Vật liệu, giống vi sinh vật và môi trường nấm men

-33- Vật liệu và phương pháp 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU, GIỐNG VI SINH VẬT VÀ MÔI TRƯỜNG 2.1.1. Nguyên vật liệu 2.1.1.1. Gạo tấm Gạo tấm được sử dụng trong quá trình thí nghiệm nuôi bán rắn nấm men Rhodotorula là loại gạo tấm phụ phẩm trong ngành công nghiệp xay xát, dùng để làm thức ăn trong chăn nuôi do cơ sở thức ăn chăn nuôi số 69 Nguyễn Thị Nhỏ, Quận 6, Tp.HCM cung cấp. Hình 2.1. Gạo tấm phụ phẩm Bảng 2.1. Thành phần gạo tấm sử dụng STT Chỉ tiêu Đơn vị (%) 1 Độ ẩm 12,8 % 2 Hàm lượng đạm tổng 6,7 %CK 3 Hàm lượng lipid 1,6 %CK 4 Hàm lượng tinh bột 62,8 %CK 5 Hàm lượng xơ thô 9,0 %CK 6 Hàm lượng tro thô 7,3 %CK 2.1.1.2. Bã đậu nành Sử dụng bã đậu nành phụ phẩm của công ty cổ phần sữa Việt Nam (viết tắt Vinamilk). HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -34- Vật liệu và phương pháp Hình 2.2. Bã đậu nành của công ty Vinamilk Nguyên liệu thu mua ở dạng khô, có màu vàng rơm và có mùi đặc trưng của đậu nành, quy cách đóng bao: 25Kg/bao. Bảng 2.2. Thành phần bã đậu nành của Vinamilk STT Chỉ tiêu Đơn vị % 1 Độ ẩm 13,14 2 Hàm lượng đạm tổng 43,12 %CK 3 Hàm lượng lipid 17,54 %CK 4 Hàm lượng đường tổng 4,59 %CK 5 Hàm lượng xơ thô 31,49 %CK 6 Hàm lượng tro thô 3,26 %CK 2.1.1.3. Dầu ăn Cooking Oil Sử dụng dầu thực vật của công ty dầu thực vật Tường An. 2.1.2. Giống vi sinh vật và môi trường 2.1.2.1. Nguồn giống Chủng nấm men Rhodotorula sp.3 (MN12) do Viện Công nghệ Sinh học – Thực phẩm, Trường Đại học Công Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp, được phân lập từ lá lúa lấy tại huyện Tân An, Long An và bước đầu định danh được thuộc HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -35- Vật liệu và phương pháp giống Rhodotorula. Sau đó, công ty Nam Khoa đã giải mã trình tự DNA, tra cứu trên Blast search và kết luận là Rhodotorula sp.3. Hình 2.3. chủng nấm men Rhodotorula sp.Khuẩn lạc 3 (MN12) 2.1.2.2. Môi trường giữ giống nấm men [8] – Mầm đại mạch : 200 – 250 g. – Agar : 2 % – Nước cất vừa đủ : 1000 ml. Cách chuẩn bị môi trường thạch malt: Cân 200 – 250 g đại mạch vào một lít nước cất. Nấu giữ ở nhiệt độ 60 OC để đường hoá cho đến khi hết tinh bột (thử với iod không còn thấy màu xanh lam), lọc lấy dịch đường hoá, thêm nước cất điều chỉnh tới nồng độ 10 oBrix. Bổ sung thêm 2 % agar. Phân vào các ống nghiệm và hấp thanh trùng. Cứ sau 15 ngày, cấy chuyền nấm men vào các ống nghiệm chứa môi trường thạch malt. Những ngày đầu thì nuôi ở nhiệt độ phòng (27 oC – 30 oC). Sau 7 – 10 ngày thì giữ ở nhiệt độ 8 oC. Hình 2.4. Cấy chuyền giữ giống trên môi trường thạch malt trong ống nghiệm HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -36- Vật liệu và phương pháp 2.1.2.3. Môi trường hoạt hóa nấm men [8], [10] – Glucose 4g – Định mức 100ml bằng nước cất 2 lần. Cách hoạt hóa nấm men Cân 4g glucose sau đó dùng nước cất 2 lần định mức 100 ml. Cho vào ống nghiệm, mỗi ống 25ml dung dịch huyền phù trên và đem tiệt trùng ở 121 0C trong 20 phút. Để nguội, dùng que cấy lấy nấm men từ môi trường malt giữ giống cho vào ống nghiệm. Cho ống nghiệm vào máy Voctex lắc cho các bào tử phân bố đều trong dung dịch huyền phù. Đặt ống nghiệm vào máy lắc ngang (130 – 150 vòng/phút) lắc trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. 2.1.2.4. Môi trường nuôi cấy bán rắn – Cơ chất chính : 100 % cơm tấm – Dầu ăn : 1 % thể tích/g khối lượng cơm tấm – Bã đậu nành : 3 % khối lượng/g khối lượng cơm tấm – NaNO3 – MgSO4.7H2O – KH2PO4 – Saccharose Ghi chú: do tối ưu thành phần các khoáng chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy bán rắn nên nồng độ khoáng cho vào sẽ thay đổi theo phương pháp tối ưu để tìm ra nồng độ khoáng tối ưu cho quá trình nuôi cấy bán rắn. 2.1.2.5. Môi trường tổng hợp (cơ bản) trong nuôi cấy nấm men – Gạo tấm đã hồ hóa: 100 % – Bã đậu nành: 3 % (w/w) HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -37- Vật liệu và phương pháp – Dầu Tường An : 1 % (v/w) – Dung dịch khoáng: NaNO3: 10g; KH2PO4: 2,5 g; MgSO4.7H2O: 1,75 g; đường saccharose: 30 g; nước cất: vừa đủ 1000 ml. Tỷ lệ dung dịch bổ sung: 1 % (v/w). 2.1.2.6. Giống gà Giống gà IsaBrown nhập từ Thái Lan. Gà bắt đầu thí nghiệm ở 26 tuần tuổi, chọn các cá thể gà mái có khối lượng trung bình bằng nhau. Kết thúc vào giai đoạn gà được 42 tuần tuổi. Mỗi lô gồm 40 con gồm 10 chuồng, mỗi chuồng 4 con. 2.1.2.7. Thức ăn cho gà Thức ăn đối chứng là thức ăn Star feed GĐ 26 do công ty chăn nuôi CP Việt Nam cung cấp với các chỉ tiêu như sau: (theo in ấn trên bao bì) Bảng 2.3. Thành phần thức ăn star feed GĐ26 dùng trong thí nghiệm đối chứng TT Chỉ tiêu % Khối lượng 1 Độ ẩm tối đa 14 2 Calci tối thiểu 3,5 3 Protein tối thiểu 39 4 Phospho tối thiểu 1,5 5 Năng lượng trao đổi 2100 Kcal/Kg 6 Xơ thô tối đa 9 7 NaCl 1 – 1,3 HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -38- Vật liệu và phương pháp Trộn thức ăn theo công thức: Bảng 2.4. Công thức thức ăn của lô đối chứng (ĐC) Lứa tuổi 19 – 35 tuần tuổi 36 – 50 tuần tuổi >51 tuần tuổi Star feed GĐ 26 (Kg) 35 31 29 Bắp (Kg) 30 30 26 Tấm (Kg) 20 23 29 Cám gạo (Kg) 8 9 9 Vỏ sò (Kg) 7 7 7 Các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của chế phẩm thu nhận từ canh trường nuôi cấy nấm men Rhodoturola sp.3 (gọi tắt là chế phẩm βCR) lên gia cầm chuyên trứng được tiến hành tại Doanh nghiệp Tư nhân Mai Thủy với quy mô 30.000 con, ngụ tại thôn Bầu Điển – xã Đá Bạc – huyện Châu Đức – tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu. 2.1.2.8. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ a. Hóa chất – Hoá chất dùng pha môi trường: D – Glucose, Agar, NaNO3, MgSO4.7H2O, KH2PO4, HCl, NaOH, saccharose… – Hoá chất dùng trong những thí nghiệm sinh hóa: H2SO4 đậm đặc, HCl 0,1N chuẩn, H3BO3 4%, NaOH 32%, diethyl eter, acetonitril, iso propanol, ethyl acetate, cồn 96o, 70o,… – Beta – carotene chuẩn của Sigma Chemical Co., Mỹ có mã số C9750-5G. b. Thiết bị và dụng cụ Sử dụng các thiết bị, dụng cụ chuyên dùng của phòng thí nghiệm hóa sinh như: Phân tích, nồi hấp tiệt trùng Autoclave Tommy, tủ cấy, máy lắc ngang, tủ lạnh đông chậm, máy Kjendahl, máy Soctex, lò nung, máy pH kế, ống nghiệm, đũa thủy tinh, Pipet, pipetman, bình định mức, Becker, Erlen, ống đong, burette, chén nung, bóp cao su, bếp điện, chén cân, bình hút ẩm, tủ sấy, cân phân tích, đèn cồn, que cấy,.... HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -39- Vật liệu và phương pháp 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Sơ đồ nuôi cấy bán rắn nấm men Rhodotorula sp.3 Ngâm Gạo tấm Hồ hóa Phối trộn Dầu ăn, bã đậu nành Khoáng chất Thanh trùng Cấy giống Sinh khối nấm men Hoạt hóa Giống nấm men Rho. Nuôi cấy + Tối ưu mật độ giống, độ ẩm và độ dày lớp môi trường với hàm mục tiêu là beta – carotene + Khảo sát hàm lượng beta - carotene theo thời gian Chế phẩm giàu carotenoid + Phân tích đạm, béo, tinh bột, tro, xơ… + Thử nghiệm trên gà IsaBrown + Thu trứng, phân tích các chỉ tiêu về phẩm chất trứng Sấy 45 ± 5oC Tối ưu thành phần dinh dưỡng bổ sung Hình 2.5. Sơ đồ quy trình nuôi cấy và tiến hành thí nghiệm HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -40- Vật liệu và phương pháp 2.2.2. Thuyết minh quy trình 2.2.2.1. Ngâm gạo Nguyên liệu gạo tấm được ngâm trong thời gian 24 giờ với nước có pH = 3,0, giúp cho quá trình thủy phân một phần tinh bột và giúp gạo hút nước, trương nở tạo điều kiện cho quá trình hồ hóa được diễn ra dễ dàng hơn. 2.2.2.2. Hồ hóa Sau khi ngâm 24 giờ đem đi hồ hóa. Quá trình này sẽ giúp quá trình lên men bán rắn của nấm men tốt hơn, do tạo ra các cơ chất dễ sử dụng. 2.2.2.3. Phân phối Gạo tấm nấu xong theo các tỷ lệ trên, sẽ được cơm tấm, tiến hành phân phối vào các hộp nhựa. Bổ sung bã đậu nành, dầu ăn, đường và các nồng độ khoáng theo mục đích tối ưu. 2.2.2.4. Tiệt trùng Các hộp canh trường đã được phân phối các thành phần môi trường nuôi cấy thích hợp được đem tiệt trùng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 20 phút 2.2.2.5. Cấy vi sinh vật Giống nấm men Rhodotorula được hoạt hóa trong dung dịch glucose 4 % trên máy lắc trong 24 giờ với tốc độ 150 vòng/phút. Được đo quang ở bước sóng 610 nm để tính tỷ lệ giống cấy vào môi trường sau khi thanh trùng để nguội. 2.2.2.6. Nuôi cấy Nuôi nấm men ở điều kiện nhiệt độ phòng, trong thời gian từ 5 – 7 ngày. Tối ưu các thành phần dưỡng chất gồm: KH2PO4, MgSO4, NaNO3, saccharose (Sac.) và các yếu tố điều kiện nuôi cấy gồm: mật độ giống cấy, độ ẩm và độ dày lớp môi trường đến khả năng sinh tổng hợp beta – carotene của nấm men Rhodotorula sp.3. HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -41- Vật liệu và phương pháp Hình 2.6. Canh trường nấm men ở ngày thứ 7 2.2.2.7. Tạo chế phẩm canh trường nấm men Rhodotorula Toàn bộ sản phẩm canh trường nấm men sau thời gian nuôi cấy, được đi sấy khô ở nhiệt độ 45 ± 5oC trong 24 giờ, nghiền sơ bộ, chúng tôi thu được chế phẩm canh trường nấm men Rhodotorula sp.3 (gọi tắt là chế phẩm βCR) 2.2.3. Tối ưu hóa hàm lượng khoáng đến khả năng sinh beta - carotene của nấm men Rhodotorula sp.3 2.2.3.1. Thí nghiệm sơ khởi: khảo sát chọn điểm ở tâm Dùng phương pháp cổ điển, khảo sát sơ bộ quá trình sinh tổng hợp beta – carotene ở các nồng độ KH2PO4, MgSO4, NaNO3 và saccharose bổ sung khác nhau để chọn điểm ở tâm cho giai đoạn quy hoạch thực nghiệm quay bậc hai của Box –Hunter. Cố định các điều kiện ban đầu như sau: nhiệt độ nuôi cấy (nhiệt độ phòng thí nghiệm) 28 – 32 0C; độ ẩm canh trường khoảng 60 %; pH 5,5 và mật độ cấy giống là 3x107 CFU/g cơ chất. HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -42- Vật liệu và phương pháp Bảng 2.5. Mức khảo sát của các nồng độ KH2PO4, MgSO4, NaNO3 và Sac. để tìm thí nghiệm tại tâm Các mức KH2PO4 (mg/Kg môi trường) MgSO4 (mg/Kg môi trường) NaNO3 (mg/Kg môi trường) Sac.(mg/Kg môi trường) Mức 1 35 35 100 200 Mức 2 45 50 150 300 Mức 3 55 65 200 400 Mức 4 65 80 250 500 Từ thực nghiệm trên, xác định hàm lượng beta – carotene (ppm theo CK) sau 5 ngày nuôi cấy để tìm ra điểm ở tâm cho phương pháp qui hoạch thực nghiệm bậc 2 của Box và Hunter. 2.2.3.2. Tối ưu hóa hàm lượng khoáng theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm bậc 2 Box – Hunter Sau khi tìm được thí nghiệm tại tâm, chúng tôi thực hiện tối ưu hóa theo phương pháp quay bậc hai của Box-Hunter, tiến hành các thí nghiệm ở các mức kết hợp khác nhau của bốn yếu tố KH2PO4, MgSO4, NaNO3 và Sac. với các thí nghiệm được bố trí trong bảng 2.6 dưới đây, có hệ số cánh tay đòn sao α = 2 và số thí nghiệm ở tâm là 7. HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -43- Vật liệu và phương pháp Bảng 2.6. Ma trận qui hoạch thực nghiệm phương án quay bậc 2 Số TN x1 x2 x3 x4 Số TN x1 x2 x3 x4 1 -1 -1 -1 -1 17 -2 0 0 0 2 1 -1 -1 -1 18 2 0 0 0 3 -1 1 -1 -1 19 0 -2 0 0 4 1 1 -1 -1 20 0 2 0 0 5 -1 -1 1 -1 21 0 0 -2 0 6 1 -1 1 -1 22 0 0 2 0 7 -1 1 1 -1 23 0 0 0 -2 8 1 1 1 -1 24 0 0 0 2 9 -1 -1 -1 1 25 0 0 0 0 10 1 -1 -1 1 26 0 0 0 0 11 -1 1 -1 1 27 0 0 0 0 12 1 1 -1 1 28 0 0 0 0 13 -1 -1 1 1 29 0 0 0 0 14 1 -1 1 1 30 0 0 0 0 15 -1 1 1 1 31 0 0 0 0 16 1 1 1 1 16 TN ma trận + 8 TN quay + 7 TN tại tâm Thực nghiệm được khảo sát theo sự biến thiên của các yếu tố khảo sát như sau: x1: Nồng độ KH2PO4 với mức biến thiên 5 mg/Kg môi trường x2: Nồng độ MgSO4 với mức biến thiên 5 mg/Kg môi trường x3: Nồng độ NaNO3 với mức biến thiên 20 mg/Kg môi trường x4: Nồng độ saccharose với mức biến thiên 50 mg/Kg môi trường Với các điều kiện ban đầu được cố định như sau: Nhiệt độ phòng thí nghiệm: 28 - 32 0C pH: 5,5 Độ ẩm môi trường: 60% Mật độ cấy giống: 3x107 (CFU/g môi trường) Các mức được cho như bảng 2.7 dưới đây: HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -44- Vật liệu và phương pháp Bảng 2.7. Mức biến thiên của các nồng độ KH2PO4, MgSO4, NaNO3 và Sac. (mg/Kg môi trường) Các mức KH2PO4 MgSO4 NaNO3 Sac. Mức cơ sở 45 65 200 300 Khoảng biến thiên 5 5 20 50 Mức trên (+) 50 70 220 350 Mức dưới (-) 40 60 180 250 Dựa vào kết quả thực nghiệm, chúng tôi xây dựng phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng của nguồn KH2PO4, MgSO4, NaNO3 và Sac. bổ sung đến khả năng sinh tổng hợp sắc tố beta – carotene của nấm men Rhodotorula sp.3. Phương trình qui hoạch thực nghiệm có dạng: y = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3 + b4x4 + b12x1x2 + b13x1x3 + b14x1x4 +b23x2x3 + b24x2x4 b34x3x4 +b11x12 + b22x22 + b33x32 + b44x42 Hàm mục tiêu y : Hàm lượng sắc tố beta – carotene (ppm theo CK). Phương trình này là cơ sở để xác định các giá trị tối ưu của những yếu tố ảnh hưởng nói trên. 2.2.4. Tối ưu điều kiện nuôi cấy bán rắn nấm men Rhodotorula sp.3 2.2.4.1. Xác định thí nghiệm tại tâm cho bài toán tối ưu điều kiện nuôi cấy Cố định yếu tố KH2PO4, MgSO4, NaNO3 và Sac. đã tối ưu ở mục 2.2.3, chúng tôi tiến hành nuôi nấm men Rhodotorula sp. 3 tại điều kiện nhiệt độ, ánh sáng phòng để khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố tỷ lệ giống, độ ẩm và độ dày lớp môi trường đến khả năng sinh tổng hợp beta – carotene của nấm men Rhodotorula sp.3 theo các mức như bảng 2.8 để tìm thí nghiệm tại tâm cho bài toán tối ưu điều kiện nuôi cấy: HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -45- Vật liệu và phương pháp Bảng 2.8. Các mức khảo sát điều kiện nuôi cấy để tìm thí nghiệm tại tâm Các mức Độ ẩm (%) Độ dày lớp môi trường (cm) Tỷ lệ giống (CFU/g môi trường) Mức 1 50 1 3x107 Mức 2 60 2 6x107 Mức 3 70 3 9x107 2.2.4.2. Ma trận thực nghiệm tối ưu điều kiện nuôi cấy Cố định các thành phần và điều kiện nuôi như đã nêu ở mục 2.2.4.1, chúng tôi tiếp tục khảo sát sự biến thiên của các yếu tố điều kiện nuôi cấy bán rắn nấm men Rhodotorula sp.3 như sau: x1: Độ ẩm (%) với mức biến thiên: 5,0 x2: Độ dày lớp môi trường (cm) với mức biến thiên: 1 x3: Tỷ lệ giống (CFU/g môi trường) với mức biến thiên: 2,5x107 Các mức biến thiên như bảng sau: Bảng 2.9. Mức biến thiên của các yếu tố điều kiện nuôi cấy Các mức Độ ẩm (%) Độ dày lớp môi trường (cm) Tỷ lệ giống (CFU/g môi trường) Mức cơ sở 60 2 6,0x107 Khoảng biến thiên 5,0 1 2,5x107 Mức trên (+) 65 3 8,5x107 Mức dưới (-) 55 1 3,5x107 Quy hoạch thực nghiệm bậc hai Box – Hunter để tối ưu hóa ba yếu tố độ dày lớp môi trường, độ ẩm và mật độ giống cấy với các thí nghiệm được bố trí có hệ số cánh tay đòn sao α = 1,682. Số thí nghiệm ở tâm là 6. Cách bố trí ma trận thí nghiệm như bảng 2.10 và hàm mục tiêu là hàm lượng beta – carotene (ppm theo CK). HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -46- Vật liệu và phương pháp Bảng 2.10. Ma trận qui hoạch thực nghiệm 3 yếu tố theo phương án quay bậc 2 Số TN x1 x2 x3 Số TN x1 x2 x3 1 -1 -1 -1 11 0 -1,682 0 2 1 -1 -1 12 0 1,682 0 3 -1 1 -1 13 0 0 -1,682 4 1 1 -1 14 0 0 1,682 5 -1 -1 1 15 0 0 0 6 1 -1 1 16 0 0 0 7 -1 1 1 17 0 0 0 8 1 1 1 18 0 0 0 9 -1,682 0 0 19 0 0 0 10 1,682 0 0 20 0 0 0 Dựa vào kết quả thực nghiệm, chúng tôi xây dựng phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng các yếu tố điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp beta-carotene của nấm men nghiên cứu. Phương trình qui hoạch thực nghiệm có dạng: y = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3 + b12x1x2 + b13x1x3 + b23x2x3 + b11x12 + b22x22 + b33x32 Hàm mục tiêu y : hàm lượng sắc tố beta – carotene (ppm theo CK) sau 5 ngày nuôi cấy. Phương trình này là cơ sở để xác định các giá trị tối ưu của những yếu tố ảnh hưởng nói trên. 2.2.5. Xác định khả năng sinh tổng hợp beta – carotene theo thời gian của nấm men Rhodotorula sp.3 trên các điều kiện đã khảo sát – Mục đích: Theo dõi khoảng thời gian sinh beta – carotene cực đại của nấm men Rhodotorula sp.3 trên môi trường bán rắn theo thời gian (ngày), nhằm tìm được thời điểm thu nhận beta – carotene phù hợp nhất . HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -47- Vật liệu và phương pháp – Cách tiến hành Tiến hành nuôi bán rắn tế bào nấm men ở điều kiện tối ưu và nhiệt độ phòng, trong khoảng thời gian khảo sát là 9 ngày. Các mẫu sẽ được tiến hành xác định hàm lượng beta – carotene sau mỗi 24 giờ (1 ngày) ở cùng khoảng thời gian cố định mỗi ngày. Mẫu canh trường được lạnh đông chậm trong khoảng 24 giờ và nghiền bằng bột thủy tinh. Sử dụng phương pháp tách chiết chất màu beta – carotene bằng hỗn hợp dung môi (acetonitrile:2 – propanol:ethyl acetate = 4:4:2), ly tâm và sau đó đem so màu ở bước sóng nm454=λ để xác định OD, dựa vào phương trình đường tương quan giữa mật độ quang và hàm lượng beta – carotene để xác định hàm lượng beta – carotene có trong mẫu. 2.2.6. Các phương pháp phân tích chế phẩm nấm men 2.2.6.1. Phương pháp xác định ẩm theo TCVN 4326:1986 [14] Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi. Độ ẩm là lượng nước tự do có trong thực phẩm. – Nguyên tắc Dùng sức nóng làm bay hết hơi nước trong thực phẩm. Cân khối lượng mẫu trước và sau khi sấy khô, từ đó tính ra phần trăm nước có trong thực phẩm. – Thiết bị o Cân phân tích Sartorius 4 số lẻ o Tủ sấy HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -48- Vật liệu và phương pháp Hình 2.7. Tủ sấy và cân phân tích Sartorius – Cách tiến hành Sấy cốc không đến khối lượng không đổi có khối lượng là mo (g). Cho mẫu vào cốc đã sấy ta được khối lượng m1 (g). Sấy mẫu và cốc thủy tinh ở 105 oC cho đến khối lượng không đổi m2 (g). – Tính kết quả % Ẩm (W) = 100 01 21 ×− − mm mm Trong đó: mo : Khối lượng cốc (g) m1 : Khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy (g) m2 : Khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi (g) 2.2.6.2. Phương pháp phân tích hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl theo TCVN 4328:2001 [14] – Nguyên tắc Khi đốt nóng phẩm vật đem phân tích với H2SO4 đậm đặc, các hợp chất hữu cơ bị oxi hóa. Carbon và hydro tạo thành CO2 và H2O. Còn Nitơ (N2) sau khi được giải phóng ra dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch. Đuổi NH3 khỏi dung dịch bằng NaOH đồng thời cất và thu NH3 bằng một lượng dư HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -49- Vật liệu và phương pháp H3BO4 0,1N. Định lượng (NH4)3BO4 bằng dung dịch HCl 0,1N chuẩn, qua đó tính được lượng Nitơ (N2) có trong mẫu nguyên liệu thí nghiệm. – Thiết bị và hóa chất o Máy cất đạm bán tự động Kjeltec 2200 o H2SO4 đậm đặc o NaOH 40% o H2O tinh khiết o Dung dịch HCl 0,1N o Dung dịch H3BO4 0,1N o Phenolphtalein 0,1% Hình 2.8. Máy cất đạm bán tự động Kjeltec 2200 – Cách tiến hành Vô cơ hóa mẫu: Cân 0,2 g mẫu cho vào bình Kjeldahl, thêm từ từ 10 ml H2SO4 đậm đặc. Để tăng nhanh quá trình vô cơ hóa cần chất xúc tác là CuSO4 : K2SO4 theo tỉ lệ 1 : 1, giải phóng O2 cho phản ứng oxy hóa. Đun nhẹ hỗn hợp, tránh sôi trào và chỉ đun mạnh khi hỗn hợp đã hoàn toàn chuyển sang dịch lỏng.. Đun cho tới khi dung dịch trong bình chuyển hoàn toàn sang màu trắng xanh. Cất đạm: Tiến hành trên máy cất đạm bán tự động Kjeldahl của FOSS. HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -50- Vật liệu và phương pháp Chuẩn bị máy cất đạm: chuyển toàn bộ dung dịch sau khi đã vô cơ hóa xong cho vào bình định mức 100 ml và định mức tới vạch định mức. Lấy vào ống cất 10 ml dịch đã vô cơ hóa và lắp vào máy. Cho vài giọt phenolphtalein 1% vào erlen và cài chương trình cho máy để bắt đầu cất đạm. Sau khi cất xong lấy erlen ra tráng sạch vòi bằng nước cất để lấy hết mẫu trong ống. – Tính kết quả Hàm lượng protein có trong 1 g chế phẩm: mV VkVVN × ××××−= 3 201 1000014,0)(% Trong đó: V1: Thể tích HCl 0,1N tiêu tốn cho chuẩn hoá (ml). V0: Thể tích HCl 0,1N tiêu tốn cho chuẩn mẫu trắng (ml). V2: Thể tích mẫu định mức (ml). V3: Thể tích mẫu đem cất đạm (ml). m: Khối lượng mẫu đem vô cơ hoá (g). k: Hệ số hiệu chỉnh nồng độ HCl 0,1N (0,99). 0,0014: Số mg nitơ tổng cùng với 1ml HCl 0,1N. 100: Quy đổi ra %. Tính ra hàm lượng protein thô theo công thức: % Protein = % N × 6,25 Hệ số 6,25 là hệ số quy đổi từ nitơ sang protein. HVTH: Nguyễn Thị Tú Minh -51- Vật liệu và phương pháp 2.2.6.3. Phương pháp phân tích hàm lượng lipit thô bằng phương pháp trích ly theo TCVN 4331:2001 [14] – Nguyên tắc Nguyên liệu đã được làm khô, sau đó trích ly lipid ra khỏi nguyên liệu bằng dietyl eter hoặc eter dầu hỏa trên bộ chưng cất béo bán tự động