mồi mang trình tự của các adapter. Tổng quan tài liệu 15  Điện di để phân cách các đoạn trên gel. Sự đa hình có thể do sự thay đổi của một nucleotid ở vị trí cắt giới hạn hay ở đầu 3’ của vị trí gắn mồi, sự thêm vào hay mất đi cũng như sự tái sắp xếp của nucleotid. Phương pháp này đã được dùng để xác định và nghiên cứu đa dạng di truyền của nhiều loại thảo dược. AFLP kết hợp khả năng lặp lại cao của RFLP và nhạy của PCR. Bằng cách dùng các trình tự adapter, các dấu ấn có thể được tạo ra mà không cần biết về trình tự DNA. Số lượng các đoạn khuếch đại có thể được điều chỉnh bằng cách thay đổi các enzym giới hạn. Nó có thể phát hiện đa hình thậm chí ở những cá thể có quan hệ gần. Số lượng đa hình có thể cao hơn RFLP hay RAPD. Sự đa hình giả có thể xảy ra nếu cắt và nối DNA không tốt. Ngoài ra, nếu trình tự tương đồng giữa hai sinh vật dưới 90% thì các dấu ấn của chúng sẽ có rất ít đoạn chung. 1.3.1.3 PCR mồi ngẫu nhiên (RP-PCR) [8, 12, 25] RP-PCR dùng một hay hai mồi ngẫu nhiên ở nhiệt độ gắn mồi thấp cho mỗi phản ứng PCR để tạo ra các dấu ấn duy nhất. Trong điều kiện không nghiêm ngặt, mồi sẽ gắn ngẫu nhiên vào các vùng trên DNA khuôn mẫu mặc dù trình tự mồi và DNA khuôn không bắt cặp nhau hoàn toàn. Các băng được ghi nhận và được dùng để tính khoảng cách di truyền và xây dựng cây phát sinh loài để nghiên cứu quan hệ giữa các mẫu. Một số kỹ thuật dựa trên chiến lược này bao gồm PCR mồi tùy ý (AP-PCR), DNA đa hình khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD) và in dấu nhân bản DNA (DAF). AP-PCR có độ lặp lại cao nhất trong cả ba phương pháp. Bởi vì bất cứ phần nào của bộ gen, bao gồm cả vùng không mã hóa, cũng có thể được khuếch đại, các phương pháp này có thể dùng để phân biệt giữa các cá thể có quan hệ gần. RP-PCR đã được dùng để xác định ở mức cá thể, giống, chủng và loài, nghiên cứu đa dạng di truyền và sự khác biệt giữa các mẫu hoang dại và nuôi trồng. Nó được dùng để xác định thảo dược và nguồn gốc địa lý của chúng. Tổng quan tài liệu 16 RP-PCR là phương pháp nhanh và dễ để dò tìm số lượng lớn các đa hình trong một PCR đơn. Các dấu ấn đa hình có thể được tạo ra nhanh chóng mà không cần biết thông tin về trình tự. Tuy nhiên, RP-PCR có một vài giới hạn. Đầu tiên, nó nhạy với điều kiện phản ứng như nồng độ mẫu và ion Mg2+, trình tự mồi, sự hiện diện của glycerol và số lượng và chất lượng polymerase. Chu trình luân nhiệt cũng có thể ảnh hưởng bởi sự khác nhau của thời gian biến nhiệt từ bước gắn mồi tới bước kéo dài. Do đó, các kết quả từ những điều kiện phản ứng khác nhau không thể so sánh với nhau. Thứ hai, khả năng lặp lại có thể bị ảnh hưởng bởi chất lượng, số lượng và độ tinh sạch của DNA khuôn. Số băng tạo ra có thể tăng đáng kể bằng cách thêm anbumin huyết thanh bò (BSA) để ngăn chặn các chất ngoại nhiễm trong DNA không tinh sạch gắn vào Taq polymerase do đó ổn định polymerase. Do vậy, phương pháp này không đáng tin cậy để xác định dược liệu mà DNA không tinh sạch hay bị phân hủy trong quá trình xử lí hay bảo quản trong thời gian dài. Thứ ba, bởi vì dùng mồi tùy ý và điều kiện không chặt chẽ, DNA từ bất kỳ sinh vật nào gồm cả những loài ngoại nhiễm cũng có thể được khuếch đại. Ngoài ra, các đoạn có cùng kích thước không chắc có cùng trình tự. 1.3.1.4 Vi vệ tinh khuếch đại ngẫu nhiên (RAMS) [6, 18, 20, 28] Microsatelite (vi vệ tinh) ngày nay đã trở thành thuật ngữ chung nhất để miêu tả các loại trình tự lặp lại ngẫu nhiên (không dài quá 6 nucleotid), thay vì sử dụng các thuật ngữ STR (Short Tandem Repeat – các đoạn lặp lại ngắn), VNTR (Variable Number of Tandem Repeat - Các trình tự lặp lại đa dạng về số lượng). Microsatelite có tính đa hình rất cao, loại có tính đa hình cao nhất (loại không bị ngắt quãng) được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau. Nhưng trong thực tế, các microsatelite thường bị ngắt quãng, hoặc kết hợp giữa các loại trình tự lặp lại. Microsatelite được tìm thấy trong tất cả cơ thể sống (đặc biệt những cơ thể có bộ gen lớn). Những đoạn lặp lại của polyA/polyT là kiểu phổ biến nhất trong tất cả các bộ gen nhưng tần số phân bố giữa các loài rất khác nhau; ngoài ra còn có một số kiểu lặp lại phổ biến khác như kiểu lặp lại 2 nucleotid như CA/GT và AG/TC. Di truyền học Tổng quan tài liệu 17 và các nghiên cứu khác cho rằng cơ chế xuất hiện và hình thành microsatelite là do quá trình trượt, lỗi của enzym polymerase trong quá trình sao chép DNA. Căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2-6 lần) chúng ta có di-nucleotid repeat, tri- nucleotid repeat. Loại d