Vật liệu và phương pháp nghiên cứu cây xuyên tâm liên

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1 Dược liệu Toàn cây Xuyên tâm liên (Andrographis paniculata (Bum.f.) Nees) - Sau khi phơi khô, tách bỏ thân, cành, rễ, chỉ lấy lá, xay thành bột. - Nơi cung cấp: Nhà thuốc Thanh Tâm, 119 Triệu Quang Phục, P11, Q5 vào tháng 2/2008. Được DS. Phan Văn Đệ định danh và lưu mẫu ở Bộ môn Dược liệu, Trung tâm Sâm và Dược Liệu, Tp. HCM. 2.1.2 Vật liệu sinh học - Herpes Simplex virus (HSV) HSV I (S6): do Viện Pasteur Tp. HCM cung cấp. HSV II (S8): do Viện Pasteur Tp. HCM cung cấp. - Tế bào Vero: dòng tế bào ATCC-CCL81, p 127 2.2 HÓA CHẤT, MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 2.2.1 Hóa chất chiết xuất và kiểm tra dược liệu - Methanol (Trung Quốc, Merck), chloroform (Trung Quốc, Merck) - Thuốc thử: Kedde, anisaldehyt sulfuric - Than hoạt tính (A. R.) - Chất đối chiếu: Andrographolid (độ tinh khiết 100%, HPLC) do Trung tâm Sâm và Dược liệu TP Hồ Chí Minh cung cấp Phân đoạn diterpen lacton tinh sạch do Viện Dược liệu cung cấp VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29 2.2.2 Hóa chất thử hoạt tính kháng virus - Dung dịch đệm borat 0,01M, pH 8,5 - Dung dịch đệm phosphat (PBS), pH 7,2 - Dung dịch xanh methylen 1% - Formaldehyd 4% - Môi trường CMRL (Gibco cat 11530) - Huyết thanh bào thai bê (Gibco cat, 10084,168) - L-Glutamin (Gibco cat, 25030,082) - NaHCO3 (Gibco 25080,094) - Anti- anti (Gibco cat,122) - Trypsin-EDTA (Gibco, 25200) - Môi trường tăng sinh (môi trường CMRL) FCS 5% L-Glutamin 1% Anti- anti 1% CMRL 93% Bảo quản ở 40C. - Môi trường CMC (môi trường phủ) FCS 10% L- Glutamin 1% Anti-anti 1% NaHCO3 0,5% MEM 50% CMC 37,5% Bảo quản ở 40C. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 30 2.3 DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 2.3.1 Dụng cụ thiết bị trong chiết xuất dược liệu - Bình chiết ngấm kiệt - Bình hút ẩm - Bình phun sắc ký - Bếp cách thủy ổn nhiệt (Memmert) - Máy Cô quay (Buchi) - Tủ sấy chân không (VWRS/pAcHLT-A) - Tủ sấy ổn nhiệt Mov-112 (SANYO) - Bồn siêu âm ELMA LC 60H (MERCK) - Đèn UV- VIS (Desaga Sarstedt Gruppe) - Cân phân tích (Meltler Toledo AB-204) - Cốc thủy tinh 50 ml, 100ml, 250 ml, 500 ml, 1000 ml - Erlen 50 ml, 100 ml, 1000 ml - Ống đong 500 ml, 1000 ml - Ống nghiệm φ14 mm, φ22 mm - Phễu sứ lọc hút chân không φ60 mm, φ110 mm VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 31 2.3.2 Thiết bị phân tích - Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẳn silica gel 60F254 (Merck). - Hệ thống HPLC Shimadzu: bơm LC-20AD, đầu dò PDA SPD-M20A, cột Supelco (250 x 4,6 mm, 5 μm), bộ phận tiêm mẫu bằng tay. - Điểm nóng chảy được đo trên máy STUART SMP3. - Phổ UV đo trên máy UV Unicam - Heλios γ. - Phổ IR với máy IR FTIR 8201 (Shimadzu). - Phổ khối lượng ESI-MS (Electronspray ionization mass) được đo trên máy sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ Agilent 1100 LC-MSD Trap. Kỹ thuật ESI (+) và ESI (-), cột C18 (150 mm x 4,6 mm), pha động: chương trình rửa giải gradient với hệ dung môi MeOH-H2O (15:85) đến (100:0) trong 35 phút. - Phổ NMR một chiều được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR, đo trong CDCl3 & MeOD hoặc C5D5N với tetramethyl silan (TMS) làm chất chuẩn nội. 2.3.3 Dụng cụ thiết bị thực hiện phản ứng sinh học - Chai nuôi cấy tế bào 25 cm2, 75 cm2 (Nunc) - Đầu micropipette 100 µl, 200 µl, 1000 µl - Kính hiển vi soi ngược (Olympus) - Màng lọc milipore 2 µm (Storius) - Máy đọc mật độ quang OD (SINAM Elex 800) - Máy ly tâm lạnh (Jouan 704- AR) - Máy lắc (Heidolph) VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 32 - Phiến 96 giếng (Nunc) - Pipet 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml - Tủ ấm CO2 (Model TC 2323- Sherl Lab) - Tube vô trùng 15 ml, 50 ml 2.4 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ PHÂN LẬP CÁC DITERPEN LACTON TỪ XUYÊN TÂM LIÊN [1], [28], [47], [63] Trong lá và thân cây Xuyên tâm liên chứa chủ yếu là nhóm chất diterpen lacton, đã có nhiều nhóm nghiên cứu đã tiến hành và công bố, theo các tác giả Nguyễn Mạnh Cường, Phạm Nguyễn Thùy An, G.A. Akowuah, M.K. Bhan, S. Saxena dung môi thường sử dụng là EtOH 96%, MeOH hoặc hỗn hợp CH2Cl2- MeOH, trong đó hiệu suất chiết diterpen lacton giảm dần theo thứ tự MeOH > EtOH > CH2Cl2-MeOH, do đó phương pháp chiết xuất ngấm kiệt với dung môi là Methanol được lựa chọn để chiết xuất các diterpen lacton chính từ Xuyên tâm liên. 2.4.1 Chiết xuất diterpen toàn phần từ Xuyên tâm liên (12) Nguyên tắc Phương pháp ngấm kiệt: là một phương pháp chiết liên tục trong đó dung môi đi qua dược liệu theo một hướng nhất định với vận tốc nhất định, quá trình hòa tan xảy ra theo gradient nồng độ. Dung môi đi từ nơi dược liệu có hoạt chất thấp đến nơi có hoạt chất cao. Quá trình ngấm kiệt thực hiện trong bình chiết gọi là bình ngấm kiệt. Có thể thực hiện ngấm kiệt nóng, ngấm kiệt nối tiếp nhau (ngấm kiệt ngược dòng) để giảm lượng dung môi và tăng hiệu suất chiết. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 33 Tiến hành Bột lá Xuyên tâm liên được xay nhuyễn, làm ẩm bột với methanol, rồi nạp mẫu vào bình ngấm kiệt đã lót sẵn bông ở đáy, vừa nạp vừa nén. Phủ lên trên dược liệu một lớp giấy lọc, chặn lên trên bằng những viên bi thuỷ tinh để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột. Mở khoá rồi cho từ từ methanol vào bình ngấm kiệt đến khi có vài giọt dung môi bắt đầu chảy ra, khóa bình, đổ ngập dung môi cách dược liệu khoảng 5- 6 cm. Đậy kín để qua đêm. Mở vòi rút dịch chiết theo tỉ lệ 1:6 (khối lượng nguyên liệu tươi: thể tích methanol) cho đến khi dịch chiết gần như không màu, gộp tất cả dịch chiết lại. Dùng than hoạt tính để loại màu dịch chiết này với tỷ lệ than sử dụng là 15% (trọng lượng than/thể tích dịch chiết). Sau khi loại màu, cô giảm áp, thu được cao toàn phần Xuyên tâm liên. 2.4.2 Phân lập 3 diterpen lacton chính từ cao chiết Xuyên tâm liên (12) Áp dụng kỹ thuật chiết phân đoạn và sắc ký kết hợp với phương phát kết tinh và tái kết tinh để thu được các hợp chất tinh khiết. Nguyên tắc Kết tinh nhờ nhiệt độ lạnh: Dịch chiết hoặc cao chiết đậm đặc hòa tan vừa đủ với một lượng dung môi methanol nóng, sau đó đặt trong điều kiện lạnh 00C qua đêm sẽ thu được tinh thể. Sắc ký Pha tĩnh (là chất rắn): silicagel được nạp vào trong một cột (sắc ký cột hở ở áp suất thường hoặc sắc ký ở áp suất cao), hoặc được tráng thành lớp mỏng (sắc ký bản mỏng). Pha động (là chất lỏng): dung môi chloroform: methanol tăng dần độ phân cực. Để chọn được hệ dung môi ly giải trên sắc ký cột, cần thăm dò hệ dung môi trên sắc ký bản mỏng, chọn hệ bắt đầu chạy cột là hệ đẩy được các tạp chất phía trên chất cần tách đến vị trí có Rf > 0,2 và chất cần tách không di chuyển. Tiếp theo là hệ đẩy VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 34 được chất cần tách đến vị trí có Rf > 0,2 và các tạp chất phía dưới chất cần tách không di chuyển. Tiến hành Trong lá andrographolid chiếm tỷ lệ khá cao, do đó có thể tách andrographolid từ cao toàn phần bằng phương pháp kết tinh lạnh và tái kết tinh nhiều lần, dehydroandrographolid và neoandrographolid có tỷ lệ thấp được tách bằng phương pháp sắc ký cột theo nguyên tắc thay đổi độ phân cực của dung môi ly giải. 2.4.3 Xác định lý hóa tính, các phổ nghiệm của 3 diterpen lacton phân lập được (12) So sánh 3 diterpen lacton thu được với andrographolid, dehydrographolid và neoandrographolid chuẩn theo các chỉ tiêu: cảm quan, phản ứng hóa học, điểm nóng chảy, sắc ký lớp mỏng, phổ tử ngoại UV, phổ hồng ngoại IR, phổ MS, phổ NMR, HPLC và đối chiếu với các thông số phổ của các chất đã công bố. 2.5 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG 3 DITERPEN LACTON BẰNG HPLC Sau khi xác định các diterpen lacton thu được là andrographolid, dehydroandrographolid và neoandrographolid, các chất này được dùng làm chuẩn đối chiếu cho quá trình định lượng. Một vài tài liệu nước ngoài (bảng 2.1) đã sử dụng quy trình định lượng Xuyên tâm liên trên HPLC RP-C18 cho khả năng tách khá tốt. Do điều kiện thực tế và cũng để bổ sung thêm một quy trình mới, chúng tôi sử dụng cột RP-C8 để khảo sát khả năng tách 3 diterpen lacton trong Xuyên tâm liên với yêu cầu: − 3 đỉnh trên sắc ký đồ ứng với 3 chất phải tách biệt và đạt độ tinh khiết cần thiết. − Điều kiện chạy HPLC càng đơn giản càng tốt. − Thời gian càng ngắn càng tốt. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 35 Tham khảo các tài liệu [17], [23], [38], [50], [52], chúng tôi chọn điều kiện sắc ký ban đầu là: − Cột sắc ký: Supelco RP-C8 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm). − Pha động: MeOH-H2O (65:35). − Tốc độ dòng: 1 ml/phút. − Thể tích bơm: 20 µl. − Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng. − Bước sóng phát hiện: 223 nm. 2.5.1 Khảo sát tính tương thích hệ thống Tính tương thích hệ thống là một phần tính toán cần thiết khi tiến hành các phương pháp phân tích bằng sắc ký, nhằm mục đích xác định độ phân giải và độ lặp lại của hệ thống phân tích sắc ký thích hợp với phương pháp phân tích đang thực hiện. Tính tương thích của quy trình phân tích được xác định dựa trên giá trị và độ lặp lại của các thông số kỹ thuật của hệ thống khi tiến hành trên mẫu chuẩn và mẫu thử với ít nhất 6 lần tiêm mẫu liên tiếp. Chuẩn bị mẫu chuẩn và mẫu thử. Bơm 6 lần cho mẫu chuẩn và mẫu thử theo các điều kiện đã xác định. Khảo sát các thông số: thời gian lưu, diện tích đỉnh, độ phân giải, hệ số bất đối xứng, số đĩa lý thuyết. Tính RSD% cho từng thông số. Quy trình đạt tương thích hệ thống khi các thông số sắc ký trong cả hai mẫu chuẩn và mẫu thử có RSD% ≤ 2. 2.5.2 Thẩm định quy trình định lượng Khảo sát tính đặc hiệu: chuẩn bị mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn. Triển khai HPLC theo quy trình. Quan sát sắc ký đồ và nhận định kết quả. Đỉnh cần khảo sát của các mẫu phải có thời gian lưu giống nhau và đỉnh của mẫu thử thêm chuẩn phải có diện tích (hoặc chiều cao) theo tỉ lệ đã thêm vào. Khảo sát sự tuyến tính: pha các mẫu chuẩn có nồng độ thay đổi trong khoảng đã xác định, tham khảo theo tài liệu [15]. Triển khai HPLC để có các diện tích đỉnh rồi VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 36 thiết lập phương trình hồi quy y=ax+b (tương quan giữa diện tích đỉnh và nồng độ mẫu chuẩn). Sử dụng phép kiểm Student và phép kiểm Fisher đánh giá phương trình hồi quy. Xác định khoảng tuyến tính. Khảo sát độ đúng: tiến hành bằng phương pháp mẫu thử thêm chuẩn. Thêm một lượng chính xác dung dịch chuẩn tương ứng với khoảng 80%, 100%, 120% hàm lượng chất cần khảo sát trong mẫu thử. Tiến hành HPLC, ghi nhận diện tích đỉnh và suy ra nồng độ. Xác định tỉ lệ phục hồi ở từng nồng độ rồi tính tỉ lệ phục hồi trung bình. Với phương pháp HPLC, tỷ lệ phục hồi phải trong khoảng 98-102%. Khảo sát độ lặp lại: chuẩn bị 6 mẫu chiết khác nhau của cùng một lô dược liệu để tiến hành chạy HPLC. Mỗi mẫu thực hiện 1 lần, từ diện tích đỉnh suy ra nồng độ. Kết quả được xử lý thống kê để xác định độ lệch chuẩn RSD% của phép đo. Với phương pháp HPLC và đối tượng dược liệu cho phép giá trị RSD% ≤ 5. 2.5.3 Xử lý thống kê Sử dụng phần mềm MS Excel với công cụ “Descriptive Statistics” và “Regression” để xử lý số liệu và phân tích hồi quy [8]. 2.5.4 Áp dụng quy trình đã xây dựng để định lượng diterpen lacton trong dược liệu ban đầu và mẫu cao loại màu của Xuyên tâm liên Tiến hành định lượng các mẫu Xuyên tâm liên theo quy trình đã chọn. Mỗi mẫu thực hiện định lượng 3 lần, tính kết quả trung bình rồi đánh giá hàm lượng diterpen lacton giữa các mẫu. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNGPHÁP 37 2.6 QUY TRÌNH THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG VIRUS HERPES SIMPLEX (HSV) CỦA CAO CHIẾT XUYÊN TÂM LIÊN VÀ 3 DITERPEN LACTON 2.6.1 Nuôi cấy tế bào [56], [66] Mục đích: tạo dòng tế bào để gây cảm nhiễm virus. Nguyên tắc Dùng một chai nuôi cấy tế bào 75cm3, nhân một tuần 1 lần với tỷ lệ tế bào ban đầu là 2x105 tế bào/ml. Phân vào plate 96 giếng, sau 3 ngày nuôi cấy, có thể dùng làm phản ứng trung hòa. Tiến hành − Chuẩn bị một chai tế bào 75cm3 chứa 30ml môi trường tăng sinh sau 7 ngày nuôi cấy. − Hút bỏ môi trường cũ từ chai nuôi cấy có tế bào, rửa tế bào bằng dung dịch PBS (2 lần). − Cho vào chai 2ml trypsin-edta, đậy nắp chai, để 1 phút trong tủ ấm 370C, dùng tay vỗ mạnh vào thành chai cho tế bào long ra khỏi thành chai. − Dùng pipet hút môi trường tăng sinh cho vào chai tế bào, sục và trộn đều bằng pipet. − Đếm tế bào để xác định độ pha loãng của tế bào. − Pha loãng tế bào trong môi trường tăng sinh để có nồng độ 2x10-5 tế bào/1ml, sau đó dùng pipet phân phối vào plate 96 giếng, mỗi giếng là 100µl hỗn dịch tế bào. − Ủ plate trong tủ ấm 370C, 5% CO2 và độ ẩm 85%, tế bào mọc kín thành một lớp sau 2, 3 ngày nuôi cấy. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNGPHÁP 38 2.6.2 Phương pháp đếm tế bào [66] Mục đích: xác định nồng độ ban đầu đưa vào thử nghiệm Cách tiến hành Hình 2.1. Cách đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauer cải tiến - Sử dụng xanh trypan 1% pha trong PBS (không chứa Ca2+ và Mg2+). - Pha loãng 0,5 ml huyền phù tế bào trong 0,5 ml dung dịch xanh trypan. Những tế bào chết sẽ bắt màu xanh của thuốc nhuộm. - Dùng pipett pasteur trộn đều hỗn hợp. Sau đó hút 10 μl cho vào buồng đếm. - Đếm những tế bào sống trong 4 ô vuông ở 4 góc, không đếm những những tế bào nằm trên đường viền của ô vuông. Đếm tế bào sống ở cả hai buồng đếm (Hình 3.2). - Nếu quan sát thấy các tế bào tụ tập lại thành từng đám thì loại bỏ và thực hiện lại thao tác pha loãng. - Tính tổng số tế bào đếm được trong 4 góc ở cả 2 buồng đếm theo công thức: C= a x m x 1/4 x 104 Với : a: Tổng số tế bào sống đếm được ở 4 góc vuông m: Độ pha loãng mẫu với dung dịch xanh trypan 1/4 : Cho giá trị trung bình của số tế bào ở mỗi ô vuông 104: Thể tích của mỗi ô vuông (ml) C: Nồng độ tế bào (tế bào/ml) Đếm tất cả tế bào trong 4 ô ở 4 góc. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNGPHÁP 39 2.6.3 Tạo nguồn HSV chuẩn [66] Nguyên tắc HSV dễ cảm nhiễm trên dòng tế bào Vero nên sử dụng dòng tế bào này để tạo nguồn virus chuẩn. HSV được gây nhiễm vào tế bào Vero đã mọc kín thành một lớp sau khi nhân 2-3 ngày, ủ tế bào ở 370C, quan sát tế bào mỗi ngày, khi tế bào có hiện tượng CPE hoàn toàn, đem đông tan băng 3 lần, ly tâm lấy nước nổi, bổ sung FCS 20%, phân chia lượng nhỏ, bảo quản -700C cho đến khi làm phản ứng. Tiến hành − Dùng chai tế bào Vero 75cm3 đã phủ kín thành một lớp sau 2-3 ngày nuôi cấy − Đổ bỏ môi trường tăng sinh, thêm 1ml hỗn dịch HSV vào chai tế bào, cho virus tiếp xúc với tế bào trong 1 giờ, bổ sung 30ml môi trường ủ ở 370C và quan sát tế bào mỗi ngày. − Sau 2 ngày tế bào tạo CPE 100%, cất chai tế bào vào tủ âm -700C trong 30 phút để làm đông rồi lấy ra để trên khay đá cho tan, tiếp tục làm đông rã thêm 2 lần nữa. − Thu virus bằng cách y tâm 1000v/15p/40C, loại bỏ cặn tế bào, lấy nước nổi. − Bổ sung 20% FCS vào nước nổi virus, phân ra các cryotube, mỗi tube 0,5ml, bảo quản ở -700C để làm nguồn virus thực hiện phản ứng trung hòa. − Nguồn hỗn dịch virus được chuẩn độ để xác định hiệu giá TCID50. 2.6.4 Xác định TCID50 của hỗn dịch virus [26], [66] Nguyên tắc Dựa vào hiện tượng CPE, xác định nồng độ virus gây chết 50% tế bào theo công thức Karber. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNGPHÁP 40 Tiến hành - Ống chứa dịch HSV trữ ở -700C được rã đông và để ủ trong nước đá - Hỗn dịch virus được pha loãng bậc 10 trong môi trường CMRL bổ sung 5% FCS từ nồng độ 10-1 đến 10-8 trong những ống falcon, luôn giữ lạnh để tránh làm virus bị bất hoạt. - Phiến 96 giếng có tế bào đã nuôi cấy thành một lớp, đổ bỏ môi trường tăng sinh, gây nhiễm virus 100µl/giếng của mỗi độ pha loãng, để 370C trong 48- 72giờ, 5% CO2, độ ẩm 85%. - Quan sát tế bào có hiện tượng CPE bằng kính hiển vi soi ngược, tiến hành nhuộm tế bào. - Đếm các giếng có CPE và tính TCID50 theo công thức Karber. Hình 2.2 Sơ đồ pha loãng virus Tính kết quả: Tính kết quả theo công thức Karber: Log TCID50= L- d(S- 0,5) Với:L: Log của độ pha loãng thấp nhất dùng trong thử nghiệm. d: Tỉ lệ khác biệt giữa các độ pha loãng. S: Tổng tỉ lệ các giếng dương tính trên các giếng gây nhiễm ở từng nồng độ virus. Virus đậm đặc 10-2 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 10-4 10-5 10-6 10-7 10-810-3 9 9 9 99 9 9,5 0,5ml 10-1 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNGPHÁP 41 2.6.5 Chuẩn bị dịch thử Andrographolid (dung dịch mẹ 20mg/ml), dehydroandrographolid (dung dịch mẹ 10mg/ml), neoandrographolid (dung dịch mẹ 10mg/ml), cao chiết loại chorophill (dung dịch mẹ 250mg/ml). Ba chất tinh khiết được pha loãng với các nồng độ lần lượt là 1000 µg/ml, 500 µg/ml, 250 µg/ml, 125 µg/ml, 62,5 µg/ml, 31,25 µg/ml, 15,625µg/ml, cao chiết loại chlorophill pha loãng với các nồng độ 25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 6,25 mg/ml, 3,125 mg/ml, 1,56 mg/ml, 0,78 mg/ml, 0,36mg/ml. Hình 2.3 Sơ đồ pha loãng các chất tinh khiết Các chất tinh khiết khó tan trong môi trường CMRL do đó pha dung dịch mẹ trong DMSO, từ dung dịch mẹ pha loãng ra thành nhiều nồng độ để khảo sát. Acyclovir được hoà tan và pha loãng trong CMRL 5% FCS để được dịch thử có nồng độ là 1000 µg/ml, 500 µg/ml, 250 µg/ml, 125 µg/ml, 62,5 µg/ml, 31,25 µg/ml, 15,625µg/ml. 2.6.6 Phương pháp nhuộm tế bào bằng xanh methylen [16], [37], [40] Nguyên tắc Dựa vào sự bắt màu xanh methylen của màng tế bào cho các giá trị OD xác định. Sau khi tiếp xúc với virus và dịch thử, tế bào trong phiến 96 giếng được nhuộm bằng xanh methylen và đo mật độ tế bào bằng máy đọc mật độ quang ở bước sóng 620 nm. DD mẹ 20mg/ml 1000 µg/ml 250 µg/ml 125 µg/ml 62,5 µg/ml 31,25 µg/ml 15,625 µg/ml 500 µg/ml 9,5 5 5 5 5 5 0,5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNGPHÁP 42 Tiến hành: − Đổ bỏ môi trường trong các giếng. Rửa tế bào một lần bằng dung dịch đệm PBS, 200 μl/giếng. − Cho vào mỗi giếng 200 μl dung dịch formol 3,7%, để yên ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. − Đổ bỏ formol. Rửa các giếng 2 lần bằng 200 μl/giếng dung dịch đệm borat 0,01 M, pH 8.5. − Cho vào mỗi giếng 50 μl thuốc nhuộm xanh methylen được pha loãng trong dung dịch đệm borat 0.01 M, pH 8.5, để yên 10 phút. − Đổ bỏ thuốc nhuộm. Rửa các giếng bằng nước cất đến khi nước không màu. − Để khô các giếng ở 37 0C trong 1 giờ. − Đọc kết quả bằng máy đo độ chiết quang ở bước sóng 620 nm. 2.6.7 Phương pháp thử nghiệm độc tính tế bào (Cytotoxicity assay) Mục đích: Thử nghiệm độc tính tế bào dùng để xác định giới hạn trên của nồng độ dược liệu được dùng trong nghiên cứu hoạt tính kháng virus. Tiến hành: − Cho các nồng độ chất thử vào phiến 96 giếng có tế bào Vero đã phủ kín thành một lớp. − Ủ ở 37 0C, 5% CO2 trong 48 giờ. − Đổ bỏ chất thử không hấp phụ, rửa lớp tế bào bằng PBS. − Nhuộm màu bằng phương pháp nhuộm xanh methylen. − Đo OD ở bước sóng 620 nm. − Tính CC, suy ra CC50 từ đồ thị biểu diễn CC. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNGPHÁP 43 Tính nồng độ gây độc 50% tế bào Tính phần trăm gây độc tế bào theo các nồng độ dịch thử: 100×−= A BACC A: Giá trị OD của chứng tế bào (tế bào không tiếp xúc với dịch thử) B: Giá trị OD của tế bào đã được tiếp xúc với chất thử Từ phương trình tuyến tính biểu diễn phần trăm gây độc tế bào CC theo nồng độ dịch thử suy ra nồng độ chất thử gây độc 50% tế bào (CC50). 2.6.8 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng virus (Antivirus assay) Nguyên tắc Phương pháp được sử dụng nhiều nhất để đánh giá tiềm năng kháng virus của dược liệu là xác định giá trị IC50, đây là nồng độ dược liệu ức chế 50% khả năng xâm nhiễm của virus. Để nghiên cứu dược liệu có hiệu quả ức chế virus, thử nghiệm được tiến hành theo phương pháp: dược liệu tiếp xúc với virus, sau đó cho xâm nhiễm vào tế bào [68]. - Cho các nồng độ virus tiếp xúc lần lượt với các nồng độ dược chất. - Ủ ở 37 0C, 5% CO2 trong 2 giờ. - Nhiễm với tế bào trong phiến 96 giếng đã phủ kín một lớp tế bào Vero. - Ủ ở 37 0C, 5% CO2 trong 48 giờ. - Nhuộm tế bào bằng phương pháp nhuộm xanh methylen. - Đo OD ở 540 và 620 nm. - Tính IC, suy ra IC50 từ đồ thị biểu diễn IC. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNGPHÁP 44 Tính IC50 : Nồng độ dịch thử ức chế 50% virus Công thức tính phần trăm ức chế virus của dịch thử : C: Giá trị OD của tế bào tiếp xúc với virus và dược chất.