Vật liệu và phương pháp nghiên cứu cà rốt

34 PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Vật liệu: 3.1.1 Carrot: - Carrot (Daucus carota) được mua từ vựa nông sản Bình Điền, chúng được trồng tại các nhà vườn ở Đà Lạt. 3.1.2 Chế phẩm enzym: 3.1.2.1 Pectinase: Pectinex Ultra SP_L - Pectinex Ultra SP_L là tên thương mại của enzym pectinase có xuất xứ từ hãng Novo Đan Mạch do công ty Nam Giang cung cấp. - Pectinex Ultra SP_L được sản xuất từ loài Aspergillus aculeatus. Chế phẩm bao gồm các loại enzym pectinlyase, pectinesterase và polygalacturonase. Enzym có hoạt độ tối ưu ở nhiệt độ 35- 450C, pH trong khoảng 3.5 - 4.5, hoạt tính của chế phẩm là 26.000PG/ml. - Pectinex Ultra SP_L là chất lỏng màu nâu có mùi nhẹ của sản phẩm lên men. Khi bảo quản ở 200C, hoạt độ enzym vẫn ổn định trong 3 tháng. Nếu bảo quản lâu hơn thì hoạt tính enzym giảm 1 -2% mỗi tháng. 3.1.2.2 Hemicellulase: Viscozym L - Chế phẩm Viscozym L là tên thương mại của enzym hemicellulase có xuất xứ từ hãng Novo Đan Mạch do công ty Nam Giang cung cấp. - Viscozym L được sản xuất từ loài Aspergillus aculeatus. Sản phẩm gồm nhiều enzym khác nhau như: β-glucanase, arabanase, xylanase, cellulase và hemicellulase. - Enzym có pH tối ưu trong khoảng 4.5 - 5.5, nhiệt độ 40 - 500C, hoạt tính của chế phẩm 700UI/ml. Nhiệt độ bảo quản ở 0 - 100C 35 3.1.2.3 Cellulase: Cellulast 1.5 L - Cellulast 1.5L là tên thương mại của enzym cellulase có xuất xứ từ hãng Novo Đan Mạch. Cellulast 1.5L được sản xuất từ loài Trichoderma reesi . Enzym nầy hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 40 - 500C và pH nằm trong khoảng 4.5 - 5.5. Hoạt tính của chế phẩm là 700UI/ml. 3.2 Phương pháp phân tích: 3.2.1 Phương pháp xác định độ ẩm (phương pháp sấy khô): ª Nguyên tắc: Dùng sức nóng làm bay hết hơi nước trong nguyên liệu (mẫu), cân trọng lượng mẫu trước và sau khi sấy. Trọng lượng mẫu mất đi khi sấy khô tuyệt đối là lượng nước có trong mẫu. Từ đó tính ra phần trăm lượng nước có trong mẫu.[13] ª Tiến hành: Cân khoảng 2-5g mẫu gói vào giấy nhôm đã sấy khô. Cân lượng mẫu và giấy trước khi sấy (m1). Sấy cho đến trọng lượng không đổi, làm nguội trong bình hút ẩm và cân (m2).[20] ª Tính kết quả: Độ ẩm của mẫu (X) tính theo công thức: M: khối lượng mẫu trước khi phân tích (g) m1: khối lượng mẫu và giấy nhôm trước khi sấy (g) m2: khối lượng mẫu và giấy nhôm sau khi sấy đến trọng lượng không đổi (g) X: độ ẩm của mẫu (%)[20] 3.2.2 Phương pháp xác định đường tổng: phương pháp Phenol ª Nguyên tắc: thực hiện phản ứng tạo màu giữa đường tổng trong mẫu nghiên cứu với thuốc thử phenol khi có sự hiện diện của H2SO4. Cường độ màu được đo bằng máy quang phổ so màu ở bước sóng 490nm. Dựa vào đồ thị chuẩn X = (m1 – m2) . M 100 36 của saccharose tinh khiết với thuốc thử, tính ra hàm lượng đường tổng của mẫu nghiên cứu.[16] ª Thực hiện: Chiết đường từ mẫu thí nghiệm: Nghiền nguyên liệu càn định lượng sau đó cân 1g mẫu phân tích cho vào becher 100ml. Thêm vào 20ml cồn 960, đặt lên nồi cách thủy, đun sôi 3 lần, mỗi lần sôi lấy ra để nguội rồi để lại trên bếp. Khuấy đều, để nguội, lọc qua giấy lọc (không cho cặn đổ lên giấy lọc). Sau đó thêm 10 ml cồn 800 vào becher đựng mẫu, khuấy đều, đun 2 lần tới sôi trên nồi cách thủy, để nguội, lọc, tiếp tục làm như vậy khoảng 2-3 lần. Sau đó đưa cặn lên giấy lọc, tráng cốc 2-3 lần bằng cồn 800 nóng (nước tráng cũng cho cả lên lọc). Dịch lọc cho bay hơi cồn ở nhiệt độ phòng hoặc đun nhẹ trên nồi cách thủy. Cặn khô được hoà tan vào nước đến 50ml. Khi làm hiện màu có thể pha loãng nếu nồng độ đường quá cao.[13] Xây dựng đường chuẩn Lấy 7 bình định mức 100ml, cho vào đó theo thứ tự: 1,2,3,4,5,6 và 7ml dung dịch saccharose 0,1%, cho nước cất tới vạch mức. Từ mỗi bình hút ra 1ml, cho thêm 1ml dung dịch phenol 5%. Cẩn thận cho thêm 5ml H2SO4 đậm đặc. Để 10 phút rồi lắc đều, giữ tiếp 10-15 phút ở nhiệt độ phòng để xuất hiện màu. Trong mỗi ống nghiệm sẽ có tương ứng 10, 20, 30, 40, 50, 60 và 70μg saccharose. Đem đo mật độ quang ở bước sóng λ= 490 nm, vẽ đồ thị chuẩn. Xác định đường trong mẫu: hút 1ml dung dịch đường cần xác định, tiến hành tương tự như bước xây dựng đường chuẩn saccharose.[13] ª Tính kết quả: Hàm lượng đường tổng số chứa trong 100g mẫu được tính theo công thức: Trong đó: x: Hàm lượng đường tương ứng trên đường chuẩn (μg/ml). k: Hệ số pha loãng. x.10-6.k.V.100 v.m ĐT = 37 V: Thể tích dịch đường ban đầu (ml). v: Thể tích mẫu đem phân tích (ml). m: Trọng lượng mẫu (g).[13] 3.2.3 Định lượng đường khử theo phương pháp Miller: ª Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử 3,5- dinitrosalisylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử. Dựa theo đồ thị chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử acid dinitrosalisylic ta sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.[23] ª Hoá chất: - Thuốc thử acid dinitrosalisylic (DNS): cân 1g DNS pha trong 20ml dung dịch NaOH 2N, thêm vào 50ml nước cất và 30g muối sodium potassium tartrate. Đun nhẹ cho tan rồi định mức tới 100ml. - Dung dịch glucose mẫu (500γ/ml): cân 0.5g D-glucose pha trong nước cất thành 1 lít. ª Thực hiện: - Dựng đồ thị chuẩn glucose: Từ dung dịch glucose chuẩn, pha các dung dịch glucose chuẩn có nồng độ từ 50-250 (γ/ml). Bảng 3.1: Dựng đồ thị chuẩn glucose Nồng độ glucose (mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 dd glucose (0.5 mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Nước cất (ml) 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 dd DNS (ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 - Lắc đều và đem đun cách thủy ở 1000C trong 3 phút, làm nguội và thêm 5 ml nước cất. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 530nm trên máy quang phổ. Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang, trục hoành là nồng độ glucose. 38 - Tiến hành thí nghiệm: phản ứng của dung dịch đường cần phân tích với thuốc thử DNS được tiến hành như trong phần xây dựng đồ thị chuẩn. Nồng độ đường trong mẫu được xác định nhờ vào đường chuẩn glucose đã dựng.[40] 3.2.4 Phương pháp xác định pectin: ª Nguyên tắc: - Trong môi trường kiềm loãng, pectin hoà tan sẽ giải phóng ra nhóm methoxyl thành rượu methylic và acid pectic tự do. Acid pectic tự do trong môi trường khi có mặt acid acetic sẽ kết hợp với CaCl2 thành dạng muối kết tủa canxi pectat. Từ hàm lượng muối kết tủa có thể tính được hàm lượng pectin có trong mẫu phân tích.[16] ª Hoá chất: - Dung dịch CaCl2 2N: hòa tan 230-250g CaCl2 trong 1000ml nước cất - NaOH 0.1N - CH3COOH 1N - AgNO3 [13] ª Tiến hành: Xác định hàm lượng pectin trong mẫu nguyên liệu Cân 5g nguyên liệu, thêm 100ml nước cất, đun cách thủy ở 900C trong 3 giờ, thêm H2O đủ thể tích bằng 100ml. Lấy 20ml dung dịch này cho vào erlen rồi thêm 100ml NaOH 0,1M để yên 7 giờ (có thể qua đêm). Sau đó thêm 50ml dung dịch CH3COOH 1M, sau 5 phút thêm 50ml dung dịch CaCl2 2M để yên 1 giờ. Đem đun sôi 5 phút và lọc qua giấy lọc đã được sấy khô đến trọng lượng không đổi, rửa kết tủa Ca-pectat bằng nước cất nóng cho đến khi nước rửa không còn ion Cl- (dùng dung dịch AgNO3 1% để thử Cl-). Sau khi sạch kết tủa, cho giấy lọc kết tủa vào chén cân và sấy khô ở 1050C cho đến trọng lượng không đổi. Sự khác nhau về trọng lượng giấy lọc chưa có và có kết tủa cho ta biết được trọng lượng của Ca_pectat. 39 Vì hàm lượng canxi trong Ca-pectat là 8% nên khi tính hàm lượng pectin ta phải nhân trọng lượng Ca-pectat với 0,92.[13] ª Tính kết quả: Hàm lượng pectin (P) tính theo công thức: P= [(B x 0,92 x 100)/m] x (V/v). Trong đó: B: Trọng lượng Ca-pectat (g). V: Tổng thể tích dung dịch chiết được (100ml). v: Thể tích dung dịch đem xác định (20ml). m: Trọng lượng mẫu (g).[18] 3.2.5 Phương pháp xác định cellulose: ª Nguyên tắc: Phương pháp định lượng cellulose dựa vào tính bền của chất này, không bị phân hủy dưới tác dụng của acid yếu, còn các chất khác thường đi kèm theo với cellulose như hemicellulose, lignin… ít bền hơn đối với tác dụng của acid và kiềm nên bị oxy hoá, phân giải và tan vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu bằng dung dịch kiềm hoặc bằng hỗn hợp acid nitric với acid acetic.[13] ª Hoá chất: - Acid nitric - Acid acetic - Rượu etylic 96%[23] ª Thực hiện: Cân m (g) mẫu đã nghiền nhỏ (đã sấy khô đến trọng lượng không đổi ở 100-105oC) cho vào bình nón dung tích 250 ml. Thêm vào bình 16,5 ml hỗn hợp gồm 1.5 ml acid nitric đặc và 15 ml acid acetic. Lắp ống làm lạnh hồi lưu vào bình và đun sôi hỗn hợp 30 phút. Để nguội, pha loãng hỗn hợp bằng nước nóng. Lọc qua giấy lọc đã biết trước trọng lượng. Rửa kết tủa cellulose nhiều lần bằng nước cất nóng (mỗi lần 10-15 ml). Rửa bằng rượu etylic 96% 1-2 lần. Rửa bằng 40 ete etylic. Sấy giấy lọc có chứa cellulose ở nhiệt độ 100-105oC đến trọng lượng không đổi (khoảng 2-3 giờ).[13] ª Tính kết quả: Hàm lượng cellulose được tính bằng công thức sau: Trong đó: X: Hàm lượng cellulose tính bằng %. a: Trọng lượng cellulose (g). m: Trọng lượng mẫu thí nghiệm (g). 100: Hệ số chuyển thành %.[29] 3.2.6 Phương pháp xác định lipid: ª Nguyên tắc: Dùng ete nóng để hoà tan tất cả chất béo tự do trong thực phẩm. Sau đó để bay hơi hết ete, cân chất béo còn lại và tính ra hàm lượng lipid trong 100g mẫu.[4] ª Hoá chất: - Ete dầu hỏa. - Na2SO4 khan.[13] ª Thực hiện: Cân m(g) nguyên liệu, đã được sấy khô đến trọng lượng không đổi. Cho tất cả nguyên liệu vào ống hình trụ bình cầu của máy. Cho diethyl eter vào khoảng ¾ bình. Lắp cột làm lạnh, cho nước chảy qua cột, đặt máy lên bếp cách thủy. Đun cách thủy để ly trích lipid đến khi eter trong ống hình trụ không màu. Lấy nguyên liệu ra và đem sấy khô đến trọng lượng không đổi.[13] a.100 m X = 41 ª Tính kết quả: Phần trăm lipid trong 100g nguyên liệu: %lipid = Trong đó: m: khối lượng nguyên liệu m1: Khối lượng trước khi li trích m2: khối lượng sau khi li trích.[13] 3.2.7 Xác định protein theo phương pháp Bradford: ª Nguyên tắc: Các protein khi phản ứng với xanh Comasie (Comassie Brilliant Blue- CBB) sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thu ánh sáng ở bước sóng 595 nm, cường độ màu tỉ lệ với nồng độ protein trong dung dịch.[13] ª Hoá chất: - Dung dịch protein cần xác định - Dung dịch albumin 1mg/ml: cân chính xác 10mg albumin pha trong 10 ml nước cất. Lắc đều cho tan. Giữ ở 200C, khi dùng pha loãng 100 lần, được dung dịch albumin có nồng độ 0.1mg/ml - Dung dịch thuốc thử Bradford: Comassie Brilliant Blue: 0.001g Ethanol 990: 4.7g Acid phosphoric 85%: 8.5g Phẩm màu Comassie Briliant Blue làm tan trong ethanol trong chai đựng có nắp, bổ sung acid phosphoric 85% và chỉnh tới 1000ml bằng nước cất.[4] ª Thực hiện: Chuẩn bị mẫu phân tích. Dựng đường chuẩn: m 100 . (m1 – m2) 42 Để dung dịch albumin chuẩn có các nồng độ từ 10 – 100 μg/ml ta thực hiện như sau: Bảng 3.2: Dựng đường chuẩn định lượng protein Dung dịch albumin (ml) 0 1 2 4 6 8 10 Nước cất (ml) 10 9 8 6 4 2 0 Nồng độ protein (μg/ml) 0 10 20 40 60 80 100 Hút 1 ml dung dịch albumin từ mỗi ống nghiệm trên và cho vào ống nghiệm mới, thêm 5ml thuốc nhuộm Bradford. Ống 1 ứng với thời gian xuất phát ban đầu 0 phút. Thực hiện phản ứng lần lượt ở các ống còn lại 2, 3, 4, 5, 6, mỗi ống cách nhau một phút, lắc đều. Sau 10 phút, đo OD ở bước sóng 595nm. Dựng đường chuẩn. Mẫu thí nghiệm được tiến hành tương tự như trên. Mẫu được pha loãng sao cho trị số mật độ quang đo được trong khoảng của đường chuẩn. Trị số mật độ quang của mẫu thí nghiệm trừ đi trị số mật độ quang của ống thử 0μg/ml, chiếu vào đường cong mẫu để suy ra lượng protein có trong dung dịch mẫu thí nghiệm (μg/ml)[4] 3.2.8 Phương pháp xác định độ tro: ª Nguyên tắc: - Dùng sức nóng (5500C-600oC) nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ. Chất vô cơ còn lại chính là phần tro. Đem cân và tính ra % tro có trong nguyên liệu.[13] ª Tiến hành: Cân chính xác khoảng 2-5g mẫu phân tích trong một chén sứ đã biết trọng lượng khô tuyệt đối, cho thêm 5 giọt HNO3 đậm đặc và 1-2 giọt H2O2 30%. Cho vào lò nung ở 500-5500C cho đến khi nguyên liệu biến thành tro trắng như tàn thuốc lá. Lặp lại như trên cho đến khi trọng lượng không đổi.[13] 43 ª Tính kết quả: Tổng lượng tro (%) = (G2 – G0 )x100/(G1 – G0) Trong đó: G0 : Trọng lượng của chén nung (g) G1 : Trọng lượng của chén nung và mẫu thử (g) G2 : Trọng lượng của chén và tro trắng sau khi nung (g).[13] 3.2.9 Phương pháp xác định vitamin C: bằng phương pháp chuẩn độ iod: ª Nguyên tắc: - Iod bị khử bởi vitamin C. Dựa vào lượng Iod bị khử bởi vitamin C có trong mẫu, suy ra hàm lượng vitamin C.[20] ª Hoá chất: - Dung dịch HCl 5% - Dung dịch Iod 0.01N - Dung dịch tinh bột 1%[20] ª Thực hiện: - Cân 5 g mẫu, nghiền trong cối sứ với 5ml HCl 5% cho đến khi thành dạng đồng thể rồi chuyển vào bình định mức, cho nước đến vạch 50ml, khuấy đều, lọc. Cho 20ml dịch lọc vào erlen, cho thêm vài giọt hồ tinh bột 1%. Chuẩn độ đến khi bắt đầu xuất hiện màu xanh thì dừng lại.[20] ª Tính kết quả: Hàm lượng vitamin C trong 100g nguyên liệu: X% = Trong đó: V: số ml dung dịch iod 0.01N dùng để chuẩn độ V1: thể tích tổng số dịch mẫu (50ml) V2: thể tích mẫu lấy để xác định (20 ml) m: số gram nguyên liệu dùng để chiết vitamin C (5g) V .V1 . 0,00088 . 100 V2 . m 44 0,00088: số gram vitamin C tương ứng với 1 ml dung dịch iod 0,01N.[20] 3.2.10 Phương pháp xác định độ chua: - Độ chua bao gồm các acid có trong thực phẩm, các acid này hoặc có sẵn trong nguyên liệu hoặc được thêm vào hoặc được sinh ra trong quá trình chế biến. Độ acid toàn phần bao gồm tất cả các acid có thể định lượng được bằng dung dịch kiềm chuẩn, chủ yếu là các acid hữu cơ như acid acetic, citric, malic… Khí CO2, SO2 có thể ảnh hưởng đến độ chua thực phẩm nên cần loại bỏ khí CO2, SO2 trong nước pha mẫu. ª Nguyên tắc: - Độ chua (lượng acid tổng số) có trong thực phẩm có thể định lượng bằng dung dịch kiềm chuẩn NaOH để đưa pH tới 8.2, dùng chất chỉ thị màu là phenolphtalein 1%.[20] ªHoá chất: + Dung dịch NaOH 0.1N + Dung dịch phenolphtalein 1% pha trong cồn 900 + Nước cất đun sôi để loại khí CO2 và SO2[20] ª Thực hiện: - Cân m(g) nguyên liệu xay nhuyễn, lắc với nước trung tính trong 1 giờ. Sau đó cho nước trung tính vừa đủ 100ml. Để lắng, lấy 25ml nước trong để chuẩn độ bằng NaOH 0.1N với 5 giọt chỉ thị phenolphtalein cho dến khi dịch thử có màu hồng nhạt bền vững.[20] ª Tính kết quả: Độ acid toàn phần theo phần trăm (X1) tính theo công thức: X1 = V x (V1/v) x (100/m) x N Trong đó: V: Thể tích NaOH 0,1N chuẩn độ (ml) N: Nồng độ NaOH (1/10N) m: Trọng lượng mẫu (g). 45 V1:Tổng thể tích mẫu ban đầu (100 ml). v: Thể tích mẫu đem phân tích (25 ml).[20] 3.2.11 Phương pháp xác định pH: - Thực hiện: Cân 5g nguyên liệu hoà tan trong 50ml nước, dùng que thuỷ tinh khuấy đều. Để lắng sau 1 giờ, lấy dịch trong đo với máy đo pH.[23] 3.2.12. Xác định nồng độ chất khô trong dung dịch bằng khúc xạ kế: - Khúc xạ kế là dụng cụ dùng để xác định hàm lượng chất khô có trong mẫu thí nghiệm. Dụng cụ nầy hoạt động dựa trên nguyên tắc là độ lệch giữa tia khúc xạ và tia tới khi chiếu qua mẫu (dạng lỏng) sẽ phụ thuộc vào nồng độ chất khô của mẫu. Đơn vị đo được tính theo độ Brix (0Br).[23] 3.2.13. Phương pháp đánh giá cảm quan: - Phân tích cảm quan thực phẩm là phương pháp sử dụng các cơ quan cảm giác của con người để tìm hiểu, mô tả và định lượng một số tính chất của thực phẩm như màu sắc, hình thái và cấu trúc, mùi, vị.[29] - Phương pháp phân tích cảm quan được xác định trên cơ sở các cơ quan giác quan như dụng cụ đo. Kết quả đo được dưới giá trị ước lượng, so sánh hoặc mô tả. Do vậy, độ tin cậy của các kết quả phân tích cảm quan chỉ có giá trị khi được xử lý dựa trên các nguyên tắc xác suất thống kê.[30] - Các chỉ tiêu cảm quan thường là: mùi, vị, màu sắc và trạng thái tương ứng với các giác quan: khứu giác, vị giác, thị giác, xúc giác.[30] Trong luận văn nầy chúng tôi sử dụng phương pháp so hạng để xếp loại sản phẩm. - Mỗi thành viên sẽ tiến hành phân tích P mẫu và xếp hạng các mẫu lần lượt từ 1 đến P. Hạng 1 tương ứng với mẫu được ưa thích nhất và hạng P tương ứng với mẫu kém ưa thích nhất.[30] - Sau đó cộng tổng số hạng của tất cả các thành viên tham gia đánh giá cảm quan ứng với từng mẫu phân tích và sử dụng tiêu chuẩn Friedman để kiểm định sự tương thích của kết quả đánh giá cảm quan thu được. Cụ thể như sau: 46 Gọi J là số thành viên tham gia đánh giá cảm quan. P: là số mẫu sản phẩm. Ri: là tổng số hạng của sản phẩm thứ i. Tính giá trị F bằng công thức: F = Tra bảng Friedman cho sai số 5%. Nếu F tính > F tra: có thể kết luận các mẫu được ưa thích với mức độ khác nhau và sự khác nhau đó là có ý nghĩa.[30] 3.3 Sơ đồ nghiên cứu: Sơ đồ 2: Quy trình nghiên cứu tổng quát Nghiên cứu sử dụng tổ hợp 2 và 3 chế phẩm enzym thủy phân nhằm tăng hiệu suất thu hồi chất chiết trong nước carrot. Tổng quan tài liệu Chuẩn bị nguyên liệu Nghiên cứu sử dụng từng chế phẩm enzym thủy phân (pectinase, cellulase, hemicellulase) nhằm tăng hiệu suất thu hồi chất chiết trong nước carrot. Đánh giá cảm quan sản phẩm 12 J * P (P+1) (R12 +R22 +R32 +...+ Rp2) - 3J(P + 1) Kết luận 47 3.3.1 Nội dung nghiên cứu: ªMục tiêu nghiên cứu: Nâng cao hiệu suất thu hồi chất chiết trong quy trình công nghệ sản xuất nước carrot bằng cách chọn chế phẩm enzym thích hợp. ª Sơ đồ thu nhận nước carrot: Sơ đồ 3: Sơ đồ thu nhận nước carrot Chọn củ tươi Rửa Cắt thành khúc Chần với nước ở nhiệt độ 800C, thời gian 10 phút Xay Xử lí enzym Tách bã Phối chế Carrot Sản phẩm Bã Chế phẩm pectinase, hemicellulase, cellulase 48 3.3.2 Phân bố thí nghiệm: 3.3.2.1 Sử dụng 1 chế phẩm enzym: Để tăng hiệu suất thu hồi chất chiết trong quy trình sản xuất nước carrot, chúng tôi tiến hành khảo