Vật liệu thí nghiệm nuôi trồng nấm rơm lụa bạc volvariella bombicina

Bước đầu nghiên cứu qui trình nuôi trồng nấm rơm lụa bạc Volvariella bombicina  Học viên thực hiện: Trần Thị Kim Dung Trang 33 2.1 Vật liệu thí nghiệm 2.1.1 Đối tượng thí nghiệm - Chủng nấm: Chủng nấm rơm lụa bạc Volvariella bombicina (Pers.exFr)Sing do thạc sĩ Cổ Đức Trọng - Trung Tâm Nghiên Cứu Linh Chi Và Nấm Dược Liệu cung cấp. 2.1.2 Dụng cụ và thiết bị - Ống nghiệm 160x16 mm - Erlen 100ml - Bao PP cỡ 19x28 cm - Bông mỡ - Cổ nút nhựa - Chai thuỷ tinh (chai nước biển) - Autoclave - Tủ sấy -Tủ cấy vô trùng - Nhiệt kế - Dao mổ số 7, lưỡi dao số 11 - Que cấy móc - Đĩa Petri - Phễu lọc - Bếp điện Bước đầu nghiên cứu qui trình nuôi trồng nấm rơm lụa bạc Volvariella bombicina  Học viên thực hiện: Trần Thị Kim Dung Trang 34 - Lò viba - Bình định mức - Cân điện tử - Pipet - Đèn cồn 2.1.3 Môi trường và nguyên liệu - Môi trường phân lập và giữ giống: o Môi trường thạch khoai tây (PGA) gồm: 200g khoai tây , gọt vỏ, bào mỏng, thêm một ít nước cất, nấu sôi, chắt lấy nước. Nước khoai tây nói trên, thêm 20g glucose, nước cất vừa đủ 1000ml. Khử trùng ở 121oC trong 30 phút [7],[8]. o Môi trường Raper gồm peptone (2g), yeast extract (2g), MgSO4.7H2O (0.5g), K2HPO4 (1.0g), glucose (20g), agar (20g), nước cất (1000ml). Khử trùng ở 121oC trong 30 phút [7],[8]. - Môi trường nhân giống: o Gạo lứt đỏ : gạo lứt đỏ vo sạch, nấu sôi đến khi vừa búp, đổ ra trải lớp cho nguội và ráo nước, cho vào chai thuỷ tinh, làm nút bông, khử trùng 1atm 2 giờ [7]. o MCĐQSD : MCĐQSD trộn đều với nước vôi 1% đạt độ ẩm 65-70%, ủ đống 24 giờ, cho vào chai thuỷ tinh, mỗi chai chứa 300g mạt cưa ẩm tương đương 150g mạt cưa khô [8]. - Nguyên liệu trồng: Bước đầu nghiên cứu qui trình nuôi trồng nấm rơm lụa bạc Volvariella bombicina  Học viên thực hiện: Trần Thị Kim Dung Trang 35 o Bã tróc: Củ tróc sau khi đã thu tinh bột còn lại bã tróc, đem bã để ráo nước, phơi qua một nắng cho bớt nước, ủ đống 24 giờ, cho vào bịch PP (19x28cm), mỗi bịch chứa 750g bã tróc ẩm tương đương 400g bã tróc khô. o MCĐQSD: MCĐQSD trộn đều với nước vôi 1% đạt độ ẩm 65-70%, ủ đống 24 giờ, cho vào bịch PP (19x28cm), mỗi bịch chứa 750g mạt cưa ẩm tương đương 400g mạt cưa khô [7],[8]. - Thành phần bổ sung vào nguyên liệu trồng o Cám lúa o Urê - Địa điểm và thời gian thí nghiệm: o Địa điểm: Phòng thí nghiệm chuyển hoá sinh học, khoa sinh học, đại học Khoa học Tự nhiên o Thời gian: Tháng 8/2008 -> tháng 5/2009 Bước đầu nghiên cứu qui trình nuôi trồng nấm rơm lụa bạc Volvariella bombicina  Học viên thực hiện: Trần Thị Kim Dung Trang 36 2.2 Phương pháp thí nghiệm 2.2.1 Sơ đồ tổng quát Giống nấm Môi trường nhân giống: Thu meo giống Môi trường nuôi trồng: Thu quả thể Thu đơn bào tử: cho bào tử nảy mầm và chọn 4 dòng đơn bào tử Môi trường nhân giống: Thu meo giống Môi trường nuôi trồng : Thu quả thể Chọn 1 dòng cho năng suất cao nhất trồng với nguyên liệu tốt nhất: thống kê tìm hiệu năng sinh học 2.2.2 Phương pháp thí nghiệm cho đợt 1 2.2.2.1 Phương pháp chuẩn bị meo giống Trên môi trường gạo lức đỏ: Gạo lức vo sạch, nấu cho đến khi vừa nở, vớt ra để ráo. Bổ sung urê với tỉ lệ 2%o. Cho gạo vào chai thuỷ tinh, đường kính 7cm, cao 18cm. Chỉ cho khoảng 2/3 chai, mỗi chai chứa tương đương khoảng 100g gạo nứt. Làm nút bông, bọc lại miệng bằng giấy báo. Đợt 1: Nuôi trồng thu quả thể (để tách đơn bào tử) và sơ bộ chọn môi trường nhân giống, môi trường nuôi trồng. Đợt 2: So sánh năng suất của bốn dòng và chọn môi trường nuôi trồng tốt nhất. Đợt 3: Nuôi trồng dòng tốt nhất đã chọn ở đợt 2 trên môi trường tốt nhất đã chọn. Thống kê khẳng định năng suất và qui trình nuôi trồng. Bước đầu nghiên cứu qui trình nuôi trồng nấm rơm lụa bạc Volvariella bombicina  Học viên thực hiện: Trần Thị Kim Dung Trang 37 Khử trùng ở 1atm, 2 giờ. Để nguội 48 giờ. Cấy giống đã được cung cấp vào các chai gạo. (Khoảng 10g/1 bịch meo). Giữ trong tối ở nhiệt độ phòng. Theo dõi sự lan tơ trong các chai gạo. Ghi nhận thời gian tơ lan đầy chai. [3],[4],[8],[19] Trên môi trường MCĐQSD Mạt cưa đã qua trồng nấm bào ngư đập bỏ bịch, bóp cho tơi, trộn với vôi bột theo tỉ lệ 0.2kg vôi/10 kg mạt cưa, ủ đống 24 giờ. Sau đó, bổ sung cám lúa 2%, urê 2%o. Cho gạo vào chai thuỷ tinh, đường kính 7cm, cao 18cm. Chỉ cho khoảng 2/3 chai, mỗi chai chứa tương đương khoảng 300g mạt cưa ẩm, tương đương 150g mạt cưa khô. Làm nút bông, bọc lại miệng bằng giấy báo. Khử trùng ở 1atm, 2 giờ. Để nguội 48 giờ. Cấy giống đã được cung cấp vào các chai mạt cưa. (Khoảng 10g/1 bịch meo). Giữ trong tối ở nhiệt độ phòng. Theo dõi sự lan tơ trong các chai mạt cưa. Ghi nhận thời gian tơ lan đầy chai. 2.2.2.2 Phương pháp chuẩn bị nguyên liệu nuôi trồng và nuôi trồng thu quả thể Chuẩn bị nguyên liệu - Mạt cưa đã qua trồng nấm bào ngư đập bỏ bịch, bóp cho tơi, trộn với vôi bột theo tỉ lệ 0.2kg vôi/10 kg mạt cưa, Ủ đống 24 giờ. Sau đó, bổ sung các chất dinh dưỡng tuỳ nghiệm thức. Đóng bịch PP (19x28cm), mỗi bịch chứa 750g mạt cưa ẩm tương đương 400g mạt cưa khô. Khử trùng 1 atm, 2 giờ. Để nguôi 48 giờ. - Bã tróc đem về để ráo bớt nước, ủ đống 24 giờ, bổ sung thêm nguyên liệu tuỳ nghiệm thức, đóng bịch PP (15x25cm), mỗi bịch chứa 750g bã tróc ẩm tương đương 400g bã tróc khô. Khử trùng 1 atm, 2 giờ. Để nguôi 48 giờ. [3],[4],[8],[19] Cấy meo giống nấm vào nguyên liệu nuôi trồng - Cấy meo đã chuẩn bị trong chai gạo hoặc chai mạt cưa vào nguyên liệu đã chuẩn bị, cứ 1 chai meo cấy vào 20 bịch nguyên liệu. - Chuẩn bị 2 loại nguyên liệu: MCĐQSD, bã tróc. Các loại nguyên liệu này được bổ sung lần lượt cám lúa 2%, bổ sung urê 2%o, bổ sung vừa cám lúa 2% vừa urê 2%o. Mỗi loại Bước đầu nghiên cứu qui trình nuôi trồng nấm rơm lụa bạc Volvariella bombicina  Học viên thực hiện: Trần Thị Kim Dung Trang 38 nguyên liệu đã bổ sung chất dinh dưỡng chia làm 2 lô thí nghiệm: Lô 1 cấy meo từ chai gạo, lô 2 cấy meo từ chai mạt cưa. Nguyên liệu Meo MCĐQSD Meo gạo Meo mạt cưa Bã tróc Meo gạo Meo mạt cưa MCĐQSD + cám lúa 2% Meo gạo Meo mạt cưa MCĐQSD + urê 2%o Meo gạo Meo mạt cưa Bã tróc + cám lúa 2% Meo gạo Meo mạt cưa Bã tróc + urê 2%o Meo gạo Meo mạt cưa MCĐQSD + cám lúa 2% + urê 2%o Meo gạo Meo mạt cưa Bã tróc + cám lúa 2% + urê 2%o Meo gạo Meo mạt cưa - Như vậy, ở đợt thí nghiệm này có tổng cộng 16 lô (16 nghiệm thức), mỗi lô thí nghiệm với 10 bịch, trong 10 bịch của mỗi lô: 5 bịch ủ tơ trong điều kiện không có ánh sáng, 5 bịch ủ tơ trong điều kiện ánh sáng khuyếch tán (200-300 lux). Tổng cộng đợt thí nghiệm này có 160 bịch. Nuôi ủ tạo hệ sợi tơ nấm - Mỗi lô thí nghiệm sau khi cấy meo xong, chia làm 2 phần: một nửa để ở nơi tối hoàn toàn, một nửa để ở nơi có ánh sáng tán xạ. - Tất cả đều được giữ ở nhiệt độ phòng. - Nơi ủ tơ phải sạch và thoáng mát, không bị dột mưa, không có ánh sáng chiếu trực tiếp. - Tất cả các bịch trong giai đoạn ủ tơ được xếp thẳng đứng trên kệ, không chồng chất lên nhau thành nhiều lớp. - Theo dõi sự lan tơ, ghi nhận thời gian tơ lan đầy bịch nguyên liệu. [19],[4],[8],[3] Chăm sóc và thu đón quả thể Bước đầu nghiên cứu qui trình nuôi trồng nấm rơm lụa bạc Volvariella bombicina  Học viên thực hiện: Trần Thị Kim Dung Trang 39 - Sau khi tơ lan đầy bịch nguyên liệu, đặt lên giàn nấm cao ráo, thông thoáng, kín gió, đã sát trùng xung quanh bằng cách rắc vôi bột. Tháo cổ bịch. Chờ 1 ngày sau đó bắt đầu tưới. Tưới ngày 3 lần (7h, 12h, 17h). Khi tưới dùng bình xịt để nước phun ra dưới dạng sương. Nhiệt độ trong giai đoạn này vào khoảng 28-32oC. - Sau khi nụ nấm hình thành và dần đến dạng trưởng thành thì tiến hành thu hái, cân trọng lượng các nụ. - Cần ghi nhận: thời gian kể từ lúc bắt đầu tưới đến khi thu hái quả thể, trọng lượng quả thể thu được ở mỗi bịch. - Sau khi quả thể đã được thu hái, cột miệng bịch lại, rạch xung quanh bịch, chờ 3 ngày, tiếp tục tưới ngày 3 lần, thu hái quả thể đợt 2. - Cộng gộp trọng lượng quả thể thu được từ 2 đợt để so sánh năng suất đối với từng nghiệm thức. [19],[4],[8],[3] 2.2.3 Phương pháp thí nghiệm cho đợt 2 2.2.3.1 Thu đơn bào tử Lấy một tờ giấy sạch, đặt lên tờ giấy 2 que tre sạch. Cắt một mũ nấm sắp phun bào tử đặt lên trên. Dùng 1 cái li úp lại. Để như vậy khoảng 2 ngày, nhấc li ra, bỏ mũ nấm và 2 que tre, ta thu được bào tử bắn ra trên tờ giấy. Dùng 1 tờ giấy sạch khác phủ lên trên lớp bào tử, đem phơi nắng rồi cất ở nơi khô ráo 1 tháng. Sau đó đem phân lập. [8] Phân lập đơn bào tử - Chuẩn bị môi trường PGA trong các đĩa petri. Bước đầu nghiên cứu qui trình nuôi trồng nấm rơm lụa bạc Volvariella bombicina  Học viên thực hiện: Trần Thị Kim Dung Trang 40 - Tẩy trùng bề mặt bào tử: Cắt giấy có bào tử cho vô nước cất vô trùng khuấy cho bào tử tách và li tâm thu bào tử (4000 vòng/phút, 3 phút). Bào tử được xử lý bằng dung dịch Hypoclorate calcium 0,1% trong 3 phút, được rửa bằng li tâm 4000 vòng/phút ba lần với nước cất vô trùng và giữ bào tử trong nước vô trùng - Đếm bằng buồng đếm hồng cầu để xác định mật độ bào tử. - Pha loãng để mật độ bào tử đạt 104 bào tử/1ml. - Lấy 10µl cho vào đĩa petri (tương đương 100 bào tử) - Dùng que cấy trải trải đều bào tử trong đĩa petri. - Giữ ở tủ ấm (27oC) , cho đến khi bào tử hình thành khuẩn lạc. - Dùng que cấy nhọn cấy sợi nấm sang ống nghiệm chứa môi trường PGA ta thu được ống giống tơ nấm từ 1 bào tử riêng lẻ [8] Lưu ý: Phải phân lập bào tử trên rất nhiều đĩa petri và quan sát các đĩa này thường xuyên, nếu thấy dấu hiệu nhiễm vi khuẩn hoặc nấm khác thì phải bỏ ngay. Nếu quan sát thấy tơ nấm không phát triển thêm cũng loại bỏ. [8] 2.2.3.2 Phương pháp chuẩn bị meo giống - Chuẩn bị môi trường gạo lức đỏ (như 2.2.2.1) - Chọn 4 ống nghiệm PGA chứa tơ nấm từ đơn bào tử, chú ý chọn 4 ống có tơ mọc tốt nhất (chọn theo cảm quan: sợi tơ trong suốt, phân nhánh hình mạng nhện, lan nhanh trên ống nghiệm). Ta được 4 dòng đơn bào tử khác nhau, đặt tên là dòng 1, dòng 2, dòng 3, dòng 4. Bước đầu nghiên cứu qui trình nuôi trồng nấm rơm lụa bạc Volvariella bombicina  Học viên thực hiện: Trần Thị Kim Dung Trang 41 - Lần lượt cấy 4 dòng vào các chai gạo lức đỏ. Ghi nhận thời gian tơ nấm của mỗi dòng lan đầy chai meo. [19],[4],[8],[3] 2.2.3.3 Phương pháp chuẩn bị nguyên liệu nuôi trồng và nuôi trồng thu quả thể Chuẩn bị nguyên liệu - Mạt cưa đã qua trồng nấm bào ngư đập bỏ bịch, bóp cho tơi, trộn với vôi bột theo tỉ lệ 0.2kg vôi/10 kg mạt cưa, Ủ đống 24 giờ. Sau đó, bổ sung các chất dinh dưỡng tuỳ nghiệm thức. Đóng bịch PP (19x28cm), mỗi bịch chứa 750g mạt cưa ẩm tương đương 400g mạt cưa khô. Khử trùng 1 atm, 2 giờ. Để nguôi 48 giờ. [19],[4],[8],[3] Cấy meo giống nấm vào nguyên liệu nuôi trồng - Cấy meo đã chuẩn bị trong chai gạo vào nguyên liệu đã chuẩn bị, cứ 1 chai meo cấy vào 20 bịch nguyên liệu. - Ở thí nghiệm này, các dòng đơn bào tử được cấy theo bảng sau Nguyên liệu Dòng MCĐQSD 1 2 3 4 MCĐQSD + 2% cám lúa 1 2 3 4 MCĐQSD + 6% cám lúa 1 2 3 4 MCĐQSD + 10% cám lúa 1 2 3 4 MCĐQSD + 2%o urê 1 2 3 4 MCĐQSD + 4%o urê 1 2 3 4 MCĐQSD + 10%o urê 1 2 3 4 MCĐQSD + 2% cám lúa + 2%o urê 1 2 3 4 MCĐQSD + 4% cám lúa + 4%o urê 1 2 3 4 MCĐQSD +10% cám lúa + 10%o urê 1 2 3 4 - Như vậy, ở đợt thí nghiệm này có tổng cộng 40 lô (40 nghiệm thức), mỗi lô thí nghiệm với 10 bịch, trong 10 bịch của mỗi lô: 5 bịch ủ tơ trong điều kiện không có ánh sáng, 5 Bước đầu nghiên cứu qui trình nuôi trồng nấm rơm lụa bạc Volvariella bombicina  Học viên thực hiện: Trần Thị Kim Dung Trang 42 bịch ủ tơ trong điều kiện ánh sáng khuyếch tán (200-300 lux). Tổng cộng đợt thí nghiệm này có 400 bịch. Nuôi ủ tạo hệ sợi tơ nấm Chăm sóc và thu đón quả thể Nuôi tơ nấm, chăm sóc và thu đón quả thể thực hiện như ở giai đoạn 1. 2.2.3 Phương pháp thí nghiệm cho đợt 3 - Chọn một dòng nấm cho hiệu suất cao nhất : Ở thí nghiệm này, tôi chọn dòng 3 - Chọn loại nguyên liệu cùng các thành phần bổ sung cho kết quả tốt nhất sau đợt nuôi cấy thứ nhất và thứ hai. Ở thí nghiệm này, tôi chọn môi trường MCĐQSD có bổ sung cám lúa 2% và ure 2%o - Cấy meo: Meo dòng 3 cấy trên môi trường gạo lứt đỏ. - Ủ nguyên liệu đã cấy meo trong 17 ngày trong phòng thông thoáng, có ánh sáng khuếch tán. - Sau 17 ngày, mở nút bịch, tưới phun sương ngày 4 lần - Sau 7 ngày (ngày thứ 25 kể từ khi cấy meo), tiến hành thu quả thể lần thứ nhất, cân trọng lượng quả thể thu được - Cột miệng bịch lại và rạch bỏ đáy bịch, tưới phun sương ngày 4 lần, đến ngày thứ 7 thu quả thể, cân trọng lượng quả thể thu được.