Từ gen đến sinh vật chuyển gen

L o g o TỪ GEN ĐẾN SINH VẬT CHUYỂN GEN L o g o NỘI DUNG THÀNH PHẦN CỦA GENOME 1 2 CẤU TRÚC CỦA GEN 3 SỐ GEN TRONG GENOME 4 MÔ TẢ GENOME HỆ THỐNG 3 CHỌN LỌC BẰNG PP TRUYỀN THỐNG 4 ĐỘT BIẾN THỰC NGHIỆM TRONG GENOME L o g o I. THÀNH PHẦN CỦA GENOME - Là tập hợp tất cả các gen đặc trưng cho một loài = Mọi thông tin di truyền được cất giữ trong DNA (chứa các gen hay là những vùng được phiên mã thành RNA) Thành phần cơ bản cấu trúc gen 1:Vùng cách ly; 2:Yếu tố mở chất nhiễm sắc; 3:Trình tự tăng cường xa; 4:Trình tự tăng cường gần; 5:Vùng khởi đầu phiên mã; 6:Exon; 7:Intron; 8:Vùng phiên mã; 9:Vùng kết thúc phiên mã, P:Promoter; UTR:Vùng không dịch mã 5’UTR 3’UTR 1 2 MAR 3 4 5 AUG UAG AAUAAA 1 MAR 6 7 8 9 P L o g o I. THÀNH PHẦN CỦA GENOME DNA chứa những vùng khởi đầu cho sự tái bản và chúng được tái bản trong mỗi lần phân bào. Ở những pha khác của chu kỳ tế bào, nhiễm sắc thể ở trạng thái nguyên nhiễm sắc tương ứng với những vùng chất nhiễm sắc mở. DNA của eukaryote chứa tâm động được hình thành bởi những đoạn căng dài. Đầu mút của nhiễm sắc thể mang các đoạn lặp lại đặc thù gọi là telomere. L o g o I. THÀNH PHẦN CỦA GENOME Genome còn chứa những trình tự DNA khác mà chức năng chưa được biết, có thể làm biến đổi hoặc đe dọa tính toàn vẹn của genome. - Những trình tự retrovirus hợp nhất ngẫu nhiên vào genome tế bào bị lây nhiễm - Gen nhảy (transposon) Genome cũng mang dấu tích của gen đã bất hoạt qua thời gian dài bởi những cơ chế khác nhau vì vậy nó được gọi là gen giả (pseudogenes). L o g o I. THÀNH PHẦN CỦA GENOME Các trình tự rất ngắn (microsatellites) hoặc dài hơn (minisatellites) có nhiều bản sao trong genome động vật và thực vật. Chúng được gọi là DNA ích kỷ (selfish DNA). Sự tiến hóa đã tạo ra những tế bào có khả năng làm bất hoạt các DNA ký sinh và ngăn cản sự tái bản của chúng, sự tái bản này có thể làm biến đổi chức năng của genome. L o g o II. CẤU TRÚC GEN Kích thước của gen thay đổi tùy loài Ở Eukaryote, phần lớn các gen bị gián đoạn, gồm những đoạn exon xen kẽ với những đoạn intron. Intron bị loại bỏ khỏi mRNA tiền thân để tạo ra mRNA hoàn chỉnh. Quá trình ghép nối exon cần có sự tham gia của phức hợp ribonucleo- protein (được gọi là spliceosome). L o g o II. CẤU TRÚC GEN L o g o II. CẤU TRÚC GEN - Số lượng và kích thước của intron tăng lên trong suốt quá trình tiến hóa. - Một số intron rất dài, mang các gen hoạt động chức năng. - Một số mRNA không có intron. Quá trình phiên mã được điều hòa bởi những cơ chế đặc biệt phức tạp liên quan điến các yếu tố phiên mã. Hoạt động của các yếu tố phiên mã rất đa dạng và phức tạp do sự kết hợp của chúng trong các loại tế bào khác nhau. L o g o II. CẤU TRÚC GEN Promoter nằm gần vị trí khởi đầu phiên mã và có kích thước không dài quá 150-200 nu. L o g o II. CẤU TRÚC GEN Các promoter đầu tiên được tìm thấy trong genome virus và trong các gen tế bào biểu hiện cao nhất chứa các trình tự hiệu ứng Nhiều gen có TATA box ở vị trí khoảng -30bp ngược hướng so với vị trí khởi đầu phiên mã, những yếu tố đặc hiệu bám vào TATA box và là một bộ phận của phức hợp khởi đầu phiên mã. Regulatolary promoter Core promoter L o g o II. Cấu trúc gen Một số gen không có TATA box và promoter của chúng được tạo thành bởi yếu tố khởi đầu trùm lên vị trí khởi đầu. Những gen khác có promoter ở cách vị trí khởi đầu 30bp cùng hướng, được đặt tên là các yếu tố promoter cùng hướng L o g o II. CẤU TRÚC GEN Cách promoter một đoạn từ vài trăm nuleotide đến 10kb hoặc nhiều hơn theo chiều ngược hướng là các trình tự tăng cường phiên mã. Trình tự tăng cường mang những vị trí bám dành cho các yếu tố phiên mã. Phức hợp DNA và yếu tố phiên mã được gọi là thể tăng cường. + L o g o II. CẤU TRÚC GEN Ngược hướng với promoter ở phía xa hơn (30-100kb) là những vùng điều hòa khác được tìm thấy ở một số gen nhất định. Một số vùng điều hòa này được gọi là vùng kiểm soát locus (LCR). LCR chứa những yếu tố khác nhau, một số là trình tự tăng cường và một số là các yếu tố cách ly LCR có liên quan đến việc giữ chất nhiễm sắc ở trạng thái mở cục bộ, làm cho các yếu tố phiên mã hoạt động để kích thích các gen đích của chúng. L o g o II. Cấu trúc gen Những đột biến ở những vùng không mã hóa của mRNA thường dẫn đến sự tổng hợp protein bất thường và gây ra các bệnh tật ở người. Vùng mã hóa 5’UTR 3’UTR Một trong những bước của chuyển gen là thiết kế gen mong muốn biểu hiện một cách thích hợp khi chuyển vào tế bào. L o g o III. SỐ GEN TRONG GENOME Vi khuẩn: Genome vi khuẩn chứa khoảng 2000-4000 gen. Nấm men Sacharomyces cerevisiae có khoảng 6000 gen. Sacharomyces Micobacterium L o g o Động vật: - Động vật đơn giản nhất Caenorhabditis elegans được cấu tạo từ 959 tế bào có khoảng 19000 gen. Caenorhabditis elegans III. SỐ GEN TRONG GENOME L o g o Thực vật: Chứa trung bình khoảng 25000 gen. - Ruồi giấm Drosophila melanogaster không nhiều hơn 15000 gen. - Động vật có vú chứa không nhiều hơn 40000- 50000 gen. III. SỐ GEN TRONG GENOME Drosophila melanogaster L o g o Thực vật không có hệ thần kinh, không có hệ miễn dịch và hệ thống điều hòa nội tiết tương đối đơn giản so với động vật. Số lượng và cấu trúc của gen linh trưởng bậc cao hoàn toàn tương tự với gen người, nhưng mức độ biểu hiện của một số gen trong não lại khác nhau.  Điều này cho thấy là độ phức tạp của một cơ thể sống không liên quan tới số gen mà nó có. III. SỐ GEN TRONG GENOME L o g o Số gen mã hóa cho protein cần thiết cho cơ thể chỉ chiếm một phần nhỏ trong kích thước của genome Phần còn lại của genome còn chưa được khám phá hết Vd: các vùng phiên mã ra RNA nhưng lại không mã hóa chuỗi polypeptide: - Một số RNA này tham gia vào cấu trúc ribosome. III. SỐ GEN TRONG GENOME RNA trong ribosome L o g o - RNA tạo phức ribonucleoprotein tham gia ghép nối exon. - RNA hoạt động như RNA ngược hướng, sửa đổi cấu trúc NST, điều hòa hoạt động protein III. SỐ GEN TRONG GENOME RNA splicing L o g o Người ta thấy rằng một protein đảm nhận một chức năng trong một giai đoạn phát triển của phôi và một chức năng khác trong tế bào đã biệt hóa của cơ thể trưởng thành. Nguyên nhân là do sự tác động qua lại giữa các protein với nhau và với các thành phần khác của tế bào. Ở người có khoảng 1000-2000 yếu tố phiên mã cần thiết để kiểm soát 40000 gen  tính phức tạp của các yếu tố phiên mã. III. SỐ GEN TRONG GENOME L o g o 5’ UTR 3’ UTR Vùng mã hóa AAAAAAAAAAA A 7mG Bộ 3 mở đầu Bộ 3 kết thúc Exon 1 5’ Intron 1 Exon 2 Exon 3 Intron 2 Tiền mARN III. SỐ GEN TRONG GENOME RNA splicing L o g o Một gen có vài điểm khởi đầu phiên mã  các phân tử mRNA khác nhau  protein có cấu trúc và hoạt tính sinh học khác nhau. Sự ghép nối chọn lọc (alternative splicing) các exon trong quá trình chế biến mRNA cũng tạo ra các protein khác nhau với các chức năng sinh học khác nhau. III. SỐ GEN TRONG GENOME Exon 1 Exon 3 Exon 2 Cắt nối Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 1 Exon 3 Tiền mARN Ghép nối chọn lọc (alternative splicing) L o g o IV. MÔ TẢ GENOME HỆ THỐNG Hiện nay, với sự phát triển mạnh mẽ của các kỹ thuật di truyền thì việc nghiên cứu genome ngày càng được hoàn thiện. Đối với công nghệ chuyển gen thì việc cốt yếu đầu tiên là phải phân lập được đoạn gen đích và tạo dòng nó. Để nghiên cứu một gen hệ thống thì có 3 phương pháp chính: - Phương pháp tạo dòng gen truyền thống - Phương pháp tạo dòng định vị dựa vào microsatellite - Giải trình tự dựa vào hệ thống của EST và genome sẽ dẫn đến việc nhận biết tất cả các gen của một hệ thống sống L o g o Xác định microsatellite NST Gen cần xác định Chạy PCR Gen mong muốn Phân tích trình tự gen NC chức năng gen Chọn lọc phôi Chọn lọc di truyền Chuyển gen Liệu pháp gen Thêm gen Thay thế gen Tạo dòng gen chuẩn Phân tích trình tự hệ thống Xác định gen bằng DNA chip Nghiên cứu gen hệ thống L o g o V. PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG - Phức tạp - Không được quy định bởi gen đơn có tác động trội  Làm hiện ra các gen quy định tính trạng nằm trên NST khác nhau thông qua sinh sản Dựa vào: - Tất cả các trường hợp sàng lọc đột biến xuất hiện một cách tự sinh - Có tác động kiểu hình trội  truyền cho thế hệ sau L o g o  Chọn lọc dựa vào sự đo lường các thông số mô tả quan tâm Kích thước động vật V. PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG L o g o Sự sản xuất sữa của vật nuôi Tập tính của động vật cảnh Khiếm khuyết ở động vật thí nghiệm L o g o Sự tương quan giữa kích thước của các microsatellite với tính trạng di truyền được sử dụng để nhận diện các cá thể mang đột biến  Đơn giản hơn, nhanh hơn, chính xác hơn V. PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG L o g o ỨNG DỤNG Nhận diện gene quy định tính siêu sinh sản ở cừu Booroola Merino L o g o Gene BMPR-1B, liên quan đến sự rụng trứng ở động vật - Chọn lọc động vật siêu sinh sản - Cung cấp thông tin mong muốn về các cơ chế kiểm soát sự rụng trứng ở động vật có vú. - Xác định phương pháp mới để tăng cường độ hữu thụ - Tạo ra các thuốc tránh thai mới - Chuyển vào các cá thể không siêu sinh sản ỨNG DỤNG L o g o Sữa bò có thành phần protein thay đổi và có thể di truyền cho thế hệ sau. - Nồng độ protein phụ thuộc nồng độ casein. - Chọn lọc thực hiện qua nhiều năm bằng sự nhận diện các casein khác nhau trong sữa.  Hiệu quả nhưng chậm  Phổ biến trong thực tiễn chăn nuôi ỨNG DỤNG L o g o Vì vậy: - Là một sự tiến triển thực sự đối với việc chọn lọc động vật - Phụ thuộc chặt chẽ các đột biến tự sinh xuất hiện với tần số thấp hoặc xuất hiện không phải ở tất cả các giai đoạn của quá trình sinh sản ỨNG DỤNG L o g o VI. ĐỘT BIẾN THỰC NGHIỆM TRONG GENOME Đột biến tự nhiên hiếm xảy ra trong mỗi chu trình sinh sản của sinh vật. Tần số đột biến tự nhiên là tương đường với sự chọn lọc các vi sinh vật đột biến tự nhiên có hiệu quả. - Đột biến thực nghiệm là hữu ích về mặt lý thuyết đối với các cơ thể đa bào, chủ yếu là cơ thể có tốc độ sinh sản chậm - Mỗi chu kì sinh sản sẽ tạo số lượng thể đột biến cao hơn - Một số kĩ thuật có thể ứng dụng cho hầu hết cơ thể sống L o g o 1. SỰ PHÁT SINH ĐỘT BIẾN HÓA HỌC ENU (ethyl-nitroso-urea) Thường gây đột biến ở vi sinh vật Làm giảm việc sàng lọc các dòng mang đặc tình mong muốn  Cho sinh sản, nhân lên L o g o Bắt cặp sai trong sao chép Sao chép Sàng lọc kiểu gen Bằng sử dụng tài liệu lưu trữ DNA/ tinh trùng Sàng lọc kiểu hình Những bất thường về hình thái, huyết thanh, tia X Kiểm tra thế hệ G2 Chủng hoang dại Bộ gene đột biến Chèn ngẫu nhiên L o g o 2. SỰ HỢP NHẤT CỦA DNA NGOẠI LAI - Gen chuyển sau khi hợp nhất vào genome tế bào chủ sẽ tạo đột biến do làm biến đổi tính toàn vẹn của genome - Gen ngoại lai đưa vào phôi động vật có vú bằng vi tiêm - Tần số hợp nhất có thể được tăng lên nhiều nhờ tranposon vector - Trình tự đầu tiên vào một hoặc một số vị trí - Tái bản và hợp nhất vào nhiều vị trí khác nhau L o g o IRT IRT Gene transposon Phiên mã Dịch mã Transposase RNA Phiên mã ngược DNA Hợp nhất DNA genome Đột biến gen bằng xen transposon L o g o 3. PHÁT SINH ĐỘT BIẾN BẰNG CHUYỂN GEN - Chuyển gen thực chất là một đột biến. - Là bước câng thiết đối với việc nhìn nhận chức năng của gen mới. - Chọn lọc bằng chuyển gen chính xác và ít mạo hiểm hơn phương pháp truyền thống. - Cung cấp các thông tin di truyền chưa bao giờ xuất hiện trong chọn lọc truyền thống. - Sinh vật chuyển gen và các sản phẩm của chúng phải được nghiên cứu cẩn thận trước khi sử dụng rộng rãi L o g o Chọn lọc truyền thống X x Gen ngoại lai Các đoạn NST đồng chọn lọc Gen quan tâm Chuyển gene X Hoặc Gen ngoại lai (Gen quan tâm) Thêm hoặc thay thế L o g o C l i c k t o e d i t c o m p a n y s l o g a n .