Vật liệu và phương pháp nghiên cứu chủng chuẩn Aspergillus

GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 38 VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu: 2.1.1. Chủng chuẩn Aspergillus và mẫu thực phẩm Chủng chuẩn Aspergillus flavus: 5 chủng được cung cấp từ các viện nghiên cứu và 24 chủng được phân lập từ các mẫu thức ăn chăn nuôi, ngũ cốc, trà… (phân lập theo hướng dẫn của FAO – 1992) được trình bày ở Bảng 2.1: Bảng 2.1: Danh mục các chủng A. flavus sử dụng trong nghiên cứu khảo sát chủng có và không có khả năng sinh độc tố Aflatoxin B1 STT Tên chủng Nguồn gốc Mã số nhận diện 1 A. flavus ATCC Bộ sưu tập chủng chuẩn Mỹ 02 2 A. flavus 278 VTCC Bộ sưu tập chủng chuẩn Việt Nam 10 3 A. flavus 203 VTCC Bộ sưu tập chủng chuẩn Việt Nam 11 4 A. flavus 135 VTCC Bộ sưu tập chủng chuẩn Việt Nam 12 5 A. flavus Viện Pasteur 13 6 A. flavus Nguyên liệu 1 01 7 A. flavus Đường maltose 1 03 8 A. flavus Trà lipton 1 04 9 A. flavus Thức ăn 1 05 10 A. flavus Thức ăn 2 06 11 A. flavus Trà lipton 2 07 12 A. flavus Bột bắp 08 13 A. flavus Bột cá 09 14 A. flavus Trà (sấy khô) 1 14 15 A. flavus Trà (sấy khô) 2 15 GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 39 VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ 16 A. flavus Bột mì 1 16 17 A. flavus Bột mì 2 17 18 A. flavus Gia vị 1 18 19 A. flavus Gia vị 2 19 20 A. flavus Bột mì 3 20 21 A. flavus Trà Lipton 3 21 22 A. flavus Bột bắp 1 22 23 A. flavus Bột bắp 2 23 24 A. flavus Trà (sấy khô) 3 24 25 A. flavus Đường maltose 2 25 26 A. flavus Bột mì 3 26 27 A. flavus Bột mì 4 27 28 A. flavus Trà (sấy khô) 4 28 29 A. flavus Trà (sấy khô) 5 29 30 A. flavus Nguyên liệu 3 30 Chủng chuẩn khác: 1 chủng Aspergillus oryzae do Viện Chủng chuẩn quốc gia Việt Nam (VTCC) cung cấp, A. ochraceus do Trung tâm Kỹ Thuật 3 cung cấp. Mẫu dùng để phân lập chủng: trà, ngũ cốc, thức ăn chăn nuôi... được liệt kê ở Bảng 2.1. Mẫu dùng để xác nhận hiệu lực phương pháp: mẫu thức ăn dạng bột mịn và mẫu thức ăn dạng hạt. 2.1.2. Thiết bị và dụng cụ chính Nghiên cứu sử dụng một số thiết bị và dụng cụ của phòng thí nghiệm vi sinh như: GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 40 VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ Thiết bị: tủ ấm, bể điều nhiệt, tủ ủ, cân phân tích, máy dập mẫu, tủ cấy, tủ mát, bàn đọc UV Dụng cụ: đĩa petri, ống nghiệm, transfer pipette,... 2.1.3. Môi trường và hóa chất Một số môi trường và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu (Phụ lục 1): - Buterfield’s phosphate buffer: dung dịch đệm dùng để pha loãng mẫu theo hướng dẫn phân tích mẫu của FAO – 1992. - Saline Peptone Water (SPW): Dung dịch muối sinh lý dùng để pha loãng mẫu thực phẩm hay huyền phù vi khuẩn. - Sabouraud agar (SAB), Yeast Extract Succrose agar (YES), Czapekdox, Dichloran 18% glycerol agar (DG18), Potatose dextrose agar (PDA) của Merck - Kháng sinh Chloramphenicol - Methyl-β-cyclodextrin - Chloroform - Thuốc nhuộm: Crystal violet, iodine, acetol, safranin. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp chuẩn bị phòng ẩm nuôi cấy mốc [13] - Dùng kẹp đặt giấy lọc vô trùng có đường kính 9cm vào đĩa petri đã hấp khử trùng. - Đặt thanh thủy tinh hình chữ U vô trùng lên trên giấy lọc - Đổ 4ml nước cất vô trùng lên giấy lọc để tạo độ ẩm - Dùng kẹp đặt lame lên thanh chữ U - Dùng dao mổ vô trùng cắt một miếng thạch hình vuông khoảng 5mm từ đĩa thạch SAB agar. GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 41 VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ - Cấy bào tử nấm mốc lên cả mặt trên và đáy của miếng thạch. Đặt miếng thạch lên lame sao cho có một mặt cấy bào tử được đặt xuống mặt lame. - Đậy lamel lên bề mặt khối thạch. - Đậy nắp đĩa petri và ủ ở nhiệt độ phòng trong 48h. 2.2.2. Phương pháp định danh nấm mốc theo FAO – 1992 [10] - Cân 50g mẫu vào bao PE vô trùng, thêm 450ml dung dịch Buterfield’s phosphate buffer, dập mẫu trong 2 phút ở tốc độ 10.000 đến 12.000 vòng/ phút được dịch mẫu có nồng độ pha loãng 10-1. - Chuẩn bị các nồng độ pha loãng kế tiếp bằng cách hút 10ml dịch mẫu pha loãng vào 90ml dung dịch pha loãng để được nồng độ 10-2, 10-3, 10-4,... - Cấy 1ml mỗi nồng độ pha loãng vào đĩa petri, mỗi nồng độ thực hiện 3 đĩa. - Thêm 20ml môi trường PDA có bổ sung kháng sinh Chloramphenicol 40ppm (đã được làm nguội ở nhiệt độ 44-46oC), lắc đều theo chiều kim đồng hồ và ngược lại để trộn đều dịch mẫu vào môi trường. Để đĩa thạch đông lại và ủ trong tối ở 22- 25oC trong 5 ngày. - Chọn các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường PDA: là những khuẩn lạc có màu vàng xanh lá do màu của bào tử tạo ra. - Nuôi cấy bào tử nấm bằng phương pháp phòng ẩm 2.2.1. để quan sát hình thái nấm với các đặc điểm sau: cuống bào tử nhám, có 2 thể bình và bào tử có gai. 2.2.3. Phương pháp gây nhiễm chủng nấm mốc vào mẫu thực phẩm [14] Quy trình thực hiện: gồm các bước chính như sau: Nuôi cấy nấm mốc Aspergillus flavus trên môi trường PDA ở 28oC trong 7 ngày cho đến khi bào tử được tạo ra. Dùng que cấy móc, lấy toàn bộ bào tử của nấm mốc cho vào nước muối sinh lý (SPW), vortex đều và để yên trong vòng 3 phút, hút dịch chứa bào tử cho vào ống muối sinh lý khác để đảm bảo trong dung dịch chứa duy nhất bào tử nấm mốc. GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 42 VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ Pha loãng dung dịch chứa bào tử nấm mốc đến nồng độ thích hợp và cấy 1ml dịch pha loãng ở mỗi nồng độ đã chọn vào các đĩa petri, mỗi nồng độ cấy 3 đĩa. Đổ 15 ml môi trường SAB vào các đĩa vừa cấy, lắc đều. Dùng giấy sạch gói các đĩa lại. Ủ đĩa ở 28oC, 3 ngày. Bảo quản các ống dịch pha loãng chứa bào tử nấm mốc trong tủ mát ở 2-8oC. Chọn đếm các đĩa có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 15-150 cfu/đĩa. Tính ra mật độ tế bào ở ống dịch pha loãng chứa bào tử nấm mốc gốc và các ống dịch pha loãng tương ứng. Chuẩn bị mẫu: mẫu đã được kiểm tra bằng quy trình phân tích nấm mốc Aspergillus flavus của FAO (1992) [10] và khẳng định là không nhiễm Aspergillus flavus. Cân 25g mẫu vào bao PE vô trùng, pha loãng mẫu với 225g SPW. Ngâm trong 5 phút. Dập mẫu 1-2 phút, tốc độ 200 vòng/phút. Gây nhiễm mẫu: Từ ống gốc nước muối sinh lý chứa bào tử đã xác định được mật độ bào tử nấm mốc, tính toán độ pha loãng và thể tích dịch bào tử cần lấy để đưa vào mẫu. Đồng nhất để huyền phù bào tử phân bố đều trong dịch mẫu. GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 43 VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ Hình 2.1: Sơ đồ quy trình gây nhiễm bào tử nấm mốc vào mẫu. 10ml SPW 9ml SPW 1ml 1ml Bảo quản ống gốc SPW chứa bào tử trong tủ mát Đổ đĩa với thạch SAB. Ủ 28oC/ 3 ngày Chọn đếm những đĩa có 15-150 cfu/đĩa. Xác định mật độ bào tử trong ống dịch SPW 25g mẫu Mẫu đồng nhất 225g SPW Gây nhiễm vào mẫu ở mật độ mong muốn 10o 10-1 10-5 10-6 10- 7 GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 44 VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ 2.2.4. Phương pháp tách chiết mẫu (đĩa thạch) để phân tích HPLC [11] - Lấy toàn bộ đĩa thạch có cấy nấm mốc cho vào bao PE vô trùng. - Bổ sung 20 ml chloroform (thực hiện 2 lần, mỗi lần 10ml), đồng nhất mẫu trong 3 phút bằng máy dập mẫu. - Lọc dịch đồng nhất qua giấy lọc Whatman thu dịch chloroform. - Làm khô dịch chloroform bằng dòng khí nitrogen. - Giữ trong tủ mát 2-8oC và gửi mẫu phân tích. 2.2.5. Phương pháp khảo sát sự phát huỳnh quang của các chủng Aspergillus flavus sinh aflatoxin Mục đích: thí nghiệm này nhằm khẳng định xem tất cả các chủng A. flavus phân lập có sinh Aflatoxin dựa trên đặc điểm phát huỳnh quang như cơ sở lý thuyết đã đưa ra hay không. Cách thực hiện: Cấy chuyển cả 30 chủng A. flavus phân lập từ ống bảo quản chủng sang môi trường SAB có bổ sung 0,3% methyl-β-cyclodextrin. Ủ đĩa thạch ở (22, 25, 28 và 30)oC trong 3 ngày. Quan sát sự phát huỳnh quang của các chủng dưới đèn UV ở bước sóng 365 nm. Chọn các đĩa thạch có phát huỳnh quang và các đĩa thạch không có phát huỳnh quang, tách chiết mẫu và kiểm chứng sự sinh Aflatoxin bằng phương pháp HPLC. Đọc kết quả: * Hiện tượng phát quang ánh sáng màu xanh lam bao xung quanh khuẩn lạc khi quan sát dưới đèn UV được xem là có biểu hiện dương tính với sự sinh Aflatoxin và có kết quả dương tính Aflatoxin khi kiểm chứng bằng HPLC; nếu không có hiện tượng trên được xem là âm tính. Quan sát kèm với đĩa thạch đối GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 45 VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ chứng âm không bổ sung cyclodextrin và đĩa thạch đối chứng âm cấy chủng A. oryzae không sinh Aflatoxin. 2.2.6. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện đặc tính sinh aflatoxin dựa trên đặc điểm phát huỳnh quang. Mục đích: thí nghiệm này nhằm xác định sự ảnh hưởng của các yếu tố nuôi cấy như thời gian, loại môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, nồng độ cyclodextrin bổ sung vào môi trường, pH môi trường và điều kiện có hay không có bổ sung kháng sinh Chloramphenicol đến sự sinh Aflatoxin tương ứng với sự phát huỳnh quang của các chủng A. flavus. Cách thực hiện: Chọn các chủng A. flavus sinh Aflatoxin va các chủng A. flavus không sinh Aflatoxin đã được kiểm tra đối chứng bằng HPLC. Quan sát kèm với 1 đĩa thạch đối chứng âm không bổ sung cyclodextrin và 1 đĩa âm cấy chủng A. oryzae. 2.2.6.1. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian: Cấy các chủng A. flavus lên môi trường SAB có bổ sung 0,3 % methyl -β cyclodextrin; ủ 28oC trong 3, 5, 7, 9 ngày. Quan sát sự phát huỳnh quang dưới đèn UV (365nm). 2.2.6.2. Khảo sát ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy nấm mốc: Cấy các chủng A. flavus lên môi trường SAB, PDA, Czapek dox, DG18, YES agar có bổ sung 0,3 % methyl-β-cyclodextrin; ủ 28oC trong khoảng thời gian ngắn nhất dựa trên thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian có thể quan sát rõ sự phát huỳnh quang. Quan sát sự phát huỳnh quang dưới đèn UV (365nm). 2.2.6.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ: Cấy các chủng A. flavus lên môi trường (dựa trên thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của môi trường) có bổ sung 0,3 % methyl -β cyclodextrin; ủ (22, 25, 28 và 30)oC trong khoảng thời gian ngắn nhất (dựa trên thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 46 VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ của thời gian) có thể quan sát rõ sự phát huỳnh quang. Quan sát sự phát huỳnh quang dưới đèn UV (365nm). 2.2.6.4. Khảo sát ảnh hưởng của pH: Cấy các chủng A. flavus lên môi trường (dựa trên thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của môi trường) được điều chỉnh pH từ 4,2; 4,4; 4,6; 4,8; 5,0; 5,2; 5,4; 5,6; có bổ sung 0,3 % methyl-β-cyclodextrin; ủ nhiệt độ tối ưu (dựa trên thí nghiêm khảo sát nhiệt độ) trong khoảng thời gian ngắn nhất (dựa trên thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian) có thể quan sát rõ sự phát huỳnh quang. Quan sát sự phát huỳnh quang dưới đèn UV (365nm). 2.2.6.5. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cyclodextrin bổ sung vào môi trường: Cấy các chủng A. flavus lên môi trường (dựa trên thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của môi trường) được điều chỉnh pH thích hợp nhất (dựa trên thí nghiệm khảo sát pH); có bổ sung (0,1; 0,2; 0,25; 0,3; 0,4; 0,5) % methyl-β-cyclodextrin; ủ nhiệt độ tối ưu (dựa trên thí nghiêm khảo sát nhiệt độ) trong khoảng thời gian ngắn nhất (dựa trên thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian) có thể quan sát rõ sự phát huỳnh quang. Quan sát sự phát huỳnh quang dưới đèn UV (365nm). 2.2.6.6. Khảo sát ảnh hưởng của kháng sinh Chloramphnicol bổ sung vào môi trường: Cấy các chủng A. flavus lên môi trường có và không có bổ sung Chloramphenicol 40ppm (dựa trên thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của môi trường) được điều chỉnh pH thích hợp nhất (dựa trên thí nghiệm khảo sát pH); có bổ sung nồng độ methyl-β-cyclodextrin phù hợp (dựa trên thí nghiệm khảo sát nồng độ cyclodextrin); ủ nhiệt độ tối ưu (dựa trên thí nghiêm khảo sát nhiệt độ) trong khoảng thời gian ngắn nhất (dựa trên thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian) có thể quan sát rõ sự phát huỳnh quang. Quan sát sự phát huỳnh quang dưới đèn UV (365nm). GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 47 VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ Ở mỗi điều kiện nuôi cấy, ủ kèm đĩa đối chứng âm không bổ sung methyl-β- cyclodextrin vào môi trường nuôi cấy và đĩa đối chứng âm cấy chủng A. oryzae không sinh độc tố. 2.2.7. Phương pháp xác định giới hạn phát hiện [14] Thí nghiệm khảo sát trên 3 chủng A. flavus có sinh Aflatoxin B1. Hai loại nền mẫu được chọn là thức ăn chăn nuôi dạng bột và thức ăn chăn nuôi dạng hạt. Các mẫu này đã được kiểm tra trước bằng quy trình phân tích nấm mốc A. flavus của FAO (1992) và khẳng định là không nhiễm A. flavus. Chuẩn bị mẫu: cân một loạt (20 mẫu), mỗi mẫu 25 g vào các túi PE vô trùng. Mỗi mẫu được pha loãng với 225 g dịch pha loãng SPW. Để yên mẫu trong 5 phút, dập mẫu 1-2 phút ở tốc độ 200 vòng/phút. Chuẩn bị dịch huyền phù bào tử nấm mốc A. flavus: dịch huyền phù bào tử nấm mốc A. flavus đã xác định được mật độ bằng phương pháp đếm đĩa trước đó. Pha loãng dịch huyền phù bào tử nấm mốc ở các độ pha loãng thích hợp (1/10, 1/5, 1/2,..) để đạt được các mật độ 10, 20, 30, …, 150, 200 cfu/ml. Gây nhiễm mẫu: Cấy 1 ml dịch huyền phù ở các độ pha loãng khác nhau vào 25g mẫu đã pha loãng. Cấy đồng thời 1ml dịch pha loãng vào các đĩa petri vô trùng để kiểm tra lại mật độ bào tử A. flavus gây nhiễm. Đồng nhất mẫu với dịch huyền phù 30 giây. Cấy mẫu: cấy 1 ml dịch mẫu đã gây nhiễm ở các mật độ bào tử khác nhau vào đĩa petri vô trùng. Mỗi mẫu cấy lặp lại 6 đĩa. Đổ đĩa với thạch SAB có bổ sung methyl-β-cyclodextrin. Ủ các đĩa trong điều kiện tối ưu đã khảo sát trên. Đọc và ghi nhận kết quả: Đếm số đĩa có khuẩn lạc trong số 6 đĩa cấy từ cùng một mẫu và ghi nhận kết quả dưới dạng n/6 (n: số đĩa có khuẩn lạc). Chọn ra mức 3 mật độ gây nhiễm vào mẫu (ngưỡng gây nhiễm dưới, giữa và trên) sao cho tỷ lệ phát hiện tương ứng với 3 ngưỡng đạt 1/6, 2/6 hoặc 3/6, 5/6 hoặc 6/6. GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 48 VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ Tính giới hạn phát hiện của phương pháp: LC = 1,65 x S0 (cfu/ khối lượng hoặc thể tích mẫu thử) S0 (threshold hay estimate of spread) là giá trị ngưỡng. Giới hạn phát hiện: LOD(cfu/g) = (3,3 x S0)/m m : khối lượng mẫu thử nghiệm (mẫu rắn). 25g mẫu + 225g SPW Dập mẫu Gây nhiễm A. flavus a1 cfu a2 cfu a3 cfu Phân bố đều Cấy 1ml vào đĩa, 1 mẫu 6 lần Ủ đĩa Đếm số đĩa có khuẩn lạc n/6 n’/6 n’’/6 ở mỗi dãy cấy Giá trị tới hạn ước lượng (LC = a2) Æ Giới hạn phát hiện. Hình 2.2: Sơ đồ quy trình xác định giới hạn phát hiện của phương pháp 2.2.8. Xác định các thuộc tính của phương pháp [14] Thí nghiệm này xác định 4 thuộc tính: độ nhạy, độ đặc hiệu, tỷ lệ dương tính giả và tỷ lệ âm tính giả. Thí nghiệm được thực hiện lặp lại với 01 chủng A. flavus có sinh độc tố Aflatoxin B1 phân lập và 1 chủng A. flavus không sinh độc tố Aflatoin B1, trên loại GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 49 VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ nền mẫu thức ăn có cấu trúc dạng hạt. Các mẫu được chọn đã được kiểm tra và khẳng định là không nhiễm A. flavus. Cách thực hiện: Chuẩn bị mẫu: lấy 25 g mẫu, pha loãng với 225 g SPW. Dập mẫu 1- 2 phút, tốc độ 200 vòng/phút. Chuẩn bị chủng: 01 chủng A. flavus có sinh độc tố Aflatoxin B1 và 1 chủng A. flavus không sinh độc tố Aflatoxin B1 được nuôi cấy trên môi trường PDA ở 28oC trong 7 ngày cho đến khi bào tử được tạo ra và được chuẩn bị sẵn dịch huyền phù bào tử. Gây nhiễm mẫu: mỗi mẫu được gây nhiễm với 2 chủng, 1 là chủng nấm mốc mục tiêu và 1 không phải chủng nấm mốc mục tiêu bằng cách lấy 1ml dịch huyền phù bào tử A. flavus có sinh độc tố Aflatoxin B1 và 1ml chủng A. flavus không sinh độc tố Aflatoin B1 vào dịch mẫu. Pha loãng dịch huyền phù bào tử ở nhiều nồng độ khác nhau và gây nhiễm mẫu ngẫu nhiên sao cho có ít nhất 30 mẫu âm và 30 mẫu dương. Đồng nhất lại mẫu và pha loãng dịch mẫu ở nhiều nồng độ khác nhau. Cấy mẫu: Từ các dịch mẫu pha loãng ở nhiều nồng độ, cấy 1ml vào đĩa các đĩa petri vô trùng. Cấy lặp lại 5 lần cho mỗi độ pha loãng. Đổ đĩa với thạch SAB có bổ sung methyl-β-cyclodextrin. Gói ủ các đĩa trong giấy sạch ở 28oC, 3 ngày. Chọn các khuẩn lạc đặc trưng: Phân biệt các khuẩn lạc có phát huỳnh quang và các khuẩn lạc không phát huỳnh quang tương ứng với các chủng A. flavus sinh Aflatoxin B1và không sinh Aflatoxin B1. Thẩm tra các mẫu cấy có sự hiện diện A. flavus : phân tích mẫu theo quy trình phân tích của FAO (1992) Thẩm tra khả năng sinh aflatoxin B1 của các chủng bằng phương pháp HPLC: Cấy chuyển riêng lẻ các khuẩn lạc phát huỳnh quang và không phát huỳnh quang lên môi trường SAB có bổ sung methyl cyclodextrin nuôi ủ 3 ngày. Tách chiết mẫu và kiểm tra Aflatoxin B1 bằng HPLC. GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 50 VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ Sau khi thẩm tra, kết quả được chia làm 4 nhóm: a: số khuẩn lạc dương tính giả định (điển hình) được khẳng định là dương (dương tính thực). b: số khuẩn lạc âm tính giả định (không điển hình) được khẳng định là dương (âm tính giả). c: số khuẩn lạc dương tính giả định được khẳng định là âm (dương tính giả). d: số khuẩn lạc âm tính giả định được khẳng định là âm (âm tính thực). Sắp xếp tần suất 4 nhóm trên theo như Bảng 2.2. sau: Bảng 2.2. Cách sắp xếp tần suất 4 nhóm kết quả: Số đếm giả định Mẫu khảo sát Dương tính (điển hình) Âm tính (không điển hình) Tổng số Khẳng định là dương a b a+b Khẳng định là âm c d c+d Tổng số mẫu a+c b+d n Công thức tính các thông số: Độ nhạy = a/(a+b) Độ đặc hiệu = d/(c+d) Tỷ lệ dương tính giả = c/(a+c) Tỷ lệ âm tính giả = b/(b+d).