Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để xác định giới hạn vi sinh vật trong dược phẩm

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 202 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR ĐỂ XÁC ĐỊNH GIỚI HẠN VI SINH VẬT TRONG DƯỢC PHẨM Trương Ngọc Lan**, Nguyễn Thanh Thuận*, Vũ Thanh Thảo*, Nguyễn Văn Thanh*, Trần Cát Đông* TÓM TẮT Mở đầu: Dược phẩm cần phải đạt các tiêu chuẩn an toàn cao để không gây nguy hiểm cho người bệnh. Một trong các yếu tố nguy cơ là sự nhiễm các vi sinh vật. Thời gian xác định giới hạn vi sinh vật theo phương pháp truyền thống là từ 5 đến 7 ngày. Kỹ thuật RT-PCR cho phép xác định nhanh giới hạn nhiễm khuẩn trong dược phẩm. Mục tiêu: Xây dựng phương pháp RT-PCR để xác định nhanh giới hạn vi sinh vật trong các mẫu dược phẩm. Phương pháp: Dựa trên phương pháp PCR, tiến hành khảo sát các điều kiện tối ưu, độ đặc hiệu và độ nhạy của các cặp cặp mồi chung và mồi đặc hiệu, khảo sát thời gian tăng sinh thích hợp để phát hiện từng loại vi sinh vật. Sau đó kiểm tra các thông số tối ưu bằng phản ứng RT-PCR. Kết quả: Xác định được nhiệt độ gắn mồi, nồng độ Mg2+ cho các cặp mồi. Các cặp mồi đều đạt độ đặc hiệu để phát hiện vi khuẩn, vi nấm và vi sinh vật chỉ thị và có giới hạn phát hiện tốt. Phương pháp RT-PCR rút ngắn thời gian của kiểm tra giới hạn nhiễm vi sinh vật khoảng 5 lần so với phương pháp Dược điển. Kết luận: Phương pháp RT-PCR thích hợp để xác định nhanh giới hạn nhiễm khuẩn trong dược phẩm. Từ khóa: Kỹ thuật PCR, thử giới hạn vi sinh vật, kiểm nghiệm dược phẩm, phương pháp nhanh. ABSTRACT APPLICATION OF RT-PCR TECHNIQUE FOR DETERMINATION OF MICROBIAL LIMIT TEST OF PHARMACEUTICALS Truong Ngoc Lan, Nguyen Thanh Thuan, Vu Thanh Thao, Nguyen Van Thanh, Tran Cat Dong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 202 - 210 Background: Microbial contamination in pharmaceutical products is one of the major causes of health risk to consumers. Vietnamese Pharmacopoeia microbial limit test requires 5 - 7 days. RT-PCR detection of microorganisms is a rapid, sensitive, and infallible method. Objectives: To develop a convenient, reproducible and rapid test for microbial limit of pharmaceutical products. Methods: Base on PCR method, annealing temperature, Mg2+ concentration, sensitivity and specificity of the universal and specific primers, proliferating time for microorganisms were optimized. After that, the optimal conditions were applied to RT-PCR ( Reverse Transcriptase PCR) assay. Results: The annealing temperature, Mg2+ concentration of primer pairs were determined. All primers are specific to detect bacteria, fungi and indicative microorganisms and have good detection limits. RT-PCR analysis can be used for microbial limit determination 5 times faster than the standard method. Conclusions: RT-PCR is a suitable method for rapid and reliable detection of microbes pharmaceutical samples. Keywords: PCR, microbial limit test, pharmaceutical quality control, rapid method. *Khoa Dược, Đại học Y Dược TP.HCM ** Trung tâm Y tế dự phòng tỉnh Bình Dương Tác giả liên lạc: PGS. TS Trần Cát Đông ĐT: 08. 38295641 – 127 Email: trancdong@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 203 ĐẶT VẤN ĐỀ Dược phẩm là chế phẩm dùng để phòng và điều trị bệnh, do đó cần phải đạt các tiêu chuẩn an toàn cao để không gây nguy hiểm cho người bệnh. Một trong các yếu tố nguy cơ là sự nhiễm các vi sinh vật, các vi sinh vật này có thể gây bệnh trực tiếp hoặc gián tiếp làm hỏng dạng bào chế, làm cho chế phẩm không chỉ mất đặc điểm cảm quan mà còn mất tác dụng điều trị. Dược điển Việt Nam quy định các dạng thuốc dùng đường uống không chứa chất bảo quản phải đạt các giới hạn về độ nhiễm khuẩn, việc xác định giới hạn vi sinh vật được thực hiện theo phương pháp tăng sinh, và nuôi cấy trên môi trường chọn lọc(1), tuy nhiên thời gian để có kết quả một mẫu kiểm nghiệm là từ 5 đến 7 ngày, nếu mẫu không đạt chúng ta phải lặp lại một lần nữa, chưa kể đến phân lập vi khuẩn gây bệnh. Phương pháp này ngoài tốn kém thời gian, kết quả còn phụ thuộc rất nhiều vào kỹ thuật viên kiểm nghiệm, thuốc sẽ lưu lại kho lâu hơn, gây tốn kém, tăng chi phí sản xuất, tăng giá thành. Trong khi hầu hết tuổi thọ các thuốc dùng đường uống ngắn (12 đến 24 tháng). Gần đây, các nước tiên tiến trên thế giới đã bắt đầu áp dụng các phương pháp xác định nhanh giới hạn vi sinh vật trong quá trình kiểm tra để xuất xưởng. Các phương pháp này có độ nhạy cao và được chứng minh là tương đương với các phương pháp truyền thống, với phương pháp này có thể giúp tự động hóa một phần và cho kết quả khách quan hơn. Kỹ thuật RT-PCR cho phép xác định nhanh và chính xác, do đó có thể ứng dụng để xác định số lượng vi sinh vật trên cơ sở mỗi vi sinh vật mang số bản sao biết trước của khuôn mẫu. Hiện nay, kỹ thuật RT-PCR đã khá phổ biến ở nước ta và ngày càng được ứng dụng nhiều trong chẩn đoán, xét nghiệm. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Các chủng vi sinh vật Các chủng vi sinh vật sử dụng gồm các chủng chuẩn của ATCC và các chủng được phân lập và giữ tại Bộ môn Vi sinh - Ký sinh: Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 43300, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Salmonella typhi, Streptococcus feacalis ATCC 29213, Bacillus subtilis PY 79, Bacillus cereus, Shigella sp., Klebsiella sp., Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus niger ATCC 16404 và Monascus purpureus. Tách chiết ADN, ARN ADN vi khuẩn được tách chiết bằng phương pháp phenol–chloroform. Để phá vỡ tế bào, dùng đệm ly giải BLB (EDTA 50mM, NaCl 0,1M, pH 7,5) và lysozyme đối với vi khuẩn Gram dương và dùng SDS 10% đối với vi khuẩn Gram âm. ADN nấm men được chiết theo phương pháp của Harju(4), ADN nấm mốc được chiết theo phương pháp của Vanittanakom(2,8) ARN vi sinh vật được tách chiết và tinh sạch bằng kit SV total RNA isolation system (Promega) khi đo OD600 của dịch nuôi cấy đạt 0,6-1. Phản ứng PCR Mồi sử dụng trong phản ứng PCR được chọn theo hai hướng: mồi đa năng phát hiện tất cả vi sinh vật và mồi chuyên biệt phát hiện nhóm vi sinh vật chỉ thị như: E. coli, Staphylococcus sp., Salmonella sp., P. aeruginosa. Trình tự của các mồi được liệt kê trong Bảng 1. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 204 Các phản ứng PCR được thực hiện riêng rẽ để tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi và nồng độ Mg2+. PCR được thực hiện với tổng thể tích là 25 μl gồm 1μM/mồi (Sigma Proligo); 1U Taq polymerase (Promega); 0,25 mM dNTP (BioLabs); 1X PCR buffer (Promega). Mg2+ được thăm dò ở các thông số khác nhau từ 1 – 5 mM. Chu trình phản ứng là 1 chu kỳ: 95oC trong 5 phút; 35 chu kỳ: 95oC trong 1 phút, thời gian gắn mồi là 1 phút với các nhiệt độ khác nhau cho từng loại mồi, 72oC trong 2 phút và cuối cùng là 1 chu kỳ ở 72oC trong 5 phút. Bảng 1. Mồi sử dụng trong phản ứng PCR Vi sinh vật chỉ thị- gen đích Mồi Trình tự Sản phẩm (bp) p8FPL-UF AGTTTGATCCTGGCTCAG Vi khuẩn-16S rADN [8] p806R-UR GGACTACCAGGGTATCTAAT 798 U340-UF TCCTACGGGAGGCAGCAGT Vi khuẩn-16S rADN [6] U806-UR GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT 466 RRF1-UF ATCTAAATCCCTTAACGAGGAACA Vi nấm-18S rADN [8] RRH1-UR CCGTCAATTTCTTTAAGTTTCAGCCTT 631 SSU-0817-UF TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA Vi nấm- 18S rADN [3] SSU196-UR TCTGGACCTGGTGAGTTTCC 422 UAL 754 AAAACGGCAAAGAAAAAGCAG E. coli-uidA [7] UAR 900 ACGCGTGGTTACAGTCTTGCG 147 Pseud-oprLR ATGGAAATGCTGAAATTCGGC P. aeruginosa- oprL [5] Pseud-oprLR CTTCTTCAGCTCGACGCGACG 504 Sal-Malo2-F GTATTGTTGATTAATGAGATCCG Salmonella- invA [6] Sal-Malo2-Ra ATATTACGCACGGAAACACGTT 373 STAIb-F GGAATAACGTGACATATTGTA Sta. sp-16S rADN [9] STAIib-R TTCACTCGGTTTTGCTTGG 300 Phản ứng RT-PCR Phản ứng PCR ngược (reverse transcriptase PCR - RT-PCR) được thực hiện với kit Ready-To- Go RT-PCR Beads (GE Healthcare) và các mồi như trên. ARN được chuyển thành cADN ở nhiệt độ 42oC trong 15 phút sau đó các chu kỳ phản ứng tiến hành như đối với PCR. Độ nhạy của phản ứng PCR Dung dịch ADN đích đã biết được số bản sao được pha loãng liên tiếp sao cho trong 10 µl khuôn mẫu có chứa 2x107 bản sao đến 2 bản sao đối với vi khuẩn và 107 đến 1 bản sao đối với vi nấm tương ứng với nồng độ ADN đích từ 100 ng, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg và 1 fg trên 10 µl để khảo sát độ nhạy của phản ứng PCR. Cách quy đổi số bản sao như sau với nồng độ ADN như sau: 100 fg ADN tương đương với 22 bản sao bộ gen vi khuẩn hoặc 10 bản sao bộ gen vi nấm. Các thông số phản ứng như đã được thiết lập ở trên. Độ nhạy được xác định là số lượng bản sao của ADN đích thấp nhất vẫn cho sản phẩm khi thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi tương ứng. Thời gian tăng sinh để phát hiện các vi sinh vật Khảo sát thời gian tăng sinh cần thiết sẽ giúp làm giàu số lượng vi sinh vật trong mẫu lên đến ngưỡng phát hiện của phương pháp PCR. Để Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 205 khảo sát thời gian tăng sinh phát hiện vi sinh vật trong các mẫu dược phẩm, tiến hành gây nhiễm vi khuẩn chỉ thị, nấm men, nấm mốc vào thuốc tiêm lidocain 2% với lượng vi sinh vật gây nhiễm lần lượt từ 100 - 105 CFU/ml. Sau đó, các mẫu thuốc tiêm đã được gây nhiễm được tăng sinh trong các môi trường thích hợp với từng đối tượng (môi trường TSB đối với vi khuẩn, PDP đối với nấm mốc và YPD đối với nấm men). Sau khi tăng sinh, tiến hành chiết ADN ở các mốc thời gian 6, 9 và 12 giờ (đối với vi khuẩn và nấm men) và 24, 48 và 60 giờ (đối với nấm mốc) và thực hiện phản ứng PCR theo điều kiện tối ưu trên đối với từng loại vi sinh vật. Phát hiện sản phẩm PCR Sản phẩm PCR được chạy điện di trên gel agarose 1% ở điện thế 120V trong 20 phút, đọc kết quả bằng phương pháp nhuộm ethidium bromide. Sản phẩm điện di được chụp hình bằng máy Dolphin (Wealtec Corp.). KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Chiết tách ADN, ARN Sản phẩm ADN, ARN chiết được có tỉ lệ OD260/OD280 nằm trong khoảng từ 1,8 đến 2, đảm bảo hàm lượng và độ tinh sạch để thực hiện phản ứng PCR. Khi chiết ADN, ARN của Aspergilus niger thì không loại được sắc tố đen trong phần dịch nổi, tuy nhiên, kết quả này không ảnh hưởng khi thực hiện phản ứng PCR và RT-PCR. Phản ứng PCR Thực hiện phản ứng PCR với từng cặp mồi với nhiệt độ gắn mồi và nồng độ Mg2+ theo tài liệu tham khảo. Đối với các cặp mồi có nhiệt độ và nồng độ Mg2+ phù hợp với tài liệu cho sản phẩm PCR rõ và đúng kích thước chúng tôi không tiến hành khảo sát lại. Với các cặp mồi không cho sản phẩm PCR hoặc vạch sản phẩm không rõ chúng tôi tiến hành khảo sát lại nhiệt độ gắn mồi và nồng độ Mg2+ tối ưu. Kết quả khảo sát nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho từng cặp mồi như trong Bảng 2. Bảng 2. Nhiệt độ gắn mồi và nồng độ Mg2+ tối ưu Nhiệt độ bắt cặp Nồng độ Mg2+ Vi sinh vật Mồi Theo tài liệu Thực nghiệm Theo tài liệu Thực nghiệm Vi khuẩn U340-UF/U806-UR 58 58 2 2 Vi khuẩn P8FPL-UF/p806R-UR 55 55 2 2 Vi nấm RRF1-UF/RRH1-UF 56 53 2,5 2,5 Vi nấm SSU-0817-UF/SSU-1196-UR 56 52 2,5 2,5 P. aeruginosa Pseud-oprLF/Pseud-oprLR 58 64 1,5 2 Salmonella Sal-Malo2-F/Sal-Malo2-Ra 55 55 1,5 3,5 S. aureus STAIb-F/STAIib-R 46 50 3 3 E. coli UAL 754/UAR 900 (*) 50 1,5 2 (*): tài liệu không đề cập Tính đặc hiệu của các cặp mồi Các vi sinh vật gồm: Bacillus subtilis (Bs), Bacillus cereus (Bc), E. coli (Ec), Klebsiella (Kle), Pseudomonas aeruginosa (Pse), Salmonella sp (Sal), Shigella (Shi), Staphylococcus aureus (St), Streptococcus feacalis (Stre), Candida albicans (Ca), Aspergillus (As), Monascus purpureus (Mo). Mồi chung để phát hiện vi khuẩn, vi nấm Cặp mồi p8FPL-UF/p806R-UR cho vạch sản phẩm có kích thước 798 bp, cặp mồi U340- UF/U806-UR cũng có sản phẩm PCR có kích thước 466 bp trên vi khuẩn mà không có sản phẩm PCR trên vi nấm thử nghiệm. Cặp mồi Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 206 SSU-0817-UF/SSU-1196-UR cho vạch sản phẩm có kích thước 422 bp, tương tự, cặp mồi RRF1- UF/RRH1-UF cũng có sản phẩm PCR kích thước 631 bp trên vi nấm mà không xuất hiện vạch sản phẩm trên vi khuẩn thử nghiệm tính đặc hiệu. Vậy các cặp mồi chung khảo sát là đặc hiệu để phát hiện vi khuẩn hoặc vi nấm (Hình 1). Mồi phát hiện các vi sinh vật chỉ thị Phản ứng PCR chỉ cho sản phẩm trên vi khuẩn chỉ thị tương ứng với từng cặp mồi: cặp mồi Pseud-oprLF/Pseud-oprLR cho vạch sản phẩm có kích thước 504 bp trên P. aeruginosa, cặp mồi Sal-Malo2-F/Sal-Malo2-R cho sản phẩm có kích thước 373 bp trên Salmonella sp, UAL- 754/UAR-900 cho sản phẩm có kích thước 147 bp trên E. coli và STAIb-F/STAIib-R cho sản phẩm có kích thước 300 bp trên S. aureus và không cho sản phẩm PCR trên các vi khuẩn, vi nấm chứng âm. Như vậy các cặp mồi đã chọn đều đạt yêu cầu về tính đặc hiệu PCR (Hình 2). M Ca As Mo Ec Kle Ps Sa Shi Sta Bs Stre 422bp Bs M Ca As Mo Ec Kle Ps Sal Shi Sta 631bpp Stre 798bp Shi Bc As Str Bc Ca Sta Sa Ps Kle Ec Bs M Mo Shi Bc Str Ca As Mo Sta Sh Sa Ps Kle Ec Bs M 466bp SSU-0817-UF/SSU-1196-UR RRF1-UF/RRH1-UF p8FPL-UF/p806R-UR U340-UF/U806-UR Hình 1. Tính đặc hiệu của mồi chung phát hiện vi nấm và vi khuẩn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 207 As Ca Sh Stre M Sal Kl St Ec Bs Ps Mo M St Ec Bs Kl Sal Stre Ps Sh MoCa As M Sta Ec Bs Kl Sal Stre Ps Shi MoCa As M Ec Mo Ps Sta Bs Kl Sal Stre Sh Ca As UAL754/UAR900 373bp Sal-Malo2-F/Sal-Malo2-RaPseud-oprLF/Pseud-oprLR STAIb-F/STAIibR 300bp 147bp 504bp Hình 2. Độ đặc hiệu trên các vi sinh vật chỉ thị Độ nhạy của phản ứng PCR Dãy nồng độ ADN, số bản sao bộ gen vi khuẩn và vi nấm như Bảng 3. Kết quả PCR cho thấy trên cả hai cặp mồi chung phát hiện vi khuẩn có giới hạn phát hiện tương đương nhau là 10fg ADN tương ứng với 2 bản sao của vi khuẩn. Đối với hai cặp mồi phát hiện vi nấm cặp mồi SSU-0817- UF/SSU-1196-UR có giới hạn phát hiện là 100fg ADN tương ứng với 10 bản sao của vi nấm, nhạy hơn cặp mồi RRF1-UF/RRH1-UR có giới hạn phát hiện là 1pg ADN tương đương 100 bản sao (Hình 3). Vậy cặp mồi SSU-0817- UF/SSU-1196-UR thích hợp cho các thử nghiệm về vi nấm trên mẫu dược phẩm. Bảng 3. Nồng độ ADN và số bản sao bộ gen Giếng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ADN 100ng 10ng 1ng 100pg 10pg 1pg 100fg 10fg 1fg 0 Số vi khuẩn 2.107 2.106 2.105 2.104 2.103 2.102 2.10 2 0,2 0 Số vi nấm 107 106 105 104 103 102 10 1 0,1 0 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 208 M 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 422bp M 109 8 7 6 5 4 3 2 1 631bp M 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 798bp 466bp M 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 SSU-0817-UF/SSU-1196-UR RRF1-UF/RRH1-UF p8FPL-UF/p806R-UR U340-UF/U806-UR Hình 3. Giới hạn phát hiện của mồi chung phát hiện vi khuẩn và vi nấm 3 4 2 7 8 M M M 1 1 2 2 3 4 4 5 5 5 6 6 6 7 7 8 M 5 6 9 10 1 2 3 4 7 8 8 9 9 10 10 10 300bp STAIb-F/STAIib-R 147bp UAL 754/UAR-900 373bp Sal-Malo2-F/Sal-Malo2-Ra 504bp Pseud-oprLF/Pseud-oprLR 3 1 9 Hình 4. Giới hạn phát hiện của các cặp mồi trên các vi sinh vật chỉ thị Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 209 Cặp mồi Sal-Malo2-F/Sal-Malo2-F phát hiện Salmonella có giới hạn phát hiện ở nồng độ ADN 10fg tương đương 2 bản sao, cặp mồi Pseud- oprLF/Pseud-oprLR phát hiện P. aeruginosa có giới hạn phát hiện là 2pg tương dương với 200 bản sao, cặp mồi UAL 754/UAR900 phát hiện E. coli có giới hạn phát hiện là 20pg tương dương với 2.103 bản sao và cặp mồi STAIb-F/STAIib-R phát hiện S. aureus có giới hạn phát hiện là 200pg tương dương với 2.104 bản sao (Hình 3). Như vậy, các mồi phát hiện Salmonella, P. aeruginosa, vi khuẩn, vi nấm đều cho kết quả tốt, các mồi E. coli, S. aureus có giới hạn phát hiện khá cao: 2.103, 2.104 tế bào/phản ứng. So với tiêu chuẩn Dược điển yêu cầu phát hiện được một vi khuẩn trong mẫu thì các cặp mồi trên không đạt. Tuy nhiên, khi tiến hành thực nghiệm trên mẫu thuốc, việc chiết được hoàn toàn ADN trong mẫu không thể đạt được, thông thường chỉ sử dụng một lượng nhỏ đem tăng sinh trước khi chiết ADN. Sau khi tăng sinh lượng vi sinh vật sẽ đạt ngưỡng giới hạn của tất cả các cặp mồi. Thời gian tăng sinh để phát hiện vi sinh vật Kết quả thử nghiệm về thời gian tăng sinh để phát hiện các vi sinh vật cho thấy: E. coli, P. aeruginosa thời gian phát hiện là 6 giờ, lượng vi khuẩn gây nhiễm là 100 CFU; Salmonella, S. aureus là 9 giờ và lượng vi khuẩn gây nhiễm là 100. Còn với thử nghiệm vô khuẩn: thời gian tăng sinh của vi khuẩn là 9 giờ với lượng gây nhiễm là 100, nấm men thời gian tăng sinh là 12 giờ với lượng gây nhiễm là 100, nấm mốc thời gian tăng sinh là 60 giờ với gây nhiễm là 101. Phản ứng RT-PCR Dược điển quy định, việc kiểm nghiệm chỉ tiêu vi sinh của các mẫu dược phẩm dựa trên các vi sinh vật sống, do đó các thử nghiệm phát hiện dựa trên phương pháp RT-PCR, nghĩa là tiến hành trên các vi sinh vật sống vì ARN chỉ tồn tại trong các tế bào sống. Tuy nhiên sử dụng ARN không ổn định, vì số lượng bản sao của ARN trong tế bào luôn thay đổi tùy vào từng giai đoạn của tế bào. 798bp M 1 466bp M 2 5 M 631bp 422bp 3 4 6 Ec 147bp Ps Sal M Sta 300bp 373bp 504bp Hình 5. Phản ứng RT-PCR trên mồi chung và mồi đặc hiệu 1, 2: ARN của vi khuẩn với mồi p8FPL-UF/ p806R-UR, U340-UF/ U806-UR; 3,4: ARN của Candida và Aspergillus với mồi RRF1-UF/ RRH1-UR; 5, 6: ARN của Candida và Aspergillus với mồi SSU-0817-UF/ SSU196-UR; Ec, Ps, Sal, Sta: ARN của vi sinh vật chỉ thị với mồi đặc hiệu. Do vậy khi tối ưu các thông số của các cặp mồi sử dụng, cũng như khảo sát giới hạn phát hiện, tính đặc hiệu của mồi, thời gian tăng sinh để phát hiện các vi sinh vật... chúng tôi tiến hành trên khuôn mẫu là ADN và kiểm tra lại các thông số này với khuôn mẫu là ARN. Kết quả cho thấy các thông số của phản ứng PCR đều thích hợp khi áp dụng lên phản ứng RT-PCR với khuôn mẫu là ARN. KẾT LUẬN Từ các kết quả trên, chúng tôi nhận thấy kỹ thuật RT-PCR để phát hiện vi sinh vật chỉ thị và thử vô khuẩn trong dược phẩm có thời gian thực hiện nhanh hơn khoảng 5 lần so với phương Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 210 pháp Dược điển. Ngoài ra, các yêu cầu về độ đặc hiệu và độ nhạy đều đạt trên các cặp mồi đã khảo sát. Như vậy, kỹ thuật PCR để xác định giới hạn vi sinh vật trong dược phẩm là hoàn toàn khả thi. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ Y Tế (2009). Dược điển Việt Nam 4. Phụ luc 13.6 Thử giới hạn nhiễm khuẩn. PL258- PL269. Hà Nội. 2. Bayardelle P., Zafarullah M. (2002). Development of oligonucleotide primers for the specific PCR-based detection of the most frequent Enterobacteriaceae species ADN using wec gene templates. Can J Microbiol. 48(2): 113-22. 3. Borneman J., Hartin R. J. (2000). PCR primers that amplify fungal rADN genes from environmental samples. Appl Environ Microbiol. 66(10): 4356-60. 4. Harju S., Fedosyuk H., et al. (2004). Rapid isolation of yeast genomic ADN: Bust n' Grab. BMC Biotechnol. 4: 8. 5. Jaffe R. I., Lane J. D., et al. (2001). Real-time identification of Pseudomonas aeruginosa direct from clinical samples using a rapid extraction method and polymerase chain reaction (PCR). J Clin Lab Anal. 15(3): 131-7. 6. McCabe K. M., Zhang Y. H., et al. (1999). Bacterial species identification after ADN amplification with a universal primer pair. Mol Genet Metab. 66(3): 205-11. 7. Tsai Y. L., Palmer C. J., et al. (1993). Detection of Escherichia coli in sewage and sludge by polymerase chain reaction. Appl Environ Microbiol. 59(2): 353-7. 8. Vanittanakom N., Vanittanakom P.