Tuyển chọn môi trường thay thế MRS Broth để tăng sinh vi khuẩn lactic có hoạt tính hỗ trợ tăng trưởng cây trồng

728 TUYỂN CHỌN MÔI TRƢỜNG THAY THẾ MRS BROTH ĐỂ TĂNG SINH VI KHUẨN LACTIC CÓ HOẠT TÍNH HỖ TRỢ TĂNG TRƢỞNG CÂY TRỒNG Nguyễn Hoài Hƣơng, Trần Lê Bích Trâm Viện Khoa học Ứng dụng, trường Đại học Công nghệ TP.Hồ Chí Minh (HUTECH) TÓM TẮT Ba chủng vi khuẩn lên men lactic Lactobacillus sp. L3, L5 và L2N được nuôi cấy trong môi trường MRS Broth, môi trường chứa dịch chiết bắp cải hoặc nước chiết giá bổ sung 12g/L glucose và 15 g/L peptone. Khả năng tổng hợp sinh khối trong hai môi trường nước chiết bắp cải và nước chiết giá bằng 91-93% so với MRS Broth, khả năng phân giải lân cao nhất trong môi trường nước chiết giá, khả năng sinh biofilm và IAA lại cao nhất trong môi trường nước chiết bắp cải. Khả năng kháng nấm tương đương nhau khi nuôi cấy vi khuẩn trên 3 môi trường. Từ đó, môi trường Nước bắp cải có bổ sung bổ sung 12g/L đường glucose và 15g/L pepton là môi trường được chọn để thay thế MRS Broth. Từ khóa: Biofilm, Indole acetic acid, phân giải lân, ức chế nấm mốc, vi khuẩn lên men lactic. 1. GIỚI THIỆU Vi khuẩn lên men lactic xuất hiện tự nhiên trọng thực phẩm hoặc được thêm vào làm giống khởi động trong rất nhiều loại thực phẩm khác nhau. Vi khuẩn lên men lactic được xếp vào nhóm GRAS và đã có nhiều nghiên cứu cho thấy khả năng kháng nấm của chúng đối với nấm mốc, đặc biệt là các chủng nấm Aspergillus spp., Fusarium spp. và Penicillium spp. [1], [2]. Bên cạnh đó, cũng đã có các nghiên cứu cho thấy một vài chủng vi khuẩn lactic mang các khả năng giúp kích thích tăng trưởng cây trồng: phân giải lân, sinh Indole-3-Acetic Acid (IAA) và tạo màng sinh học (biofilm) – một trong những yếu tố chính được xác định như là một rào cản để chúng chống lại sự phát triển của hư hỏng và mầm bệnh và đã được ghi nhận trong nghiên cứu trước đó [3]. Các khả năng trên đã mở ra tiềm năng trong việc ứng dụng vi khuẩn lactic tạo chế phẩm sinh học hỗ trợ phát triển cây trồng. Tuy nhiên, các nghiên cứu môi trường thay thế môi trường MRS Broth vẫn chưa được quan tâm. Chính vì vậy, nghiên cứu được thực hiện nhằm tìm kiếm môi trường thay thế loại môi trường tổng hợp, thích hợp tạo chế phẩm sinh học được thực hiện. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Các giống vi khuẩn lên men lactic Lactobacillus sp. L5, Lactobacillus sp. L2N, Lactobacillus sp. L3 - được phân lập từ nem chua và cơm mẻ và nấm Aspergillus sp. CĐP1 – phân lập từ đậu phộng bị nhiễm nấm mốc do phòng thí nghiệm vi sinh Viện Khoa Học Ứng Dụng Trường Đại Học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh cung cấp. Daconil 75WP từ Công ty TNHH Việt Thắng, gồm 75% Chlorothalonil. Hạt đậu phộng, giá và bắp cải mua từ chợ Thị Nghè, quận Bình Thạnh, Thành phố Hồ Chí Minh. 729 2.2. Phƣơng pháp 2.2.1. Nuôi cấy vi khuẩn Các chủng LAB được giữ giống và nhân giống trong môi trường MRS. Lên men thực hiện trong các môi trường sau đây: MRS Broth; môi trường nước giá được chuẩn bị từ 500g giá trong 1000 mL nước, đun sôi 100°C trong 20 phút, bổ sung thêm 12 g/L glucose và 15 g/L peptone; môi trường nước bắp cải được chuẩn bị từ 500g bắp cải trong 1000 mL nước, đun sôi 100°C trong 20 phút, bổ sung thêm 12 g/L glucose và 15 g/L peptone. Mật độ tế bào nuôi cấy trong ba môi trường trên được xác định dựa vào mật độ quang ở 600 nm và đường chuẩn tế bào. 2.2.2. Thử nghiệm sinh IAA Các chủng vi khuẩn LAB được nuôi cấy trên 3 loại môi trường và ủ ở 37°C qua đêm, ly tâm 8000 vòng/ phút trong 15 phút. 1 mL dịch ly tâm được bổ sung thêm 2 mL thuốc thử Salkowski và ủ 30 phút trong bóng tối. Nồng độ IAA được xác định thông qua đường chuẩn IAA từ 0-25 µg/mL bằng cách đo OD mẫu và dịch chuẩn ở bước sóng 530nm [4]. 2.2.3. Thử nghiệm khả năng phân giải lân Khả năng phân giải lân được xác định dựa trên đường chuẩn orthophosphate (PO4 3- ) trong dịch nuôi cấy. Các chủng vi khuẩn LAB được nuôi cấy trên 3 loại môi trường ở 37°C trong 24 giờ, giá trị OD được điều chỉnh về 0,8. Chuyển 1 mL dịch nuôi cấy vào 20 mL môi trường Pikovskaya‘s Broth và ủ ở 37°C. Nồng độ orthophosphate được xác định dựa vào đường chuẩn orthophosphate từ 0-4000 mg/L bằng cách xác định OD dịch chuẩn và mẫu ở 690nm. 2.2.4. Thử nghiệm khả năng tạo biofilm Thử nghiệm được cải tiến theo phương pháp mô tả bởi O'Toole [5]. 2.2.5. Thử nghiệm khả năng kháng nấm 1cm 2 thạch nấm Aspergillus sp. CĐP1 được đặt lên tâm đĩa MRS Agar cải tiến, ba chủng vi khuẩn LAB được nuôi cấy trên 3 loại môi trường khảo sát 24 giờ ở 37°C và cấy cách tâm đĩa 2,5 cm, các đĩa được ủ ở 37°C trong 72 giờ. Khả năng kháng nấm (%) = [(Đường kính vòng nấmĐối chứng – Đường kính vòng nấmThí nghiệm)/Đường kính vòng nấmĐối chứng] × 100. 2.2.6. Xử lý thống kê Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần, xử lý thống kê phân tích ANOVA sử dụng phần mềm Statistical Analysis System (SAS 9.4). 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Mật độ tế bào Mật độ tế bào vi khuẩn lactic nuôi cấy trên 3 môi trường thí nghiệm thông qua giá trị OD 600nm được thể hiện ở hình 1. Mật độ tế bào của 3 chủng vi khuẩn trên môi trường Nước giá và Nước bắp cải bằng 92,67% và 91,0% tương ứng so với MRS Broth, tuy nhiên trên cả hai loại môi trường này, các chủng vi khuẩn phát triển tương đối ổn định và mật độ tế bào của các chủng L5, L3 và L2N trên hai loại môi trường xấp xỉ gần nhau. Chủng L5 và L3 giảm hẳn tốc độ tăng trưởng sau 16 giờ, L2N vào ngừng tăng trưởng sớm hơn, mới 6 giờ đã ngừng tăng trưởng trong 3 môi trường. Sinh khối L5 và L3 tăng nhẹ và duy trì đến 66 giờ, trong một số trường hợp tiếp tục tăng nhẹ đến 72 giờ, trừ trường hợp chủng L5 giảm sinh khối từ 730 66 giờ đến 72 giờ khi nuôi cấy trong MRS Broth hoặc L2N trong môi trường nước giá. Nhìn chung, sinh khối sinh ra từ các môi trường thay thế MRS Broth tuy thấp hơn nhưng ở mức chất nhận được. Hình 1. Giá trị OD 600nm của các chủng vi khuẩn lactic trên các loại môi trường (A – Chủng L5; B – Chủng L3; C – Chủng L2N) 3.2. Khả năng sinh IAA Trên hai loại môi trường Nước giá và Nước bắp cải, các chủng vi khuẩn lactic đều duy trì được khả năng sinh IAA. Hình 2. Nồng độ IAA (µg/ml) của các chủng vi khuẩn lactic trên từng loại môi trường (P < 0,05, Tukey test) Kết quả từ hình 2 cho thấy, cả ba chủng L5, L3 và L2N có nồng độ IAA được sinh ra nhiều nhất khi nuôi cấy trrên môi trường MRS Broth. Cả ba chủng L5, L3 và L2N cho kết quả sinh IAA cao hơn trên môi trường MRS Broth khi so sánh với nghiên cứu được thực hiện bởi Giassi và cộng sự [6], khi mà các chủng vi khuẩn lactic đạt nồng độ tối đa là 5,46μg/ml. So sánh giữa hai môi trường Nước giá và Nước bắp cải cho thấy, nồng độ IAA của hai chủng L5 và L3 trên môi trường Nước bắp cải cao hơn với Nước giá, khác biệt có ý nghĩa thống kê. Trong khi đó, lượng IAA do L2N sinh ra trên hai loại môi trường tương đương nhau. 3.3. Khả năng phân giải lân Khả năng phân giải lân được so sánh trên 3 loại môi trường nuôi cấy. Lân vô cơ từ Ca3(PO4)2 được vi khuẩn tổng hợp và tiết acid hữu cơ hòa tan sau đó orthophosphate được vi khuẩn sử dụng vì vậy cần theo dõi nồng độ orthophosphate theo thời gian. Kết quả được hiển thị ở hình 3. Ở cả 3 chủng vi khuẩn, khả năng phân giải cao nhất khi các chủng nuôi cấy trên môi trường Nước giá, tương ứng 3 chủng L5, L3 và L2N. Trong môi trường Nước bắp cải, khả năng phân giải lân đứng sau môi trường Nước giá đối với chủng L5 và L2N là 3387,68 ± 179,20 mg/l và 3145,81 ± 435,80 mg/l, tương ứng 74 và 82% giá trị cực đại của chúng trong môi trường Nước giá. Riêng chủng L3, trong môi trường Nước bắp cải, nồng độ PO4 3- cực đại là 2726,29 ± 160,53 mg/l, bằng 73% nồng độ PO4 3- hòa tan trong môi trường Nước giá (3741,20 ± 298,08 mg/l). Như vậy nhìn chung khả năng phân giải lân của các chủng vi khuẩn lactic thí nghiệm nuôi cấy trong môi trường bắp cải bằng 70-80% khả năng này khi nuôi cấy trong môi trường Nước giá. 731 Hình 3. Nồng độ PO4 3- của các chủng vi khuẩn lactic trên từng loại môi trường (A – Chủng vi khuẩn L5; B – Chủng vi khuẩn L3; C – Chủng vi khuẩn L2N) Kết quả phân giải lân của các chủng vi khuẩn L5, L3 và L2N trên cả ba loại môi trường đều cao hơn khi so sánh với nghiên cứu được thực hiện bởi Chen và cộng sự [7], các vi khuẩn thuộc chi Arthrobacter hay Serratia có hoạt tính phân giải Calci phosphate không tan cao nhất chỉ đạt 519 mg/l, trong khi E.coli thể hiện khả năng hoà tan phosphate là 20mg/l. Giassi và cộng sự [6] báo cáo trong số 8 chủng vi khuẩn lactic phân lập được, chỉ có một chủng thể hiện hoạt tính phân giải lân, Kurabet [8] cũng báo cáo kết quả tương tự khi 98 chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nhiều nguồn khác nhau đều không thể hiện hoạt tính. 3.4. Khả năng tạo biofilm Khả năng tạo biofilm gần đây được quan tâm ở vi sinh vật có lợi để ức chế vi sinh vật có hại [3]. Vi sinh vật hỗ trợ tăng trưởng cây trồng nhờ khả năng khả năng tạo biofilm giúp chúng phát triển trên bề mặt hạt giống và là tác nhân bảo vệ bộ rễ cây chống lại các vi sinh vật gây bệnh cũng như các tác nhân bật lợi khác từ môi trường. Sau 24 giờ nuôi cấy, môi trường Nước bắp cải giúp cải thiện khả năng tạo biofilm ở cả 3 chủng vi khuẩn L5, L3 và L2N thể hiện qua giá trị OD 550 nm so với môi trường MRS Broth. Tương ứng với số lượng tế bào tự do trong môi trường của các chủng vi khuẩn lactic khi được nuôi cấy trên 2 môi trường Nước bắp cải thấp hơn so với môi trường MRS Broth, thể hiện qua OD 600 nm. Kết quả được hiển thị ở hình 4. Hình 4. Giá trị OD 550nm và OD 600nm các chủng vi khuẩn trên các loại môi trường khảo sát (P < 0,05, Tukey test) So sánh kết quả OD 600 nm (đánh giá số lượng tế bào sống tự do) và OD 550 nm sau khi nhuộm tím kết tinh (đánh giá số lượng tế bào liên kết) trên hai môi trường Nước giá và Nước bắp cải nhận thấy, số lượng tế bào tự do trong môi trường thấp hơn nhiều so với số lượng tế bào liên kết tạo biofilm. Điều này chứng 732 tỏ phần lớn các tế bào của 3 chủng vi khuẩn trên đã chuyển từ dạng sống tự do trôi nổi sang dạng liên kết tạo biofilm khi được nuôi cấy. Và cũng nhận thấy là chủng vi khuẩn có hoạt tính tổng hợp biofilm mạnh thì số lượng tế bào tự do trong môi trường thấp và ngược lại. Môi trường Nước giá cũng cho kết quả tạo biofilm tốt hơn so với MRS Broth, tuy nhiên chủng vi khuẩn L3 tạo biofilm trên môi trường Nước giá thấp hơn MRS Broth và Nước bắp cải có ý nghĩa thống kê. 3.5. Khả năng kháng nấm Cả ba chủng vi khuẩn trên cả ba loại môi trường đều thể hiện khả năng ức chế Aspergillus sp. CĐP1 vượt trội hơn đối chứng dương là hợp chất hoá học Daconil và sai khác về tỉ lệ ức chế có ý nghĩa thống kê. Cả ba chủng L5, L3, L2N, trên cả hai môi trường là Nước giá và Nước bắp cải đều thể hiện hoạt tính kháng nấm tương đương với môi trường MRS Broth khi xử lý thống kê với độ tin cậy 95% . Kết quả được thể hiện ở bảng 1. Bảng 1. Tỉ lệ kháng nấm (%) Aspergillus sp. CĐP1 của các chủng vi khuẩn lactic Chủng Môi trƣờng L5 L3 L2N MRS Broth 42,61 a ± 1,54 40,15 a ± 1,48 41,38 a ± 2,99 Nước giá 42,86a ± 4,45 43,60a ± 3,79 45,07a ± 4,07 Nước bắp cải 40,89a ± 1,95 41,63a ± 3,39 44,33a ± 1,95 Đối chứng Daconil 26,85b ± 3,91 26,85b ± 3,91 26,85b ± 3,91 (Giá trị trung bình trong cùng một cột có chữ cái khác nhau thì khác biệt nhau về ý nghĩa thống kê với P < 0,05, Tukey test). Phương pháp thử nghiệm dựa trên khả năng ức chế của vi khuẩn sau khi nấm mốc đã phát triển 1 ngày trên đĩa thạch, vì vậy vi khuẩn chỉ thể hiện khả năng ức chế trung bình. Tóm lại dựa vào kết quả khảo sát trên sau 24 giờ nuôi cấy, so với môi trường MRS Broth, mật độ các chủng vi khuẩn lactic khi nuôi cấy đạt xấp xỉ lần lượt 92,67% trên môi trường Nước giá và 91,0% với Nước bắp cải. Tuy ở môi trường Nước giá, khả năng hoà tan phosphate cao hơn so với môi trường Nước bắp cải, nhưng Nước bắp cải lại cho kết quả sinh IAA và tạo biofilm cao hơn. Đồng thời, ở cả ba loại môi trường đều cho tỉ lệ kháng nấm tương đương nhau về ý nghĩa thống kê. Như vậy, môi trường Nước bắp cải có bổ sung bổ sung 12 g/L đường glucose và 15 g/L pepton thể hiện ưu điểm hơn môi trường Nước giá, được chọn thay thế MRS Broth tăng sinh vi khuẩn lactic để xử lý hạt giống. 4. KẾT LUẬN Sau 24 giờ nuôi cấy, so với môi trường MRS Broth, mật độ các chủng vi khuẩn lactic khi nuôi cấy đạt xấp xỉ lần lượt 92,67% trên môi trường Nước giá và 91,0% với Nước bắp cải. Tuy ở môi trường Nước giá, khả năng hoà tan phosphate cao hơn so với môi trường Nước bắp cải, nhưng Nước bắp cải lại cho kết quả sinh IAA và tạo biofilm cao hơn. Đồng thời, ở cả ba loại môi trường đều cho tỉ lệ kháng nấm tương đương nhau khi so sánh thống kê. Chính vì vậy, môi trường Nước bắp cải có bổ sung bổ sung 12g/L đường glucose và 15g/L pepton là loại môi trường thích hợp để thay thế MRS Broth. 733 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Kim, J.D. (2005). Antifungal Activity of Lactic Acid Bacteria Isolated from Kimchi Against Aspergillus fumigatus. Mycobiology, 33 (4), 210-214. [2] Merih, K., Argun, K.S. and Selma, P. (2014). Screening of Lactic Acid Bacteria for Antifungal Activity Against Fungi. Journal of Food Processing and Technology, 5 (3), viewed 25 th September 2018, from: < https://www.omicsonline.org/open-access/screening-of-lactic-acid-bacteria-for- antifungal-activity-against-fungi-2157-7110.1000310.pdf> [3] Piard, J.C. and Briandet, R. (2016). Biotechnology of Lactic Acid Bacteria: Novel Applications, 2nd Edition. John Wiley & Sons, Ltd, pp. 341-361. [4] Mohite, B. (2013). Isolation and Characterization of Indole Acetic Acid (IAA) Producing Bacteria from Rhizospheric Soil and Its Effect on Plant Growth. Journal of soil science and plant nutrition, 13 (3), 638-649. [5] O'Toole, G.A. (2011). Microtiter Dish Biofilm Formation Assay [online], viewed 28th September, 2018, from [6] Giassi, V., Kiritani, C. and Kupper, K.C. (2016). ‗Bacteria as Growth-Promoting Agents for Citrus Rootstocks‘. Microbiological Research, 190, 46-54. [7] Chen, Y.P., Rekha, P.D., Arun, A.B., Shen, F.T., Lai W.A., Young, C.C. (2006). ‗Phosphate Solubilizing Bacteria From Subtropical Soil and Their Tricalcium Phosphate Solubilizing Abilities‘. Applied Soil Ecology, 34 (2006), 33 – 41. [8] Kurabet, B.M. (2012). Isolation and Functional Characterization of Lactic Acid Bacteria from Different Sources. Master‘s Thesis, Deparment of Agriculture Microbiology, University of Agriculture Sciences.