Vật liệu và phương pháp nghiên cứu cây dứa

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. VẬT LIỆU 3.1.1. Chế phẩm enzyme thô Chồi trên quả dứa và quả dứa Chồi cắt sát quả dứa, bỏ lá bên ngoài. Quả xanh cắt bỏ vỏ lấy các phần mắt dứa, thịt dứa và chồi dứa. Hình 3.2: Mắt dứa Hình 3.1: Chồi dứa Hình 3.3: Thịt dứa Hình 3.4: Cùi dứa . Hóa chất Hóa chất để tủa enzyme: Cồn 96o, muối ammonium sulphate và aceton. Dung dịch đệm phosphate : NaH2PO4.12H2O, NaH2PO4. Hóa chất xác định hàm lượng protein: thuốc thử Bradfosd. Hóa chất xác định hoạt tính enzyme. Hóa chất dung trong phương pháp sắc ký: Bio-Gel P-100. Hóa chất để cố định enzyme: Đệm phosphate 0.1 M pH 7 CaCl2 0.02 M Acid acetic 1% Các hóa chất dùng trong phương pháp điện di. 3.1.3. Thiết bị Máy đo quang phổ UV – Vis Máy ly tâm Máy xay dứa Máy đo pH Bể ổn nhiệt Hình 3.5: Máy xay dứa Hình 3.6: Máy đo pH Cân phân tích Tủ sấy Ống nghiệm Bình tam giác Giấy lọc Hình 3.7: Cân phân tích Hình 3.8: Máy đo quang UV–Vis Phễu lọc Đũa khuấy Pipept thủy tinh: 1ml, 2ml, 5ml, 10ml Pipet man các loại Đầu típ các loại Cốc thủy tinh 100ml, 250ml Giá đựng ống nghiệm Tủ sấy Ống đong 50ml, 100ml, 500ml Tủ lạnh Xi lanh Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp Bio-Rad, Mỹ Các dụng cụ chạy điện di Hình 3.10: Bể ổn nhiệt Hình 3.9: Máy ly tâm Hình: Tủ lạnh 3.2. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.2.1. Chiết thô enzyme từ chế phẩm dứa Cân 500g bộ phận thịt dứa, xay nhuyễn, lọc hỗn hợp qua vải thô, tách bằng nước thu được dịch gọi là enzyme thô. Cân 500g bộ phận mắt dứa, xay nhuyễn, lọc hỗn hợp qua vải thô, tách bằng nước thu được dịch gọi là enzyme thô. Cân 500g bộ phận cùi dứa, xay nhuyễn, lọc hỗn hợp qua vải thô, tách bằng nước thu được dịch gọi là enzyme thô. Cân 500g bộ phận chồi dứa, xay nhuyễn, lọc hỗn hợp qua vải thô, tách bằng nước thu được dịch gọi là enzyme thô. Dịch lọc thu được đem ly tâm lạnh ở 150 C 5000 vòng/phút trong 10 phút. Loại bỏ cặn và thu lấy dịch. Thu được thể tích 900 ml đối với thịt dứa, 900 ml với mắt dứa, 1000 ml với cùi dứa và 1200 ml với chồi dứa. Bảo quản lạnh ở 50 C. Hình 3.11: Dịch chiết thô sau khi ly tâm 3.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng protein và hoạt tính bromelain từ dịch chiết enzyme thô Dịch chiết enzyme thô ở mục 3.2.1 : chồi dứa, mắt dứa, thịt dứa và cùi dứa được xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford và hoạt tính theo phương pháp Amano. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford Bradford là một trong những phương pháp để xác định hàm lượng protein. Phương pháp này có một số ưu điểm như sau: Dễ sử dụng (chỉ cần một loại thuốc thử). Độ nhạy cao (có thể phát hiện protein ở 1 – 20μg). Phức chất giữa thuốc nhuộm và protein tương đối ổn định. Phương pháp này ít bị cản trở bởi các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu protein. Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại và sự thay đổi màu xảy ra khi Coomasie Brilliant Blue liên kết với protein trong dung dịch acid. Trong dung dịch manh tính acid, khi không kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng cực đại ở 465nm. Khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu bước sóng cực đại ở 595nm. Độ hấp thu ở bước sóng 595nm liên hệ trực tiếp với nồng độ protein. Dạng proton hóa của thuốc nhuộm Coomasie Brilliant Blue có màu xanh. Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tương tác với tất cả các nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein. Trong môi trường của gốc mang điện tích dương, sự proton hóa không xảy ra và màu xanh xuất hiện. Màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và ổn định trong gần 1 giờ. Hóa chất và thiết bị Hóa chất Dung dịch mẫu protein cụ thể trong bài này là mẫu enzyme bromelain cần xác định. Dung dịch albumin chuẩn (0.1 mg/ml): cân chính xác 10mg albumin, thêm 50ml nước cất khuấy tan albumin. Cho toàn bộ dung dịch trên vào bình định mức 100 dẫn nước tới vạch → dung dịch albumin chuẩn có nồng độ 0.1 mg/ml. Giữ ở –200C. Dung dịch thuốc thử Bradford: có thành phần trong 100ml như sau: Coomasie Brilliant Blue (CBB) 0.001g Ethanol tuyệt đối 4.7g Acid phosphoric 85%: 8.5g Phẩm màu CBB được làm tan trong ethanol trong một chai đựng màu tối có nắp. Bổ sung acid phosphoric và chỉnh tới 100ml bằng nước cất. Lắc đều. Bảo quản ở 40C. Thiết bị Máy đo quang phổ UV – Vis. Các bước tiến hành Xây dựng đường chuẩn Albumin Chuẩn bị các ống đánh số từ 0 đến 10. Bảng 3.1: Bảng số liệu dựng đường chuẩn Albumin Ống nghiệm Đối chứng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Nồng độ albumin (μg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Dung dịch albumin (mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 Nước cất (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Thuốc thử Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Lắc đều các ống nghiệm, tiến hành đo OD dung dịch trong các ống nghiệm bằng máy đo quang phổ UV-Vis. Trị số mật độ quang phổ (OD) của các ống từ 1 đến 10 sau khi trừ đi trị số ống đối chứng (ống 0) sẽ xây dựng được đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang phổ (∆OD) theo nồng độ protein chuẩn (μg/ml). Xác định nồng độ protein của mẫu Dịch chiết enzyme thô của các bộ phận từ cây dứa ở thí nghiệm 1 cũng được tiến hành tương tự như trên. Thay dung dịch albumin bằng mẫu enzyme cần định lượng, mẫu được pha sao cho trị số mật độ quang đo được nằm trong khoảng của đường chuẩn. Tương tự như vậy, trị số mật độ quang của mẫu thí nghiệm cũng trừ đi trị số mật độ quang của ống đối chứng, rồi chiếu vào đường chuẩn để suy ra lượng protein có trong dung dịch mẫu thí nghiệm (μg/ml). Tính kết quả Tổng hàm lượng protein trong M (g) chế phẩm thô được tính theo công thức: mg protein = b*10-3*m*M Với: b: nồng độ protein trong mẫu suy ra từ đường chuẩn (μg/ml). m: hệ số pha loãng. M: khối lượng chế phẩm enzyme thô (g). 3.2.2.2. Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Amano Nguyên tắc: Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lương Tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enzyme. Hoạt động của enzyme được biểu diễn bằng đơn vị hoạt tính thủy phân protein của enzyme. Hoá chất và thiết bị Hóa chất: HCl 0.1 M Na2CO3 0.4 M Dung dịch TCA 0.4 M Tyrosin tinh khiết Thuốc thử Folin Đệm phosphate pH 7 0.1 M Dung dịch casein 1% : Cân 1g casein them vào 100ml dung dịch đệm phosphate 0.1 M pH 7 Thiết bị và dụng cụ: Ống nghiệm Pipette Bình định mức Giấy lọc Bể ổn nhiệt Máy đo quang phổ UV – Vis Máy đo pH Các bước tiến hành  Xây dựng đường chuẩn Tyrosin Bảng 3.2 : Bảng số liệu dựng đường chuẩn Tyrosin Ống nghiệm Đối chứng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Nồng độ (μg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Dung dịch Tyrosin chuẩn (μl) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Dung dịch HCl (μl) 1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910 900 Na2CO3 (ml) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Thuốc thử Folin (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Pha dung dịch Tyrosin ở các nồng độ khác nhau : 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 μgTyrosin/ml như bảng. Thêm 5ml dung dịch Na2CO3 0.4 M vào dung dịch Tyrosin ở các nồng độ khác nhau ở trên và thêm 1ml thuốc thử Folin vào dung dịch hỗn hợp. Sau khi trôn đều, để yên dung dịch ở 370C trong 20 phút . Đo độ hấp thụ của dung dịch này ờ bước sóng 660nm. Ghi nhận kết quả As10, As20, As30, As40, As50, As60, As70, As80, As90, As100 . Đối với ống đối chứng: dùng 1ml acid HCl 0.1 M thay cho Tyrosin. Đo độ hấp thu của dung dịch này ở bước sóng 660nm, ghi nhận kết quả là Aso . Trị số mật độ quang của các ống từ 1 – 10 sau khi trừ đi trị số của ống đối chứng sẽ được giá trị ∆OD1 - ∆OD10 . Vẽ đồ thị dựa vào biến thiên ∆OD theo nồng độ protease. Đồ thị này gọi là đường chuẩn Tyrosin. Xác định hoạt tính enzyme protease Cho 1ml dung dịch casein 1% vào ống nghiệm, ủ ở 370 C trong 10 – 15 phút. Sau đó, cho 1ml dịch chiết enzyme thô vào lắc đều. Đem ủ hỗn hợp này ở 370 C trong 60 phút. Cho vào 2ml dung dịch TCA 0.4 M để ngừng phản ứng enzyme. Để yên dung dịch trong 25 phút, sau đó lọc dung dịch này qua giấy lọc để loại tủa. Sau đó cho 5ml dung dich Na2CO3 vào 1ml dịch lọc. Thêm 1ml thuốc thử Folin. Trộn đều để yên trong 20 phút. Sau đó đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 660nm ( ghi nhận kết quả này là Am) Mẫu đối chứng: lấy 1ml nước cất thay cho 1ml dung dịch enzyme và tiến hành các bước tương tự như với mẫu thì nghiệm với cùng điều kiện.Ghi nhận kết quả này là A0. Hàm lượng Tyrosin được giải phóng do protease thủy phân được tính bằng cách lấy (Am – A0) rồi lấy kết quả so với đường chuẩn Tyrosin để xác định hoạt độ protease theo công thức sau : Một đơn vị hoạt tính ( ĐVHT ) enzyme protease được xác định là lượng enzyme để tạo ra lượng amino acid tương đương với 100 μg Tyrosin trong 1 μl dịch lọc dưới điều kiện thí nghiệm. Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/ml) Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/mg) Trong đó: F: lượng Tyrosin có trong đường chuẩn(μg). n: hệ số pha loãng của enzyme. M: khối lượng chế phẩm enzyme thô. 1/100: hệ số chuyển pha. A0 : Độ hấp thụ của ống đối chứng. Am : Độ hấp thụ của mẫu. Tính hoạt tính riêng (HTR) của enzyme protease Từ kết quả hàm lượng protein và hoạt tính enzyme protease tính hoạt tính riêng enzyme protease. HTR = Số đơn vị hoạt tính/ mg protein enzyme (ml/mg) 3.2.3. Tách enzyme bằng các phương pháp tủa bằng cồn 960, muối Ammonium sulfate (NH4)2SO4 và aceton (CH3COCH3) 3.2.3.1. Nguyên tắc Các điều kiện thí nghiệm được tiến hành trong môi trường lạnh nhằm tránh làm mất hoạt tính enzyme và kết tủa thu được tốt hơn. Cho tác nhân tủa đã làm lạnh vào dung dịch enzyme cần tủa giữ ở nhiệt độ lạnh vào bình tam giác. Lắc đều hỗn hợp, để yên trong tủ lạnh 40 phút. Sau đó đem ly tâm lạnh, lấy cặn hòa lại trong dung dịch đệm, bảo quản lạnh. 3.2.3.2. Phương pháp thí nghiệm tủa enzyme bằng cồn 960 Cho dịch lọc là bộ phận chồi dứa ở mục 3.2.1 tủa bằng cồn 960 đã được làm lạnh trước theo các tỷ lệ khác nhau. Bảng 3.3: Tỉ lệ tủa bằng cồn 960 đối với dịch enzyme từ chồi dứa Dịch enzyme từ chồi (ml) 40 40 40 40 40 40 Cồn lạnh 960 40 80 120 160 200 240 Dịch enzyme :Cồn 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 Cách tiến hành: Cho dung dịch enzyme vào bình tam giác. Cho từ từ lượng cồn 960 đã được làm lạnh vào bình tam giác chứa dịch enzyme. Thể tích enzyme và cồn 960 tương ứng với mỗi tỉ lệ như bảng trên. Khuấy đều. Để tủ lạnh 40 phút ở nhiệt độ 50C. Lấy dịch đem ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút, nhiệt độ 50C. Thu tủa. Hòa trong 2ml dung dịch đệm phosphate 0.1 M pH 7. Cho enzyme vào lọ nhỏ, bảo quản ở nhiệt độ 50C. 3.2.3.3. Phương pháp thí nghiệm tủa bằng muối Ammonium sulfate (NH4)2SO4 Cho dịch lọc là bộ phận chồi dứa ở mục 3.2.1 tủa bằng muối theo các nồng độ % khác nhau. Bảng 3.4: Nồng độ tủa bằng muối (NH4)2SO4 đối với dịch enzyme từ chồi dứa Dịch enzyme từ chồi (ml) 40 40 40 40 40 40 40 Nồng độ muối (%) 50 55 60 65 70 75 80 Cách tiến hành: Cho dung dịch enzyme vào bình tam giác. Cho từ từ lượng muối đã cân vào bình tam giác chứa dịch enzyme. Thể tích enzyme và nồng độ muối Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) tương ứng như bảng trên. Khuấy đều. Để tủ lạnh 40 phút ở nhiệt độ 50C. Lấy dịch đem ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút, nhiệt độ 50C. Thu tủa. Hòa trong 2ml dung dịch đệm phosphate 0.1 M pH 7. Cho enzyme vào lọ nhỏ, bảo quản ở nhiệt độ 50C. 3.2.3.4. Phương pháp thí nghiệm tủa bằng aceton (CH3COCH3) Bảng 3.5: Tỉ lệ tủa bằng aceton đối với dịch enzyme từ chồi dứa Cho dịch lọc là bộ phận chồi dứa ở mục 3.2.1 tủa bằng aceton đã được làm lạnh trước theo các tỷ lệ khác nhau. Dịch enzyme từ chồi (ml) 40 40 40 40 40 40 Aceton lạnh 40 80 120 160 200 240 Dịch enzyme : Aceton 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 Cách tiến hành: Cho dung dịch enzyme vào bình tam giác. Cho từ từ lượng aceton đã được làm lạnh vào bình tam giác chứa dịch enzyme. Thể tích enzyme và aceton tương ứng với mỗi tỉ lệ như bảng trên. Khuấy đều. Để tủ lạnh 40 phút ở nhiệt độ 50C. Lấy dịch đem ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút, nhiệt độ 50C. Thu tủa. Hòa trong 2ml dung dịch đệm phosphate 0.1 M pH 7. Cho enzyme vào lọ nhỏ, bảo quản ở nhiệt độ 50C. 3.2.4. Phương pháp xác định tỉ lệ cồn 960, nồng độ muối (NH4)2SO4 và tỉ lệ aceton tối ưu để tủa enzyme bromelain Dịch tủa thu được từ việc tủa dịch chiết enzyme thô (chồi dứa) bằng cồn 960, muối (NH4)2SO4 và aceton được xác định hàm lượng bằng phương pháp Bradford và hoạt tính protease bằng phương pháp Amano (ở nhiệt độ 370C, pH=7) như mục 3.2.2. Tính kết quả và vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên tỉ lệ cồn 960, nồng độ muối (NH4)2SO4 và tỉ lệ aceton. Từ đó tìm ra tỉ lệ cồn 960, nồng độ muối (NH4)2SO4 và tỉ lệ aceton tối ưu cho việc tủa enzyme bromelain. 3.2.5. Phương pháp xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt động của enzyme bromelain Dịch hòa tan tủa thu được sau khi tủa dịch chiết thô chồi dứa với cồn 960, muối (NH4)2SO4 và aceton tối ưu ở mục 3.2.4 được xác định hoạt tính bromelain theo phương pháp Amano ở các giá trị pH, nhiệt độ và thời gian ủ khác nhau. . Xác định pH tối ưu cho hoạt động của bromelain Khảo sát hoạt tính bromelain ở các giá trị pH : 6, 7, 8, 9, 10 trong cùng điều kiện nhiệt độ 370 bằng phương pháp Amano như ở mục 3.2.2.2. Tính kết quả và vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên để tìm giá trị pH nào cho hoạt động của bromelain mạnh nhất thì đó là pH tối ưu cho hoạt động của enzyme. . Xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của bromelain Khảo sát hoạt tính bromelain ở các giá trị nhiệt độ : 30, 40, 50, 60, 70, 80 trong cùng điều kiện pH (pH tối ưu được xác định ở mục 3.2.5.1) bằng phương pháp Amano như ở mục 3.2.2.2. Tính kết quả và vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên để tìm giá trị nhiệt độ nào cho hoạt động của bromelain mạnh nhất thì đó là nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme. . Khảo sát độ bền nhiệt Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme bromelain bằng phương pháp Amano như ở mục 3.2.2.2 bằng cách giữ nguyên các hàm lượng cơ chất, pH=7. Tuy nhiên ủ enzyme và casein ở cùng nhiệt độ 370C trong các khoảng thời gian 60 phút, 80 phút, 100 phút, 120 phút, 140 phút, 160 phút, 180 phút. Các bước tiếp theo tiến hành tương tự. Tính kết quả và vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên để xem ảnh hưởng của thời gian lên hoạt động phân giải của enzyme bromelain. 3.2.6. Cố định enzyme bromelain trên cơ chất Natrialginate bằng phương pháp nhốt 3.2.6.1. Tạo dung dịch Natrialginate 3% Cân 1.5g Natrialginate hòa tan trong 50ml dung dịch đệm phosphate 0.1 M pH=7. Khuấy đều đến khi tất cả Natrialginate hòa tan hoàn toàn là được. 3.2.6.2. Tiến hành cố định Cân 1,5g enzyme bromelain hòa tan trong dung dịch Natrialginate 3%. Dùng ống Xilanh có đầu kim tiêm (0,3mm), hút dung dịch enzyme hòa tan này, nhỏ từ độ cao 20cm vào trong 200ml dung dịch 0.02 M CaCl2 cùng với sự khuấy lien tục dung dịch này với máy khuấy từ để tạo gel. Quá trình tạo gel xảy ra trong 2h, ở nhiệt độ phòng. Sau khi cố định, dung giấy lọc, lọc enzyme đã được cố định. Kết quả thu được hạt enzyme bromelain được nhốt trong khuôn gel. Dịch lọc thu được đem đi xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford. 3.2.6.3. Phương pháp xác định hiệu suất cố định protein và hiệu suất cố định hoạt tính của enzyme cố định Phương pháp xác định hiệu suất cố định protein của enzyme cố định Hiệu suất cố định protein được xác định theo công thức sau: Trong đó: C0: Nồng độ protein ban đầu (µg/ml). V0: Thể tích ban đầu của dung dịch enzyme (ml). Cf: Nồng độ protein trong tổng phần nước lọc (µg/ml). Vf: Tổng thể tích của phần nước lọc (ml). H: Hiệu suất cố định protein (%). Phương pháp xác định hiệu suất cố định hoạt tính của enzyme cố định Hiệu suất cố định hoạt tính enzyme được xác định theo công thức sau: η Trong đó: E0: Hoạt tính enzyme trước khi cố định (U/ml). V0: Thể tích dùng để cố định (ml). Cf: Hoạt tính enzyme sau khi cố định (U/ml). Vf: Thể tích enzyme còn lại sau khi cố định (ml). η: Hiệu suất cố định hoạt tính (%). 3.2.7. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố lý hóa đến hoạt tính của enzyme bromelain được cố định trên Natrialginate 3.2.7.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH Khảo sát hoạt tính bromelain ở các giá trị pH : 6, 7, 8, 9, 10 trong cùng điều kiện nhiệt độ 370 bằng phương pháp Amano như ở mục 3.2.2. Tuy nhiên, thay vì 1 ml dung dịch enzyme thì ở thí nghiệm này là 1 g enzyme cố định. Tính kết quả và vẽ đồ thị biểu diễn để tìm giá trị pH nào cho hoạt động của bromelain mạnh nhất thì đó là pH tối ưu cho hoạt động của enzyme cố định. 3.2.7.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ Khảo sát hoạt tính bromelain ở các giá trị nhiệt độ : 30, 40, 50, 60, 70, 80 trong cùng điều kiện pH (pH tối ưu được xác định ở thí nghiệm trên) bằng phương pháp Amano như ở mục 3.2.2. Tuy nhiên, thay vì 1 ml dung dịch enzyme thì ở thí nghiệm này là 1 g enzyme cố định. Tính kết quả và vẽ đồ thị biểu diễn để tìm giá trị nhiệt độ nào cho hoạt động của bromelain mạnh nhất thì đó là nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme cố định. 3.2.7.3. Khảo sát độ bền nhiệt Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme bromelain bằng phương pháp Amano như ở mục 3.2.2 bằng cách giữ nguyên các hàm lượng cơ chất, pH=7. Thay cho 1 ml dung dịch enzyme thì ở thí nghiệm này là 1 g enzyme cố định. Tuy nhiên ủ enzyme và casein ở cùng nhiệt độ 370C trong các khoảng thời gian 60 phút, 80 phút, 100 phút, 120 phút, 140 phút, 160 phút, 180 phút. Các bước tiếp theo tiến hành tương tự. Tính kết quả và vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên để xem ảnh hưởng của thời gian lên hoạt động phân giải của enzyme bromelain cố định trên Natrialginate. 3.2.8. Khảo sát số lần tái sử dụng bromelain cố định trên Natrialginate Sau khi xác định được nhiệt độ và pH tối ưu, ta tiến hành khảo sát số lần tái sử dụng bromelain cố định trên Natrialginate thông qua việc xác định hoạt tính bromelain cố định bằng phương pháp Amano như ở mục 3.2.2.2. Kết thúc thí nghiệm xác định hoạt tính lần 1, rửa lại bằng nước cất và thu lại hạt enzyme cố định. Lặp lại thí nghiệm cho đến khi hoạt tính của enzyme cố định giảm xuống dưới 50% so với hoạt tính của bromelain cố định lần 1. Từ đó vẽ đồ thị biểu diễn sự giảm hoạt tính của bromelain cố định qua các lần tái sử dụng. 3.2.9. Bước đầu tinh sạch enzyme bromelain chồi dứa bằng sắc ký lọc gel Hình 3.12:Thiết bị lọc gel áp suất thấp (Bio - Rad) 3.2.9.1. Nguyên tắc Kỹ thuật sắc ký lọc gel dùng để tách những phân tử có kích thước, trọng lượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel. Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và được giải hấp (thôi) ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ. 3.2.9.2. Thiết bị và hóa chất Thiết bị và dụng cụ: Phễu đổ gel. Bình hút chân không. Cột sắc ký Bio-Rad, kích thước 30 x 1.5 cm; thể tích: 53 ml (thể tích = chiều cao cột x (đường kính/2)2 x 3.14 (π) = 30 x (1.5/2)2 x 3.14). Bình đựng dung dich đệm. Ống nghiệm 50 cái. Vòi hút chân không để khử bọt khí cho các dung dịch. Hóa chất: Gel “Sephadex G-100”, có các đặc tính: dạng hạt mịn, kích thước hạt 45-90 µm; khả năng ngậm nước: 12 ml/1 g gel khô; phạm vi phân tách: 5.000-100.000 daltons. Đệm phosphate 0.1 M pH 7: khử bọt trước khi dùng. 3.2.9.3. Các bước tiến hành Chuẩn bị gel: Cân 5g gel “Sephadex G-100” khô. Cho bột gel từ từ vào dung dịch đệm phosphate 0.1 M pH 7 đựng trong cốc. Dùng dung dịch đệm phosphate 0.1 M pH 7 nhiều gấp hai lần so với thể tích lớp nền gel cần cho trong cột. Cụ thể dùng ít nhất 53 x