Vật liệu và phương pháp nghiên cứu chủng vi sinh vật phân lập

Vật liệu và phương pháp -19- PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu: 2.1.1 Chủng vi sinh vật: - Những chủng vi sinh vật phân lập từ nước một số ao nuôi cá Tra thuộc trang trại nuôi cá Tra của Ông Sầm Hoàng Văn, ấp Bình Mỹ B, xã Bình Thạnh, huyện Cao Lãnh tỉnh Đồng Tháp (Ven bờ sông Tiền). [16], [13], [18], [27] 2.1.2. Môi trường phân lập, giữ giống và nuôi cấy: 2.1.2.1. Môi trường phân lập và giữ giống: ™ Môi trường phân lập: - Thành phần môi trường cao thịt – pepton: (Môi trường thạch đĩa – có agar) Cao thịt : 3g Pepton : 10g NaCl : 5g Agar : 20g Nước : 1000 ml - Cách pha môi trường: + Cân, đong chính xác các thành phần của môi trường. + Cho một phần nước (Khoảng 200 ml) vào khấy tan hỗn hợp cao thit, pepton, NaCl. Đồng thời tiến hành cho agar vào 1 phần nước (khoảng 500 ml) vào nồi khuấy liên tục trên bếp nhiệt cho đến khi agar sôi và tan hoàn toàn. Sau đó, cho hỗn hợp cao thịt, cao thịt, NaCl đã khuấy tan vào nồi agar; Khuấy cho hỗn hợp cho đều. Tiến hành bổ sung nước cho đạt yêu cầu của công thức và khuấy đều. Sử dụng phễu thủy tinh rót (khoảng 200ml ) môi trường thu được vào mỗi erlen 250 ml, đậy nút bông, mang hấp khử trùng ở 1210C, 1atm, trong 30 phút. + Sau đó tiến hành đổ lên đĩa petri (đĩa đã được hấp tiệt trùng và sấy khô lại trước khi đổ môi trường). Tiến hành giữ đĩa ở nhiệt độ phòng thí nghiệm khoảng 48h, quan sát, nếu không bị nhiễm khuẩn thì tiến hành bảo quản trong tủ lạnh (khoảng 40C) cho đến lúc dùng. [13], [11], [11] ™ Môi trường giữ giống: Vật liệu và phương pháp -20- - Sử dụng môi trường cao thịt – pepton (môi trường thạch nghiêng), thành phần môi trường giống như môi trường phân lập. - Cách pha môi trường giống như phần phân lập. Chỉ khác là rót môi trường thu được vào ống nghiệm, đậy nút bông, mang hấp khử trùng ở 1210C, 1 atm, trong 30 phút. Sau khi khử trùng xong, các ống môi trường được lấy ra, nghiêng trên một vật có độ cao vừa phải để tạo độ nghiêng sao cho chiều dài của môi trường không quá 2/3 chiều cao ống nghiệm. Tiến hành giữ ống nghiệm ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong khoảng 48h, quan sát, nếu không nhiễm khuẩn thì tiến hành bảo quản trong tủ lạnh (khoảng 40C) cho đến lúc dùng. [13], [11], [11] 2.1.2.2 Môi trường khảo sát amylase ngoại bào: - Thành phần môi trường: Tinh bột tan : 0,4g K2HPO4 : 0,2g KH2PO4 : 0,2g MgSO4 . 7 H2O : 0,1g MnSO4 . 4 H2O : 0,005g FeSO4 . 7 H2O : 0,005g Na2MoO4 : 0,001g ZnSO4 . 7 H2O : 0,001g CoCl2 : 0,01g CaCl2 : 0,01g CaSO4 . 5 H2O : 0,001g Agar : 20g Nước : 1000ml - Cách pha môi trường: + Cân, đong chính xác các thành phần của môi trường. + Tiến hành hồ hóa tinh bột, và khuấy tan lượng muối khoáng (sử dụng khoảng 200 ml nước để khuấy). Đồng thời, khuấy nhiệt liên tục agar trong một phần nước cho đến khi tan hoàn toàn. Sau đó, cho hỗn hợp tinh bột và muối khoáng trên vào agar đã Vật liệu và phương pháp -21- tan, khuấy đều, bổ sung nước cho đạt theo công thức. Tiến hành rót môi trường thu được vào erlen 250 ml (khoảng 200ml/erlen), đậy nút bông, mang hấp ở 1210C, 1 atm, 30 phút. [13], [18], [8], [11], [11] + Tiến hành đổ lên đĩa petri và quan sát, bảo quản như phần 2.1.2.1. 2.1.2.3 Môi trường khảo sát protease ngoại bào: - Thành phần môi trường: Casein: : 1g K2HPO4 : 0,2g KH2PO4 : 0,2g MgSO4 . 7 H2O : 0,1g MnSO4 . 4 H2O : 0,005g FeSO4 . 7 H2O : 0,005g Na2MoO4 : 0,001g ZnSO4 . 7 H2O : 0,001g CoCl2 : 0,01g CaCl2 : 0,01g CaSO4 . 5 H2O : 0,001g Agar : 20g Nước : 1000ml - Cách pha môi trường: + Tiến hành khuấy tan casein trong một lượng nhỏ dung dịch đệm Sorensen pH 7.6, khuấy tan hỗn hợp muối khoáng (trong khoảng 200 ml nước). Đồng thời, khuấy nhiệt cho tan agar trong nước. Sau đó, cho casein, muối khoáng đã khuấy vào agar này. Bổ sung nước cho đủ lượng của công thức. Rót môi trường vừa pha vào erlen 250ml (khoảng 200ml/erlen), đậy nút bông và mang hấp ở 1210C, 1 atm, 30 phút. [14], [13], [18], [8], [11], [11] + Tiến hành đổ lên đĩa petri và quan sát, bảo quản như phần 2.1.2.1. 2.1.2.4 Môi trường nuôi cấy khảo sát hoạt độ amylase: - Thành phần môi trường: Vật liệu và phương pháp -22- Tinh bột tan : 0,4g K2HPO4 : 0,2g KH2PO4 : 0,2g MgSO4 . 7 H2O : 0,1g MnSO4 . 4 H2O : 0,005g FeSO4 . 7 H2O : 0,005g Na2MoO4 : 0,001g ZnSO4 . 7 H2O : 0,001g CoCl2 : 0,01g CaCl2 : 0,01g CaSO4 . 5 H2O : 0,001g Nước : 1000ml - Cách pha môi trường: + Cân, đong chính xác các thành phần của công thức. + Tiến hành hồ hóa tinh bột, và khuấy tan lượng muối khoáng trong nước (khoảng 200 ml). Hòa hỗn hợp nước,tinh bột và muối khoáng cho đủ theo công thức. Sau đó rót môi trường thu được vào erlen 250 ml (khoảng 100ml/ erlen), mang hấp ở 1210C, 1 atm, 30 phút. Để nguội, cấy giống vi khuẩn vào. Đặt lên máy lắc, khảo sát. [13], [18], [11], [11] 2.1.2.5 Môi trường nuôi cấy khảo sát hoạt độ protease - Thành phần môi trường (Dùng chung cho các loại vi khuẩn): Casein: 1g K2HPO4 : 0,2g KH2PO4 : 0,2g MgSO4 . 7 H2O : 0,1g MnSO4 . 4 H2O : 0,005g FeSO4 . 7 H2O : 0,005g Na2MoO4 : 0,001g ZnSO4 . 7 H2O : 0,001g Vật liệu và phương pháp -23- CoCl2 : 0,01g CaCl2 : 0,01g CaSO4 . 5 H2O : 0,001g Nước : 1000ml - Cách pha môi trường: + Cân, đong chính xác các thành phần của môi trường. + Tiến hành khuấy tan casein trong một ít dung dịch đệm sorensen pH 7.6, và khuấy tan muối khoáng trong nước. Hòa hỗn hợp casein, muối khoáng, nước vào nhau. Sau đó, rót môi trường thu được vào erlen 250 ml (khoảng 100ml/erlen), mang hấp ở 1210C, 1 atm, 30 phút. Để nguội, cấy giống vi khuẩn vào. Đặt lên máy lắc khảo sát. [11], [13], [18], [11], [11] 2.1.2.6 Môi trường khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng lên hoạt độ amylase Thành phần môi trường dùng cho Bacillus subtilis: (môi trường Edwards) - Thành phần Môi trường nuôi cấy khảo sát hoạt tính amylase: Tinh bột tan : 0,4g Cao thịt : 3g Pepton : 5g NaCl : 8g Glucose : 0,1g CaCl2 .2 H2O 0,08g Dung dịch nguyên tố khoáng : 100ml Nước cất : 900ml - Dung dịch nguyên tố khoáng có thành phần như sau: (NH4)2SO4 : 20g MnSO4 : 0,5g CuSO4 .5H2O : 0,5g MgSO4 : 20g ZnSO4 . 7 H2O : 0,5g FeSO4 . 7 H2O : 0,05g Vật liệu và phương pháp -24- Nước cất : 1000ml - Cách pha môi trường tương tự như phần môi trường nuôi cấy thử hoạt tính amylase. [13], [18], [16], [17] 2.1.2.7 Môi trường khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng lên hoạt độ protease Thành phần môi trường dùng cho Bacillus subtilis: (môi trường Edwards) - Môi trường nuôi cấy khảo sát hoạt tính protease: Casein : 1g Cao thịt : 3g Pepton : 5g NaCl : 8g Glucose : 0,1g CaCl2 .2 H2O : 0,08g Dung dịch nguyên tố khoáng : 100ml Nước cất : 900ml - Dung dịch nguyên tố khoáng có thành phần như sau: (NH4)2SO4 20g MnSO4 0,5g CuSO4 .5H2O 0,5g MgSO4 20g ZnSO4 . 7 H2O 0,5g FeSO4 . 7 H2O 0,05g Nước cất 1000ml - Cách pha môi trường tương tự như môi trường nuôi cấy thử hoạt tính protease. 2.1.2.8 Môi trường nước ao cá Tra: Nước ao nuôi cá Tra theo quy mô công nghiệp được lấy theo phương pháp lấy mẫu theo đúng chương trình lấy mẫu và bảo quản (TCVN 5993 -1995; ISO 5667 – 3: 1985). Dùng phân lập các chủng vi khuẩn và dùng thử nghiệm tác động của chủng vi khuẩn đang nghiên cứu lên môi trường nước ao cá Tra. [4 ], [6 ], [20], [12], [13], [18], [16], [17] Vật liệu và phương pháp -25- 2.2 Phương pháp 2.2.1 Phương pháp phân lập 2.2.1.1 Phương pháp lấy mẫu nước Phương pháp trích dẫn TCVN 5993 -1995; ISO 5667 – 3: 1985 - Lấy mẫu đơn. - Chọn mẫu từ nhiều điểm của ao (4 điểm tại cạnh bên của mặt ao, và điểm giữa ao). Đối với mẫu nước dùng cho thử nhiệm tác động của vi khuẩn lên môi trường nước ao thì tiến hành hòa trộn chung vào nhau các mẫu đơn. [3], [19], [12], [11] - Thời điểm lấy mẫu: Vào buổi sáng khi chưa thay nước ao (Đối với lấy mẫu nước để phân lập vi khuẩn). Và vào buổi sáng sau khoảng 1giờ sau khi cho cá ăn xong. (đối với lấy mẫu nước dùng cho thử nghiệm tác động của vi khuẩn lên môi trường nước ao nuôi cá Tra). - Giữ mẫu ở nhiệt độ thích hợp khoảng 40C, trong bình chứa sạch (bình nhựa khử trung bằng cồn 960 , hoặc bình thủy tinh đã được hấp tuyệt trùng), thích hợp, đã chuẩn bị sẳn ở phòng thí nghiệm. Ghi vào bình chứa mẫu các thông tin như: Ngày và giờ lấy mẫu, tên người lấy mẫu, nguồn và địa điểm lấy mẫu, các giá trị thông số phân tích tại hiện trường như pH, nhiệt độ. - Vận chuyển mẫu trong thùng mướp, có ướp nước đá (giữ ở khoảng 40C). [3], [45], [19], [12], [11] 2.2.1.2 Phương pháp phân lập và giữ giống - Cấy trải mẫu nước của môi trường cần phân lập lên đĩa thạch (kỹ thuật hộp trải). - Làm thuần khuẩn lạc bằng cách ria mỗi khuẩn lạc riêng biệt lên đĩa thạch theo kỹ thuật hộp ria. - Tiến hành giữ giống các khuẩn lạc đã được làm thuần lên ống thạch nghiêng, bằng phương pháp cấy trên ống thạch nghiêng. Giữ các ống này ở nhiệt độ khoảng dưới 50C. [12], [13], [18], [11], [11], [61] 2.2.1.3 Phương pháp nhuộm Gram: Vật liệu và phương pháp -26- ™ Tiến hành: Nuôi cấy chủng vi khuẩn đã làm thuần lên môi trường thạch nghiêng cao thịt- pepton, giữ ở 37 0C. Sau 18 – 24h, tiến hành nhuộm Gram vi khuẩn. [12], [18], [11], [11] ™ Hóa chất: -Crystal violet - Fuchsine kiềm - Lugol - Cồn 960C ™ Tiến hành: Việc nhuộm Gram được thực hiện theo các bước sau: - Nhỏ giọt nước lên một phiến kính sạch, tạo huyền phù với vi khuẩn cần nhuộm. Chờ vết bôi khô tự nhiên rồi cố định vi khuẩn bằng cách đem hơ nhẹ phiến kính qua ngọn lửa đèn cồn. - Phủ hoàn toàn vết bôi với Crystal violet. Để yên 1- 2 phút rồi nhẹ nhàng rữa trôi thuốc nhuộm dư bằng nước. - Nhỏ dung dịch lugol trong khoảng 30 giây, rồi nhẹ nhàng rữa lại với nước. - Tẩy cồn 960 bằng cách để nghiêng phiến kính, cho cồn chạy từ từ ở mép trên phiến kính. Quan sát ở mép dưới cho đến khi giọt cồn vừa mất màu tím. Sau đó rữa với nước. - Phủ hoàn toàn vết bôi với fuchsine kiềm, để yên trong 1 phút, rữa lại với nước. - Làm khô phiến kính với giấy thấm. Khi phiến kính khô hoàn toàn, quan sát dưới kính hiển với vật kính dầu. ™ Đọc kết quả như sau: Vi khuẩn Gram âm sẽ thấy màu hồng, vi khuẩn Gram dương sẽ thấy màu tím. Vi khuẩn đã hình thành bào tử, bào tử trong suốt không bắt màu nằm trong tế bào sinh dưỡng bắt màu Gram. Hoặc bào tử phóng thích ra ngoài sẽ tạo một rìa màu hồng xung quanh khối trong suốt. 2.2.1.4 Phương pháp quan sát vi sinh vật: ™ Quan sát hình thái khẩn lạc Vật liệu và phương pháp -27- Vi khuẩn khi phát triển trên bề mặt môi trường đặc sẽ hình thành các khuẩn lạc đặc trưng cho loài đó. Việc miêu tả các khuẩn lạc là một trong các việc rất cần thiết đối với công tác định tên loài vi khuẩn nghiên cứu. Khi miêu tả khuẩn lạc cần ghi nhận các đặc điểm như: Hình dạng khuẩn lạc, màu sắc, xem có tiết sắc tố vào môi trường hay không, bề mặt, mặt cắt ngang, mép khuẩn lạc. ™ Quan sát đặc điểm tế bào (Không nhuộm màu): Quan sát vi khuẩn ở trạng thái sống không nhuộm màu. Dùng que cấy vòng lấy một giọt nước muối đã được hấp vô trùng (dung dịch nước muối NaCl 0,1%) lên phiến kính, sau đó dùng que cấy vòng lấy một lượng thật ít sinh khối khuẩn lạc lên giọt nước trên phiến kính; Để cạnh một lá kính lên phiến kính hợp thành 1góc 450 , rồi từ từ hạ xuống giọt nước. Như thế giọt nước chứa vi sinh vật muốn quan sát được ép giữa phiến kính và lá kính. Sau đó tiến hành quan sát vi khuẩn trong các giọt nước. Sử dụng vật kính 100X. [12], [18], [12], [13], [11], [11] 2.2.2 Phương pháp xác định trực tiếp số lượng vi sinh vật bằng buồng đếm hồng cầu: Sử dụng buồng đếm Geriep là một phiến kính dày hình chữ nhật, ở giữa là phần lõm phẳng, chia làm 3 khoảng ngang. Khoảng giữa chia thành 2 khoảng nhỏ. Trên mỗi khoảng nhỏ này có kẻ 1 lưới đếm, gồm rất nhiều ô vuông. Mỗi ô lớn lại chia thành 16 ô nhỏ, có diện tích 1/400 mm2 và chiều cao là 1/10 mm. Như vậy, thể tích ô nhỏ là 1/ 4000 mm3. Phòng đếm có lá kính dày để đậy. [13], [12], [11] ™ Tiến hành: Lắc đều ống nghiệm pha loãng mẫu. Đậy lá kính lên lưới đếm. Dùng pipet có đầu týp vô trùng hút lấy mẫu, cho 1 giọt vào mép lá kính. Đặt buồng đếm lên bàn kính hiển vi và để yên trong 3 - 5 phút, tiến hành đếm tế bào trong 5 ô lớn chéo nhau, chỉ đếm các tế bào nằm trong lòng ô con và những tế bào nằm trên hai cạnh liên tiếp cùng chiều. Đếm lần lượt từ ô con 1 đến ô con 16. Đảm bảo số tế bào đếm được trong 5 ô lớn phải trên 200 mới đảm bảo được mức độ chính xác của phương pháp. ™ Cách tính kết quả: Số tế bào trên một ml mẫu phân tích (N) được tính như sau: Vật liệu và phương pháp -28- N (tế bào/ ml) = b a n−∗∗∗ 10104000 3 Trong đó: a: Số tế bào trong 5 ô lớn (80 ô). b: Số ô con trong 5 ô lớn (16 ô x 5 = 80 ô con). 103: Số chuyển mm3 thành ml (1000mm3). 10-n: Độ pha loãng mẫu. 2.2.3 Phương pháp định lượng tế bào bằng phương pháp đo mật độ quang: ™ Nguyên tắc: Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới cũng làm môi trường trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỉ lệ với mật độ tế bào. Do vậy, có thể định lượng mật độ tế bào một cách gián tiếp thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở bước sóng 610 nm. [13], [12], [11], [11] ™ Tiến hành: Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ tế bào. Pha loãng một huyền phù tế bào cần kiểm nghiệm có mật độ tế bào bất kỳ thành các huyền phù khác nhau có độ đục đo OD ở 610 nm đạt các giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. Đo OD ở 610 nm của các huyền phù vừa được pha, ghi nhận các số đo thực tế. Dùng phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi (dùng buồng đếm hồng cầu) xác định mật độ tế bào (N/ ml) của các huyền phù này. Tính giá trị log (N/ ml) cho mỗi giá trị mật độ N/ml tương ứng với độ đục. Vẽ đường biểu diễn của log (N/ ml) theo OD ở 610 nm. ™ Xác định mật độ tế bào theo độ đục: Đo độ đục của một huyền phù tế bào cần xác định mật độ. Từ giá trị OD ở bước sóng 610 nm đo được, suy ra số log (N/ ml) và trị số mật độ N/ ml từ đường chuẩn. 2.2.4 Phương pháp khảo sát khả năng tổng hợp amylase, protease ngoại bào 2.2.4.1 Amylase: ™ Nguyên tắc: Vật liệu và phương pháp -29- Một số vi sinh vật có khả năng tiết ra enzyme amylase có tác dụng phân giải tinh bột thành các đường đơn để vi khuẩn dễ sử dụng. Phản ứng này dễ nhận biết khi ta nhỏ dung dịch lugol vào môi trường thạch nuôi cấy, nếu trong môi trường có tinh bột thì sẽ chuyển sang màu xanh đậm. nếu trong môi trường không còn tinh bột thì lugol không làm chuyển màu môi trường. [16], [12], [13], [18], [11] ™ Tiến hành - Môi trường thạch đĩa dinh dưỡng tăng sinh amylase (tại mục 2.1.2.2) có chứa 0.4% tinh bột. - Hoạt hóa chủng vi sinh vật thử nghiệm ở 370C/ 24h - Cấy chủng vi sinh vật mới hoạt hóa thành vạch trên đĩa môi trường. - Ủ ở 370C/ 48h. - Nhỏ lugol và quan sát kết quả. 2.2.4.2 Protease ™ Nguyên tắc: Casein là một loại protein sữa, không thể thấm qua màng tế bào vi khuẩn. Cho nên, trước khi vi khuẩn sử dụng casein như là nguồn carbon và năng lượng của chúng, thì casein cần phải được phân giải thành các amino acid. Do đó, vi khuẩn cần phải tiết ra enzyme protease phân giải casein thành các amino acid để có thể chuyển vào trong tế bào. Khi sữa được phối trộn vào môi trường thạch dinh dưỡng, casein làm cho sữa có màu trắng đục. Sau quá trình ủ, vi khuẩn sẽ tiết ra enzyme protease (Caseinase) tạo ra một vùng bị phân giải (vùng trong xung quanh khuẩn lạc) đối với phản ứng dương tính. Khi phản ứng âm tính thì môi trường xung quanh vi khuẩn vẫn đục. [16], [12], [13], [18] ™ Tiến hành - Môi trường thạch đĩa dinh dưỡng tăng sinh protease (tại mục 2.1.2.3) có chứa 1% casein. - Hoạt hóa vi khuẩn cần thử nghiệm ở 370C/ 24h - Cấy vi khuẩn mới hoạt hóa thành vạch lên đĩa môi trường. - Ủ ở nhiệt độ 37 0C / 48h. Vật liệu và phương pháp -30- - Quan sát kết quả. 2.2.5 Phương pháp xác định hoạt độ protease theo Anson: ™ Nguyên tắc: Cho protease tác dụng với cơ chất là casein, sản phẩm tạo thành là các peptide ngắn hay acid amin, trong các loại acid amin thì Tyrosine chiếm đa số. Xác định Tyrosine bằng phản ứng màu với thuốc thử folin, từ đó xác định được hoạt độ enzyme protease theo định nghĩa: Hoạt độ của protease được biểu thị là số μmol Tyrosine sinh ra do thủy phân casein bởi 1 ml dung dịch hay 1mg hỗn hợp chứa protease trong 1 phút ở điều kiện chuẩn (35,50C, pH 7,6 ). [6], [7], [35], [18], [19], [20], [8] ™ Hóa chất: - Đệm sorensen pH 7,6 - Dung dịch casein 1% - Dung dịch TCA (acid tricloacetic) 10%. - Dung dịch NaOH 0,5N - Dung dịch HCl 0,2 N - Dung dịch Tyrosine 20 mM/ l: Khuấy nghiền 0,118g Tyrosine trong dung dịch HCl 0,2N vừa đủ 50 ml. - Dung dịch Tyrosine chuẩn 1mM/ l: Pha loãng 5 ml Tyrosine 20 mM/ l trong HCl 0,2 thành 100ml. ™ Tiến hành: - Dựng đường chuẩn Tyrosine: Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Dung dịch Tyrosine chuẩn 1mM/ l (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Dung dịch HCl 0,2N (ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 2 2 2 2 2 2 Thuốc thử Folin (ml) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 Lượng Tyrosine (μmol) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Lắc và để yên 10 phút, đem đo mật độ quang ở bước sóng 660nm Vật liệu và phương pháp -31- Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên mật độ quang (∆OD) theo lượng Tyrosine các ống - Xác định lượng Tyrosine trong dung dịch nghiên cứu: Ống nghiệm Thử không Thử thật Dung dịch hóa chất 1 2 3 1 2 3 Casein 1% (ml) 5 5 5 5 5 5 TCA 10% (ml) 5 5 5 0 0 0 Dịch enzyme mẫu (ml) 0 0 0 1 1 1 Lắc đều và giữ ở 35,50C trong 30 phút TCA 10% (ml) 0 0 0 5 5 5 Dịch enzyme mẫu (ml) 1 1 1 0 0 0 Lọc, lấy 1 ml dịch lọc thực hiện phản ứng màu Dịch lọc 1 1 1 1 1 1 Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 2 2 2 2 2 2 Thuốc thử Folin (ml) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 Lắc đều, để yên 10 phút, đo OD ở bước sóng 660 nm ™ Công thức tính: vt Vx ĐVHT ∗ ∗= Trong đó: ĐVHĐ: Đơn vị hoạt độ (UI/ml). x: số μml Tyrosine suy ra từ đường chuẩn. V: Tổng thể tích hỗn hợp phản ứng. v: Thể tích dịch lọc đem phân tích. t: Thời gian phản ứng. 2.2.6 Phương pháp xác định hoạt độ amylase theo Heinkel ™ Nguyên tắc Amylase xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột thành đường (đường đơn, đường đôi, hay dextrin phân tử lượng lớn). Lượng tinh bột còn lại phản ứng màu với iod. Xác Vật liệu và phương pháp -32- định lượng tinh bột bị thủy giải, từ đó tính ra hoạt độ amylase theo định nghĩa: Hoạt tính amylase được biểu thị là số mg tinh bột bị thủy giải bởi 1ml dịch enzyme (hay 1mg nguyên liệu chứa enzyme) trong 1 phút ở điều kiện chuẩn 500C, pH 6. [35], [18], [19], [20] ™ Hóa chất Dung dịch NaH2PO4 0.05M: Hòa tan 1.9502 g NaH2PO4 .2H2O trong nước thành 250 ml. Dung dịch Na2HPO4 0.05M: Hòa tan 0.8962g Na2HPO4 .12H2O trong nước thành 50ml. Dung dịch đệm phosphat 0.05M, pH 6: Trộn 87,7 ml dung dịch NaH2PO4 0.05M với 12.3 ml dung dịch Na2HPO4 0.05M, thêm 100 ml nước cất, đo lại pH bằng máy đo pH. - Dung dịch tinh bột 1% pha trong đệm phosphat 0.05M, pH6: Lấy 50ml dung dịch đệm phosphat 0.05M, pH6 đem đun sôi. Cân 1g tinh bột, hòa vào 1 ít đệm, khuấy đều, đổ vào dung dịch đệm đang đun sôi, vừa khuấy vừa đun sôi trong 3 phút cho đến khi dung dịch trong suốt. Định mức tới 100ml bằng dung dịch đệm. - Dung dịch iod: 1g I2 và 2g KI, thêm nước vào thành 100ml, bảo quản lạnh. Khi dùng pha loãng 500 lần. - Dung dịch HCl 1 N: 8.4ml HCl đậm đặc pha thành 100ml. - Dung dịch HCl 0.1N: Pha loãng từ dung dịch HCl 1N. - NaCl 1% ™ Tiến hành: Dựng đường chuẩn tinh bột: Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 Tinh bột 10mg/ml (ml) 0 1 2 3 4 5 Dung dịch đệm (ml) 5 4 3 2 1 0 Nồng độ tinh bột (mg/ml) 0 2 4 6 8 10 - Hút 0.1ml dung dịch từ các ống nghiệm thêm 0.9ml dung dịch đệm, thêm vào 9ml dung dịch I2KI đã pha loãng 500 lần. - Đem so màu ở bước sóng 560 nm. - Vẽ đồ thị biểu thị mối tương quan giữa nồng độ tinh bột và giá trị ∆OD. Vật liệu và