Ứng dụng kỹ thuật fish khảo sát bất thường nhiễm sắc thể 13q14‐34 và 17p13 trên bệnh nhân đa u tủy

Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  174 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT FISH KHẢO SÁT BẤT THƯỜNG   NHIỄM SẮC THỂ 13q14‐34 VÀ 17p13 TRÊN BỆNH NHÂN ĐA U TỦY  Lê Nguyễn Kim Dung*, Suzanne Monivong Cheanh Beaupha**, Phan Thị Xinh**  TÓM TẮT  Mục tiêu: Khảo sát các bất thường nhiễm sắc thể (NST) 13q14 và 17p13 trên bệnh nhân bệnh đa u tủy.   Phương pháp: Ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ phát huỳnh quang (FISH) với 2 loại probe 13q14‐34 và 17p13  để phát hiện những bất thường NST.   Kết quả: Trong 20 bệnh nhân được khảo sát, 11 bệnh nhân (55%) có bất thường nhánh dài NST 13 và 9  trường hợp có bất thường NST 17, trong đó chỉ có 6 bệnh nhân (30%) có bất thường đơn độc của 17p13, còn 3  trường hợp còn lại có bất thường đi kèm với NST 13.  Kết luận: Kỹ thuật FISH với các đoạn dò đặc hiệu giúp phát hiện các bất thường NST 13 và 17 một cách  nhanh chóng, chính xác, giúp thêm dữ liệu cho việc phân nhóm nguy cơ cho bệnh nhân đa u tủy.  Từ khóa: Đa u tủy, bất thường NST 13q, bất thường NST 17.  ABSTRACT  DETECTION OF 13q14‐34 AND 17p13 ABNORMALITIES   IN MULTIPLE MYELOMA PATIENTS USING FISH TECHNIQUE   Le Nguyen Kim Dung, Suzanne Monivong Cheanh Beaupha, Phan Thi Xinh   * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ No 5 ‐ 2013: 175 ‐ 178  Objective:  To  detect  the  abnormalities  of  chromosome  13q14‐34  and  17p13  in  patients with multiple  myeloma.  Methods: The fluorescent in situ hybridization (FISH) technique with two kinds of probe including 13q14‐ 34 and 17p13 was used to detect chromosomal abnormalities.   Results: Among 20 patient samples were analyzed, 11 patients (55%) had deletion of chromosome 13q and  9 patients had abnormalities chromosome 17. Six (30%) out of 9 patients had only abnormalities chromosome 17,  and the remaining 3 out of 9 patients had abnormalities of both chromosome 13 and 17.  Conclusion: The interphase FISH with specific probes can detect the abnormalities chromosome 13 and 17  in  patients  with  multiple  myeloma  quickly,  exactly.  The  result  of  this  study  can  give  more  data  for  risk  classification in multiple myeloma.  Keywords: multiple myeloma (MM), abnormality chromosome 13q, abnormality chromosome 17.  ĐẶT VẤN ĐỀ  Đa u  tủy  là một  rối  loạn  tăng  sinh  ác  tính  dòng  tương  bào  đặc  trưng  bởi  sự  tích  tụ  quá  mức tương bào trong tủy xương, gây thiếu máu,  tăng  protein  đơn  dòng,  hủy  xương,  tăng  calci  máu và suy thận(2). Những nghiên cứu gần đây  cho thấy các bất thường nhiễm sắc thể (NST) và  gen gặp trong khoảng 90% trường hợp đa u tủy  mới chẩn đoán và có giá trị tiên lượng bệnh. Các  bất thường NST gồm có bất thường về số lượng  và  cấu  trúc. Bất  thường  số  lượng NST  thường  gặp  là  trisomy  3,  7,  9,  11,  15  hoặc  17.  Đối  với  nhóm bất thường cấu trúc NST, phần lớn có liên  quan đến gen IgH nằm trên NST 14q32, chuyển  vị  với  các NST  khác  như  4,  6,  11,  16  hoặc  20.  * Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP Hồ Chí Minh  ** Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh  Tác giả liên lạc: TS. BS. Phan Thị Xinh, ĐT: 0932728115, Email: phanthixinh@yahoo.com   Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  175 Ngoài  ra,  còn  có  những  bất  thường  khác  như  mất đoạn NST 1, monosomy hay mất đoạn NST  17p13,  monosomy  13  hoặc  mất  đoạn  kẽ  trên  nhánh  dài NST  13  và  những  bất  thường  liên  quan  đến  gen  MYC(3,4).  Kumar  S  và  cộng  sự  nghiên  cứu  trên  484 bệnh nhân  (BN)  đa u  tủy  mới  chẩn  đoán  cho  thấy  bất  thường NST  13q  chiếm  tỉ  lệ  cao  nhất  là  47%  và  được  xếp  vào  nhóm  tiên  lượng chuẩn. Các bất  thường 17p13,  t(4;14),  t(14;16) và  t(14;20) chiếm  tỉ  lệ 24% được  xếp vào nhóm tiên lượng xấu với thời gian sống  trung  bình  của  nhóm  này  là  3,9  năm  so  với  nhóm tiên lượng chuẩn còn đang lui bệnh tốt (4).  Trong 4 kiểu bất thường thuộc nhóm tiên lượng  xấu thì 17p13 là thường gặp nhất (13%).  Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi ứng  dụng  kỹ  thuật  lai  tại  chỗ  phát  huỳnh  quang  (FISH)  bước  đầu  khảo  sát  2  dạng  bất  thường  NST thường gặp trong 2 nhóm tiên lượng là bất  thường  13q và  17p  trên BN  đa u  tủy  tại Bệnh  viện  Truyền  máu  Huyết  học  (BV.TMHH),  để  góp thêm dữ liệu giúp các bác sĩ lâm sàng phân  nhóm tiên lượng.  ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Đối tượng nghiên cứu  Các BN được chẩn đoán đa u  tủy  theo  tiêu  chuẩn  của  IMWG  (International  Myeloma  Working Group)  tại BV.TMHH Thành phố Hồ  Chí Minh  từ  tháng  01/2013  đến  06/2013  có gởi  mẫu tủy xương khảo sát các bất thường NST.  Phương pháp nghiên cứu  Thiết kế nghiên cứu  Mô tả loạt ca  Phương pháp tiến hành  Thu hoạch trực tiếp 2 ml mẫu tủy xương của  BN đa u  tủy  trong chống đông heparin để  thu  nhận tế bào bạch cầu và cố định tế bào trên tiêu  bản. Tiêu bản có thể sử dụng ngay hoặc lưu trữ  trong 6 tháng.  Hình 1: Cấu trúc đoạn dò 13q14 và 17p13  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  177 Tiến  hành  biến  tính  và  lai  hóa  tiêu  bản  ở  77oC trong 6 phút với các đoạn dò đặc hiệu LSI  ®  D13S319  SpectrumOrange/LSI  13q34  SpectrumGreen Probe (Hình 1A) và LSI ® TP53  SpectrumOrange/CEP 17 SpectrumGreen Probe  (Hình 1B) (Vysis, Hoa Kỳ). Tiếp tục ủ qua đêm ở  37oC trong 18 đến 20 giờ. Sau khi ủ, rửa tiêu bản  để  loại  bỏ  những mẫu  dò  không  bắt  cặp  đặc  hiệu bằng dung dịch 0,4 x SSC / 0,3% NP‐40 ở 73  oC trong 2 phút, và dung dịch 2 x SSC / 0,1% NP‐ 40 ở nhiệt độ phòng  trong 1 phút. Để khô  tiêu  bản và phủ 15μl dung dịch DAPI II counterstain  (Vysis). Phân tích tìm bất thường nhiễm sắc thể  trên 200  tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang  BX51 (Olympus, Nhật Bản).Đoạn dò 13q14.3 trải  dài 135kb gắn chất phát huỳnh quang màu  đỏ  và  đoạn dò 13q34 gắn  chất phát huỳnh quang  màu xanh trải dài 612kb (A). Trong khi đó, trên  NST  17  đoạn  dò  gắn  chất  phát  huỳnh  quang  màu đỏ phủ vùng 17p13.1  trải dài 172kb, đoạn  dò gắn chất phát huỳnh quang màu xanh nằm  tại vùng  tâm của NST 17 dùng  để kiểm  tra  sự  hiện diện của NST 17 (B).  KẾT QUẢ  Trong nghiên cứu này, 20 BN đa u tủy được  khảo  sát bất  thường NST  13q và  17p. Kết quả  được  xác  định  khi  phân  tích  200  tế  bào  dưới  kính hiển vi huỳnh quang. Bất thường NST 13q  có  2  dạng  là  del(13q14)  (Hình  2A)  hoặc  del(13)(q14q34) (Hình 2B) và bất thường NST 17  cũng  có  2  dạng  là  del(17p13)  (Hình  2C)  hoặc  monosomy  17  (Hình  2D). Các  bất  thường  này  được nhận diện dựa vào số lượng tín hiệu xanh  và đỏ trên mỗi tế bào.  Kết quả phân tích cho thấy có 11 BN có bất  thường  13q,  chiếm  tỉ  lệ  55%  và  9  BN  có  bất  thường NST 17, chiếm tỉ lệ 45%. Trong 9 BN có  bất  thường  NST  17  thì  có  3  BN  có  kèm  bất  thường NST 13, như vậy bất thường NST 17 đơn  độc  gặp  trong  6  trường  hợp,  chiếm  tỉ  lệ  30%  (Bảng 1). Ngoài ra, có 1 BN có 4 tín hiệu NST 17  (BN 4) và đây có thể là do đa bội NST. Trong 11  BN có bất thường NST 13 thì có đến 9 BN (9/11 =  81,8%)  là mất  đoạn dài  từ  băng  q14  đến  băng  q34  (Bảng 1),  trường hợp này có  thể được xem  như  là  monosomy13  vì  toàn  bộ  chất  liệu  di  truyền của nhánh dài NST13 đã bị mất.  Hình 2: Bất thường NST 13 có 2 dạng là del(13q14)  (A) và del(13)(q14q34)(B). Bất thường NST 17 cũng  có 2 dạng thường gặp là del(17p13) (C) và  monosomy 17(D).  Bảng 1: Kết quả FISH của bệnh nhân đa u tủy  STT Giới tính Năm sinh Kết quả FISH 13q14 17p13 1 Nữ 1964 del(13)(q14q34) del(17p13) Monosomy 17 2 Nam 1961 del(13)(q14q34) Bình thường 3 Nam 1949 Bình thường del(17pl3) 4 Nữ 1968 del(13)(q14q34) 4 tín hiệu NST 17 5 Nữ 1940 Bình thường del(17p13) 6 Nam 1951 Bình thường del(17p13) 7 Nam 1965 del(13q14) Monosomy 17 8 Nữ 1941 Bình thường del(17p13) 9 Nam 1937 Bình thường Bình thường 10 Nữ 1949 del(13q14) Bình thường 11 Nam 1966 Bình thường Bình thường 12 Nữ 1953 del(13)(q14q34) Bình thường 13 Nam 1967 del(13)(q14q34) Bình thường 14 Nam 1954 del(13)(q14q34) Bình thường 15 Nữ 1960 Bình thường Bình thường 16 Nam 1968 Bình thường Monosomy 17 17 Nữ 1958 del(13)(q14q34) Bình thường 18 Nữ 1944 del(13)(q14q34) Bình thường 19 Nam 1959 Bình thường Monosomy 17 20 Nữ 1938 del(13)(q14q34) Bình thường BÀN LUẬN  Một  số nghiên  cứu  trước  đây  cho  thấy  các  BN đa u  tủy có mất đoạn gen p53  trên NST 17  và chuyển vị của NST 14q32 với NST 4, 16, 20  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Số 5 * 2013 Chuyên Đề Truyền Máu – Huyết Học  178 thuộc nhóm tiên  lượng xấu  (1,4,5). Nhóm BN này  có  thời gian sống  toàn bộ ngắn hơn hẳn so với  nhóm BN mang các bất thường thuộc nhóm tiên  lượng tốt (1). Kết quả khảo sát của chúng tôi cho  thấy có 6 trong 20 BN (30%) có bất thường NST  17 đơn độc, tỷ lệ này cao hơn các nước khác  (4,5)  có thể do cỡ mẫu trong nghiên cứu còn nhỏ. Tuy  nhiên, nhóm BN này nên được điều trị tích cực  và tiến hành ghép tế bào gốc tạo máu.  Trong 20 BN, có 3 BN (15%) không phát hiện  bất  thường NST  13  và  17  và  các  BN  này  nên  được  khảo  sát  các  bất  thường NST  khác  như  t(4;14),  t(6;14),  t(11;14),  t(14;16) và  t(14;20) hoặc  bất thường về số lượng NST bằng kỹ thuật FISH  và NST đồ để phân nhóm tiên lượng. Bệnh nhân  có  bất  thường NST  13  thuộc  nhóm  tiên  lượng  chuẩn chiếm 55% trường hợp, kết quả này cũng  tương đồng với các nghiên cứu khác  (3,6). Trong  11 BN, có 3 BN đồng thời có bất thường của NST  13 và NST 17 nên việc phân nhóm tiên lượng sẽ  khó khăn hơn. Tuy nhiên, Kumar và cộng sự đã  báo cáo về tình trạng có nhiều kiểu bất  thường  NST  trên một bệnh nhân  cho  thấy bất  thường  NST  trong  đa  u  tủy  phức  tạp  và  không  đồng  nhất (4). Hiện nay, có nhiều kiểu bất thường NST  được  phát  hiện  trong  đa  u  tủy  nên  cần  nhiều  loại đoạn dò FISH và phối hợp với kỹ thuật NST  đồ  để  giúp  nhận  diện  đầy  đủ  hơn  các  bất  thường  giúp  phân  nhóm  tiên  lượng  chính  xác  hơn.  KẾT LUẬN  BVTMHH đã xây dựng thành công kỹ thuật  FISH  sử  dụng  các  đoạn  dò  đặc  hiệu  giúp  xác  định các bất  thường NST 13q và 17p một cách  nhanh  chóng,  chính  xác,  trên một  lượng mẫu  nhỏ giúp ích cho việc phân nhóm tiên lượng và  lựa  chọn  phương  pháp  điều  trị  thích  hợp  cho  bệnh nhân đa u tủy.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Drach J, Ackermann J, Fritz E, et al. (1998). Presence of a p53  gene deletion in patients with multiple myeloma predicts for  short survival after conventional‐dose chemotherapy. Blood,  92: 802 – 809.  2. Klein U,  Jauch A, Hielscher  T,  et  al.  (2011). Chromosomal  aberrations +1q21 and del(17p13) predict survival in patients  with recurrent multiple myeloma  treated with  lenalidomide  and dexamethasone. Cancer, 117: 2136 – 2144.  3. Kröger N,  Schilling G,  Einsele H,  et  al.  (2004). Deletion  of  chromosome band 13q14 as detected by fluorescence  in situ  hybridization is a prognostic factor in patients with multiple  myeloma who are receiving allogeneic dose‐reduced stem cell  transplantation. Blood, 103: 4056 – 4061.  4. Kumar S, Fonseca R, Ketterling RP, et al. (2012). Trisomies in  multiple myeloma: impact on survival in patients with high‐ risk cytogenetics. Blood, 119: 2100 – 2105.  5. Neben  K,  Jauch  A,  Bertsch  U,  et  al.  (2010).  Combining  information  regarding  chromosomal  aberrations  t(4;14)  and  del(17p13)  with  the  International  Staging  System  classification  allows  stratification  of  myeloma  patients  undergoing  autologous  stem  cell  transplantation.  Haematologica, 95: 1150 – 1157.  6. Zojer N, Königsberg R, Ackermann J, et al. (2000). Deletion of  13q14 remains an independent adverse prognostic variable in  multiple  myeloma  despite  its  frequent  detection  by  interphase fluorescence in situ hybridization. Blood, 95: 1925  – 1930.  Ngày nhận bài báo: Ngày 30 tháng 7 năm 2013  Ngày phản biện: ngày 28 tháng 9 năm 2013  Ngày bài báo được đăng:   22 tháng 10 năm 2013