Ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang để phát hiện sớm một số bất thường nhiễm sắc thể

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI TẠI CHỖ HUỲNH QUANG ĐỂ PHÁT HIỆN SỚM MỘT SỐ BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ PGS. TS. Trần Thị Thanh HươngĐỀ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP BỘ DTBS: 2,7% tổng số đẻNg/nhân: ĐB gen, ĐB NST...ĐẶT VẤN ĐỀTVDT & CĐTSThu thập mẫu: TB ối, tua rau, máu cuống rốn, sinh thiết thai, TB thai tự do trong máu mẹ...KT phát hiện:DT tế bào: phân tích NST  tiêu chuẩn C§RLNST DT phân tửDT tế bào – phân tửCÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁNTHU THẬP MẪU: Chọc ối Sinh thiết rau Máu cuống rốn Soi phôi thai ADN tự do máu mẹDTTB - phân tích NST băng GDTPT: PCR, Sequencing,Southerblot, Northerblot...DTTB – PT: FISHTiêu chuẩn phát hiện ĐB NSTĐẶT VẤN ĐỀphát hiện BĐ genPhát hiện ĐB NST: SL, RL nhỏCác loại ADN dòTÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU KT FISH THẾ GIỚI1969 bắt đầu, 1980 đầu dò huỳnh quang Thập kỷ 90 ứng dụng rộng rãiPhát hiện trước sinh các RL NST:HC Down, Edward, Patau, Turner...Mất đoạn nhỏ <3MbRL đầu mút & gần đầu mútVIỆT NAM2003 B.V.M.Hoàng-T/p HCM: áp dụng CĐTS2004 BM YSH – DT ĐHYHN: hoàn chỉnh, CĐTS HC Down2007 viện HH-TM: CĐ leceumiaDTTB khó hoặc không thể phát hiệnMỤC TIÊU1Hoàn chỉnh kỹ thuật FISH trên NST ở kỳ giữa và trên nhân tế bào gian kỳ của đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y2Ứng dụng kỹ thuật FISH để phát hiện sớm trước sinh một số bất thường NST 13, 18, 21, X, Y3Ứng dụng kỹ thuật FISH để phát hiện một số rối loạn cấu trúc NST liên quan NST 21, NST XĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUMục tiêu 1Đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y: + 3 mẫu ối: 15-18w + 3 mẫu ối: 28-32wĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨUMục tiêu 2Mục tiêu 3Đầu dò ADN TelXp/Yp & TelXq/Yq: 3 mẫu ối: 15-18w73 thai phụ Dị dạng chi, nội quanSiêu âm (+): Nang BH Dày da gáy Triple test (+) hoặc (-)Cần KQ FISH  đối chiếu:+ 2 bệnh nhân: RLCT NST 21, X+ 1 mẫu ối RLCT NST 13Cần KQ FISH chẩn đoán: + 2 bệnh nhân: NST marker + 1 trẻ nam 46,XXLấy mẫu – làm tiêu bản nhân TB gian kỳLấy mẫu - Nuôi cấy – Làm tiêu bản NST kỳ giữaQUY TRÌNH THỰC HIỆN KT FISH (Vysis)Biến tính ADNLai ADN dò và ADN đíchNhuộm mẫu lai bằng thuốc nhuộm huỳnh quangPhân tích tín hiệu lai dưới KHV huỳnh quang(50 nhân gian kỳ/mẫu - 20 cụm kỳ giữa/mẫu) 1. Làm tiêu bản TB ối ở gian kỳ hoặc nuụi cấy làm tiêu bản NST kỳ giữa2. Biến tính ADN dò và ADN đích của mẫu XN3. Lai ADN dò với ADN đích của thai (20-24h)5. Phân tích dưới KHV huỳnh quang tìm tín hiệu lai  Kết quả sau 2-3 ngày4. Nhuộm mẫu lai bằng thuốc nhuộm huỳnh quangQUY TRÌNH THỰC HIỆN KT FISH (Vysis)Đầu dò ADN 13, 18, 21, X, YCÁC ĐẦU DÒ ADN VÀ PHIN LỌC TƯƠNG ỨNGPhin lọc AquaPhin lọc orangePhin lọc orangePhin lọc greenPhin lọc greenĐầu dò ADN Tel Xp/Yp(TTAGGG)nTelomereADNĐầu dò ADN TelXpPhin lọc green1Không đánh giá vì hai tế bào chồng lên nhau2Đếm là 2 tín hiệu lai, 1 tín hiệu bị khuếch tán3Không đánh giá vì các tế bào chồng lên nhau4Đếm là 2 tín hiệu lai, 1 tín hiệu bị chia nhỏ5Đếm là 3 tín hiệu lai6Đếm là 4 tín hiệu lai7Đếm là 3 tín hiệu lai, 1 tín hiệu bị chia nhỏBẢNG ĐÁNH GIÁ TÍN HIỆU LAI (VYSIS)Tư vấn DT – Theo dõi QT mang thai, sau sinhXN: DTTB – phân tích NST KT FISHTV di truyền – Sản khoaChọc ối – CĐ trước sinhSƠ ĐỒ ÁP DỤNG KỸ THUẬT FISH TRONG CĐTSLÀM HỒ SƠXĐ thai phụ nguy cơ caosinh con bất thường NSTThai phụ  35 tuổiTS sinh con DT XN triple testAFP, HCG, uE3Siêu âm KẾT QUẢ & BÀN LUẬNHOÀN CHỈNH KỸ THUẬT FISHỨNG DỤNG KỸ THUẬT FISH TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH MỘT SỐ BẤT THƯỜNG NSTỨNG DỤNG KỸ THUẬT FISH TRONG CHẨN ĐOÁN MỘT SỐ RỐI LOẠN NSTBảng 1. Kết quả hoàn chỉnh kỹ thuật FISH với đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y trên nhân gian kỳMẫuTuÇn thaiKẾT QUẢ FISH (sè tÝn hiÖu lai)KÕt qu¶DTTBNST 13NST 18NST 21NST XNST Y1152222046, XX2182221146,XY 3182221146,XY4282322047, XX +185302231147,XY,+216322221146, XY1. HOÀN CHỈNH KỸ THUẬT FISHHOÀN CHỈNH CÁC NỘI DUNGThể tích dịch ối: Thai 15-18w: 5mlThai 28-32w: 10mlXử lý nhân TBLoại trừ máu mẹ (nếu lẫn)Trypsin 0,25% trong 15 – 25’ tuỳ thuộc tuần thaiBiến tính ADN: 730C x 3’Lai ADN dò và ADN đích: thể tích vùng lai giảm từ 22x22mm xuống 10x10mmThời gian lai 20-22hPhân tích tín hiệu laiTín hiệu lai thật: phát sóng ở bước sóng đặc hiệu & kích thước ổn địnhTín hiệu lai giả: phát sáng dưới nhiều phin lọc, kích thước không ổn địnhKết quả FISH trên nhân tế bào gian kỳ của đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y và karyotyp của thai nam bình thườngĐầu dò ADN 13, 21NST 21NST 21NST 13NST 13Đầu dò ADN 18, X, YNST 18NST 18NST XNST YTRƯỚC SINHĐầu dò ADN 13, 21NST 21NST 21NST 13NST 13Đầu dò ADN 18, X, YNST XNST XNST 18NST 18Kết quả FISH trên nhân tế bào gian kỳ của đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y và karyotyp của thai nữ bình thườngBảng 2. Kết quả hoàn chỉnh kỹ thuật FISH  với các đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y và  Tel Xp/Yp; Tel Xq/Yq trên NST kỳ giữaKý hiÖu mÉuTuÇn thaiKÕt quả FISH (sè tÝn hiÖu lai)KÕt quả di truyÒn tÕ bµoĐÇu dß 13, 18, 21, X, YĐÇu dßTel Xp/YpĐÇu dßTel Xq/YqNST 13NST 18NST 21NST XNST YXpYpXqYq11522220202046, XX21522211111146, XY31822211111146, XYHOÀN CHỈNH CÁC NỘI DUNGThu hoạch TB kỳ giữa: colcemid, KCl/huyÕt thanh, carnoy...Phun tiêu bản: lam lạnh kèm kéo dài khử nước bằng cồn 70%/2’, 80%/2’, 100%/2’.Biến tính ADN: 730C x 5’Lai ADN dò và ADN đích: thể tích vùng lai giảm từ 22x22mm xuống 10x10mmThời gian lai 420C: 20-22h (13, 18, 21, X, Y) 22-24h (TelXp/Yp; TelXq/Yq)Phân tích tín hiệu lai: tín hiệu lai nằm trên NST  đánh giá dễ hơn nhân gian kỳĐầu dò Telq/Yq trên NST kỳ giữa của thai nam bình thường TelYqTelXqĐầu dò TelXp/Yp trên NST kỳ giữa của thai nam bình thường TelXp TelYp2. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT FISH TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH MỘT SỐ BẤT THƯỜNG NSTKết quả chẩn đoán trước sinh một số bất thường NSTKết quả chẩn đoán trước sinh hội chứng TurnerĐối chiếu kết quả siêu âm – FISH – DTTB trong hội chứng TurnerSè l­îng mÉuKÕt quả siªu ©mFISH(sè tÝn hiÖu lai trªn NST)Di truyÒn tÕ bµo131821XY4NBH ®¬n thuÇn2221045, X19NBH, phï toµn th©n, dÊu hiÖu bÊt th­êng kh¸c2221045, X1Kh«ng cã NBH, ch©n tay ng¾n, TDMP2221045, X1NBH, phï toµn TDMP, TDMB2221 (92%)2 (8%)045, X (92%)/ 46,XX (8%)Kết quả FISH trên nhân TB gian kỳ và karyotyp của thai hội chứng Turner NST XNST 18 NST 18 Sơ đồ đối chiếu kết quả siêu âm nang bạch huyết với các bất thường NSTKết quả chẩn đoán trước sinh hội chứng DownĐối chiếu kết quả siêu âm – FISH – DTTB trong hội chứng DownSè l­îng mÉuKÕt quả siªu ©mFISH(sè tÝn hiÖu lai trªn NST)Di truyÒn tÕ bµo131821XY5Dµy da g¸y ®¬n thuÇn 2231147, XY + 21 (3 mÉu)2232047, XX + 21 (2 mÉu)2Dµy da g¸y, trµn dÞch mµng phæi, mµng bông2232047, XX + 212Nang b¹ch huyÕt2231147, XY + 21Kết quả FISH trên nhân TB gian kỳ và karyotyp của thai hội chứng DownNST 13NST 13NST 21NST21NST 21Kết quả sàng lọc huyết thanh mẹ của thai hội chứng DownMoMThaiKết quả chẩn đoán trước sinh hội chứng EdwardĐối chiếu kết quả siêu âm – FISH – DTTB trong h/c EdwardSè l­îngmÉuKÕt quả siªu ©mFISH(số tÝn hiÖu lai trên NST)Di truyÒn tÕ bµo131821XY21Nang b¹ch huyÕtNang b¹ch huyÕt223322121047, XY, +1847, XX, +1811Dµy da g¸yDµy da g¸y223322121047, XY, +1847, XX, +181Héi chøng Dandy Walker, dÞ d¹ng tim, ch©n tay vÑo2321147, XY, +181Ch©n tay vÑo, søt m«i hë hµm2321147, XY, +18Kết quả FISH trên nhân TB gian kỳ và karyotyp của thai hội chứng EdwardNST XNST XNST 18NST 18Kết quả sàng lọc huyết thanh mẹ của thai hội chứng Edward3. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT FISH TRONG CHẨN ĐOÁN MỘT SỐ RỐI LOẠN NSTBệnh nhân B.T.H. 24 tuổi Biểu hiện LS: HC Turner Karyotyp 46,X, i(Xq)Kết quả FISH trên cụm NST kỳ giữa với đầu dò ADN Xq/YqNST isoXq NST XThai phụ Đ.T.T.H, 32 tuổiTS sinh con DownKaryotyp: 45,XX,t(14;21)Kết quả FISH trên cụm NST kỳ giữa với đầu dò ADN 13, 21NST t(13;13)NST 13NST 21NST 21Bệnh nhân T.T.M.H, 12 tuổiBiểu hiện LS: HC DownKaryotyp: 46,XX,idic(21)(pterq22.3::q22.3pter)Kết quả FISH trên cụm NST kỳ giữa với đầu dò ADN 13, 21NST idic(21)(pterq22.3::q22.3pter)NST 13NST 13NST 21Bệnh nhân L.H.N, 22 tuổiBiểu hiện LS: vô kinh I, lùnKaryotyp: 46,X,del(Xq),del(telXp)Kết quả FISH trên cụm NST kỳ giữa với đầu dò ADN 18, X, YNST del(Xq),del(telXp)NST 18NST 18NST XKết quả FISH trên cụm NST kỳ giữa với đầu dò ADN TelXp/YpTel XpTrẻ nam, karyotyp 46,XXKết quả PCR: gen TDF (+)Kết quả FISH trên cụm NST kỳ giữa với đầu dò ADN 18, X, YNST Y NST X NST 18 KẾT LUẬN1. HOÀN CHỈNH KỸ THUẬT FISH* Đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y ở nhân gian kỳ:- Thể tích dịch ối: thai 15-18w: 5ml, thai 28-32w:10mlBiến tính AND: 730C/3phútLai: 420C/20h. Giảm diện tích vùng lai xuống 10 x 10mm. * Đầu dò ADN 13, 18, 21, X, Y và Tel Xp/Yp; Xq/Yq ở kỳ giữa: - Lam lạnh kết hợp khử nước alcol 70%, 80%, 100% (2 phút/bước)  NST phân tán tốt, tín hiệu lai rõ. - Đầu dò Tel Xp/Yp và Tel Xq/Yq: biến tính 730C/5phút; lai 420C/24h )3. ỨNG DỤNG KT FISH ĐỂ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ RLNST MÀ DTTB KHÓ HOẶC KHÔNG PHÁT HIỆN ĐƯỢC* KHẲNG ĐỊNH KẾT QUẢ CỦA DTTB: - 46, X,I(XQ). - 46,XX,T(13Q;13Q). - 45,XX,T(14Q;21Q).* XÁC ĐỊNH CÁC RỐI LOẠN DI TRUYỀN MÀ DI TRUYỀN TẾ BÀO KHÓ HOẶC KHÔNG CÓ KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN: - 46, X, DEL(XQ), DEL(TEL XP). - 46,XX,IDIC(21)(PTERQ22.3::Q22.3 PTER). - TRẺ NAM 46,XX, TDF (+). KẾT QUẢ FISH PHÙ HỢP VỚI KỸ THUẬT PCR2. ¸p dông kü thuËt FISH c®ts mét sè bÊt th­êng NST - §Çu dß 13, 18, 21, X, Y ë 73 thai phô cã nguy c¬ cao ph¸t hiÖn:  25 Turner; 9 thai Down; 7 thai Edward; 1 thai Patau.- KÕt qu¶ FISH phï hîp víi di truyÒn tÕ bµo 100%.NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI1. Khẳng định giá trị của KT FISH phát hiện đúng và sớm một số RLNST trong CĐTS.2. Đã hợp tác với BV PSTW, BV PSHN, khoa Sản BV BM ứng dụng KT DTTB và KT FISH trong CĐTS , tư vấn DT nhằm giảm tỷ lệ sinh con dị tật.3. áp dụng KT FISH phát hiện một số RLVCDT mà DTTB - phân tích NST khó hoặc không phát hiện được.ĐỀ XUẤTCần triển khai sàng lọc và chẩn đoán trước sinh các DTBS ở cộng đồng.Trong CDTS cần kết hợp giữa DTTB - phân tích NST, KT FISH và KT DT phân tử để phát hiện các thai bị RL VCDT, làm cơ sở cho TVDT nhằm giảm tỷ lệ sinh con dị tật.XIN TRÂN TRỌNG CẢM ƠN