Vật liệu và phương pháp nghiên cứu đậu nành

PHẦN II VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu - Nguyên liệu: + Đậu hũ mua ở chợ + Okara do công ty cổ phần sữa Việt Nam Vinamilk cung cấp - Giống vi sinh vật sử dụng: + Lactobacillus sp. + Bacillus subtilis + Nấm Linh chi Do phòng thí nghiệm Công nghệ biến đổi sinh học cung cấp - Các hóa chất, dụng cụ và máy móc tại Viện Sinh học nhiệt đới. - Enzyme cellulase thương phẩm có tên thương mại là celluclast của hãng Novo - Đan Mạch. 2.2. Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật 2.2.1. Phương pháp nghiên cứu hình thái; các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn Lactobacillus.sp 2.2.1.1. Phương pháp quan sát hình thái vi sinh vật Phương pháp nhuộm Gram [4][6] Nguyên tắc: Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào với thuốc tím kết tinh (crystal violet) và iod mà vi khuẩn chia làm 2 nhóm khác nhau là: Nhóm thứ nhất vẫn giữ nguyên màu tím của thuốc nhuộm, không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn do có lớp vỏ tế bào dày tạo bởi peptidoglycan. Cồn làm cho các lỗ trong peptidoglycan co lại do đó phức chất tím tinh thể - iod bị giữ lại trong tế bào. Vi sinh vật thuộc nhóm này là Gram dương. Nhóm thứ hai có lớp vỏ tế bào mỏng hơn (do có ít peptidoglycan hơn) nhưng lượng lipid của lớp màng ngoài cao hơn; khi bị tẩy bằng cồn, lipid bị hòa tan nhiều hơn và vi khuẩn mất màu. Khi nhuộm bổ sung, chúng sẽ bắt màu thuốc nhuộm mới (đỏ vàng, đỏ tía, hồng). Vi sinh vật nhóm này là Gram âm. Cách tiến hành: - Lau nhẹ sạch tiêu bản bằng giấy mềm, hơ qua đèn cồn. - Dùng bút lông ghi tên mẫu, vẽ vòng tròn phía dưới mặt lame để đánh dấu vết khuẩn phía trên lame. - Nhỏ dung dịch NaCl 9 ‰ lên giữa vòng tròn. - Dùng que cấy khử trùng để nguội lấy một ít sinh khối vi khuẩn hòa vào giọt NaCl 9 ‰ trên lame. - Dàn mỏng thành vết bôi, cố định bằng cách hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn. - Đặt tiêu bản lên thanh thủy tinh chữ U, trên thau nhựa. - Đặt miếng giấy lọc lên vòng phết kính. - Nhỏ dung dịch Crystal violet thấm ướt hết giấy lọc, để yên từ 30 giây - 1 phút, rửa trôi thuốc nhuộm dư với nước. - Nhỏ dung dịch Lugol, để 30 giây, rửa lại nhẹ nhàng với nước. - Tẩy màu bằng cồn 96o từ 15-20 giây: giữ phiến kính ở góc nghiêng nhỏ và cẩn thận nhỏ giọt cồn cho cồn chảy ngang qua vết bôi cho đến khi không thấy vết thuốc nhuộm chảy theo. Ngay lập tức rửa vết bôi lại với nước. Thời gian khử màu trong bước này đóng vai trò quyết định kết quả của quá trình nhuộm. - Phủ hoàn toàn vết bôi với safranin và để yên trong vòng 30 giây. Rửa với nước. - Thấm khô phiến kính với giấy thấm. Khi phiến kính khô hoàn toàn, quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu x100. 2.2.1.2. Các đặc tính sinh lý của vi khuẩn lactic ™ Phương pháp định tính acid lactic Nguyên tắc: - Khi tác dụng với acid lactic, thuốc thử Ufermen sẽ đổi màu từ xanh tím sang màu vàng. Quan sát sự đổi màu của thuốc thử ta có thể xác định được khả năng tạo acid lactic của vi khuẩn. Cách tiến hành: - Chuẩn bị khoảng 5 ml môi trường dinh dưỡng, cấy vi khuẩn đã phân lập vào. - Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng khoảng một ngày. Sau đó cho dịch lên men phản ứng với thuốc thử Ufermen. - Chuẩn bị các ống nghiệm chứa các thành phần như sau: Ống 1: 3 ml dịch môi trường, 1 ml thuốc thử Ufermen. Ống 2: 3 ml dịch lên men, 1 ml thuốc thử Ufermen. Ống 3: 3 ml acid lactic 98%, 1 ml thuốc thử Ufermen. - Quan sát và nhận xét sự đổi màu của thuốc thử. ™ Phương pháp định lượng acid [36] Nguyên tắc: Acid tổng được đo bằng cách chuẩn độ với NaOH 0,1M; thêm 1-2 giọt phenolphtalein 1% làm chất chỉ thị. Kết quả % acid lactic được tính theo công thức: mmẫu x 1000 x D (2.1) 90: trọng lượng phân tử acid lactic (g) D: độ pha loãng Cách tiến hành: Cân 10g mẫu hòa tan vào 90ml nước cất. Thêm 1-2 giọt phenolphtalein 1%. Chuẩn độ với NaOH 0,1M. % acid lactic = = = VNaOH x NaOH 0,1M x 90 x 100 * Độ Therner Một độ Therner tương đương một ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ 100ml nguyên liệu. 2.2.1.3. Các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Lactobacillus.sp [33] - Oxydase (-) - Catalase (-) - Nitratase (-) - Lên men glucose ™ Thử nghiệm oxydase [25] : Nguyên tắc: Thử nghiệm này nhằm xác định sự hiện diện của hệ enzyme oxidase ở vi sinh vật. Thành viên quan trọng nhất của hệ thống này là cytochrome oxidase trong chuỗi truyền điện tử của hô hấp hiếu khí với O2 là chất nhận điện tử sau cùng nên chỉ hiện diện trong các loài vi sinh vật hiếu khí hay kị khí tùy ý. Số chủng loại cytochrome trong tế bào thay đổi tùy thuộc vào từng loại vi sinh vật. Hoạt tính cytochrome oxidase được phát hiện nhờ thuốc thử p – phenylendiamin. Trong điều kiện có sự hiện diện của cytochrome c khử trong tế bào, thuốc thử này bị oxy hóa thành một hợp chất indolphenol có màu xanh dương. Cách tiến hành: Cấy sinh khối chủng thuần lên ống thạch nghiêng nutrient agar, ủ ở 37oC trong 24-48giờ. Chuyển một ít sinh khối từ khuẩn lạc vào nước muối sinh lý vô trùng, lắc đều. Dùng pipette nhỏ một giọt dung dịch trên vào đĩa giấy thử hoạt tính oxydase. Quan sát và ghi nhận sự xuất hiện màu xanh dương trong vài phút. Đọc kết quả: Thử nghiệm oxidase dương tính (+) khi xuất hiện màu xanh dương đậm, nếu không có sự xuất hiện của màu xanh này thì phản ứng là âm tính (-) ™ Thử nghiệm catalase [25]: Nguyên tắc: Các vi sinh vật hiếu khí và kị khí tùy ý chứa chuỗi truyền điện tử có cytochrome đều có catalase (trừ các Streptococcus spp.). Enzyme này là một trong các thành viên của hệ thống các enzyme có vai trò bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của oxy phân tử trong tế bào hiếu khí và kỵ khí tùy ý. Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi truyền điện tử tạo H2O2. Catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ các phân tử có độc tính cao này trong tế bào. Sự thủy phân hydrogen peroxide sẽ giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí. Cách tiến hành: Dùng que cấy vô trùng lấy một ít sinh khối từ khuẩn lạc thuần (tốt nhất là khuẩn lạc không quá 24 giờ) đặt lên 1 lam kính sạch. Nhỏ 1 giọt dung dịch H2O2 3% phủ lên khuẩn lạc. Ghi nhận sự sủi bọt nếu có. Đọc kết quả: Nếu thấy xuất hiện bọt khí là catalase (+). ™ Thử nghiệm nitratase [25]: Nguyên tắc: Các vi sinh vật có khả năng khử nitrate tổng hợp hệ enzyme nitratase xúc tác sự khử nitrate thành nitrite và nitơ phân tử . Sự khử nitrate còn được gọi là sự phản nitrate hóa, diễn ra trong điều kiện có oxy phân tử. Đây là cách biến dưỡng năng lượng theo cách hô hấp kỵ khí. Sản phẩm cuối cùng của sự khử này có thể là nitrite (NO2-), ammonia (NH3), nitơ phân tử (N2)… tùy thuộc vào từng loài vi sinh vật và điều kiện môi trường. Nitrite được tạo ra từ nitrate sẽ phản ứng với sulphanilamide và N-napthylethyleneiamine hydrocloride ở pH acid cho hợp chất có màu hồng. Cách tiến hành: Cấy sinh khối chủng thuần vào ống nghiệm đã có 200µl nước muối sinh lý vô trùng, lắc đều. Chuyển đĩa giấy nitrate vào ống nghiệm trên, ủ ở 37oC qua đêm. Chuyển đĩa giấy đã được tẩm thuốc thử tìm nitrite vào ống nghiệm trên. Quan sát kết quả. Đọc kết quả: Phản ứng (+): có màu hồng xuất hiện. Ngược lại, nếu không chuyển màu thì thử nghiệm nitratase là (-). 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis 2.2.2.1. Phương pháp nhuộm Gram: Tương tự mục 2.2.1.3 2.2.2.2. Phương pháp nhuộm bào tử [4]: Với thuốc nhuộm Fuchsin, HCl 0,5%, H2SO4 1% và xanh methylen - Làm vết bôi trên một phiến kính sạch và để khô tự nhiên. - Nhỏ vài giọt HCl 0,5% lên vết bôi, hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến bốc hơi trong hai phút rồi rửa với nước. - Nhuộm vết bôi với thuốc nhuộm Fuchsin, qua miếng giấy lọc, hơ nóng cho đến bốc hơi trong vòng 5 phút. - Rửa vết bôi bằng nước - Tẩy màu bằng dung dịch H2SO4 1% trong 2 phút. - Rửa vết bôi bằng nước. - Nhuộm vết bôi bằng xanh methylen trong 5-15 phút - Rửa lại với nước và để khô tự nhiên. - Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu (x100). Bào tử sẽ mang màu đỏ, tế bào sinh dưỡng mang màu xanh. 2.2.2.3.Các đặc điểm sinh lý của vi khuẩn Bacillus subtilis [27][36] ™ Phương pháp xác định sinh khối tế bào B.subtilis bằng phương pháp đo độ đục Nguyên tắc Vi sinh vật trong phần lớn trường hợp là không có màu và hầu như trong suốt, vì vậy dịch huyền phù của các tế bào hấp thụ ánh sáng một cách không đáng kể trong vùng quang phổ ánh sáng thấy được. Việc giảm cường độ ánh sáng khi đi qua dịch huyền phù các tế bào, chủ yếu là liên quan đến việc tán xạ của ánh sáng. Trong những giới hạn nhất định, số lượng ánh sáng bị tán xạ do dịch huyền phù vi sinh vật, tỷ lệ thuận với lượng chứa các tế bào. Vì vậy khi trong cùng một chiều dài sóng ánh sáng đập vào, nếu số lượng các tế bào vi sinh vật càng lớn thì tán xạ sẽ càng cao. Yêu cầu dịch nuôi cấy vi sinh vật với sự phát triển của chúng đã làm đục đều môi trường. Nếu dịch huyền phù có nồng độ quá cao phải pha loãng bằng nước muối sinh lý trước khi đo. Độ tán xạ ánh sáng được đo bằng máy so màu quang điện. Xây dựng đồ thị chuẩn Để lập đường cong chuẩn, ta làm như sau: đo trị số tán xạ ánh sáng của các huyền phù có đậm độ khác nhau, dùng phương pháp Robert Koch để xác định số lượng tế bào trong 1ml môi trường. Trên cơ sở các số liệu nhận được, ta lập đường cong tiêu chuẩn bằng cách đặt trên trục tung các chỉ số của máy so màu quang điện, còn đặt trên trục hoành số lượng tế bào có chứa trong 1ml. Đối với mỗi loại vi sinh vật phải lập một đường cong tiêu chuẩn riêng. Số lượng tế bào (sinh khối) được xác định nhờ đường cong tiêu chuẩn theo phương pháp sau: đo trị số tán xạ ánh sáng của dịch huyền phù được phân tích, tìm điểm tương ứng với trị số đó trên trục tung, qua điểm này vẽ một đường song song với trục hoành cho tới chỗ cắt với đường cong tiêu chuẩn và từ điểm cắt này ta vẽ một đường thẳng góc xuống trục hoành. Căn cứ vào giao điểm này, ta xác định được số lượng tế bào (sinh khối) trong mẫu được phân tích. Cách thực hiện: Chuẩn bị môi trường canh NB phân vào bình thủy tinh, đem hấp vô trùng ở 121oC, 15 phút. Cấy tăng sinh: lấy một vòng que cấy vi khuẩn từ thạch nghiêng CP cấy vào một bình NB (nhân giống cấp 1), lắc ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Từ bình tăng sinh, dùng pippette vô trùng hút một thể tích canh khuẩn đem pha loãng sao cho mật độ tế bào ở OD540 ~ 0,1. Sau đó cấy dịch pha loãng này sang bình môi trường NB khác (nhân giống cấp 2), lắc 24 giờ. Từ bình tăng sinh cấp 2, dùng pippette vô trùng hút một thể tích canh khuẩn đem pha loãng sao cho mật độ tế bào đạt OD540 = 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8. Tại mỗi giá trị OD khác nhau, tiến hành trải dịch tăng sinh đã được pha loãng thích hợp lên môi trường thạch NA (nutrient agar), ghi nhận kết quả. ™ Khảo sát điều kiện pH ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển B. subtilis Nguyên tắc: pH là thước đo nồng độ ion hydro trong dung dịch. Dung dịch với nồng độ ion hydro tăng mang tính acid, ngược lại khi nồng độ ion hydro giảm thì mang tính kiềm. Hầu hết các vi khuẩn thuộc loại trung tính, biên độ pH khoảng 6,5 -7,5. Ta có thể thấy khả năng thích nghi của vi sinh vật khi nhìn vào môi trường sống của chúng. Ví dụ, vi sinh vật ở da có thể chịu được khoảng pH 5 và các vi sinh vật ở dạ dày-ruột có thể chịu được khoảng pH 3. Các vi sinh vật có thể chịu được khoảng pH thấp nhưng không tăng trưởng được thuộc nhóm không ưa acid. Các vi sinh vật có thể chịu được và tăng trưởng được ở pH thấp thuộc nhóm ưa acid. Nhóm vi sinh vật ưa acid quan trọng là nấm (nấm có biên độ pH tối ưu là 4-6). Một tế bào có thể phân chia theo cấp số nhân cho đến khi hình thành một khuẩn lạc có thể trông thấy được. Đây là cơ sở của việc định lượng tế bào trên thạch đĩa, bởi vì số lượng khuẩn lạc sinh ra từ một thể tích giống vi sinh vật nhất định chỉ số lượng tế bào sống có trong thể tích giống đó. Thông thường, tất cả các tế bào ở phase tăng trưởng hay giai đoạn sớm của phase ổn định đều có khả năng hình thành khuẩn lạc. Vì vậy, số lượng khuẩn lạc đếm được gần như tương đương với số lượng tế bào sống. Để định lượng chính xác, cần phải thực hiện sao cho mỗi một khuẩn lạc chỉ được hình thành từ một tế bào. Do dịch tế bào sử dụng trong các phòng thí nghiệm có nồng độ cao, thường nhiều hơn 106 tế bào/ml, nên cần thiết phải được pha loãng trước khi cấy. Phương pháp chuẩn là thực hiện các bước pha loãng để giảm nồng độ tế bào từ 10 đến 100 lần cho đến khi đạt vài nghìn tế bào/ml. Cách thực hiện: Cấy tăng sinh: Lấy một vòng que cấy vi khuẩn từ thạch nghiêng CP cấy vào một bình NB (20ml) (nhân giống cấp 1), lắc ở nhiệt độ phòng trong 48giờ. Từ bình tăng sinh, dùng pippette vô trùng hút một thể tích canh khuẩn đem pha loãng sao cho mật độ tế bào ở OD540 ~ 0,1. Sau đó cấy dịch pha loãng này sang các bình môi trường NB khác đã được chỉnh pH thích hợp (pH2 và pH 7) (tỉ lệ 1%). Khảo sát sinh khối sau 0 giờ, 8 giờ, 16 giờ, 24 giờ, 32 giờ, 40 giờ và 48 giờ. Sau mỗi thời gian quy định như trên, hút từ mỗi bình 5ml. Pha loãng dịch huyền phù tế bào ở các nồng độ thích hợp 10-1, 10-2, 10-3... Đem đo OD ở bước sóng 540nm. Chiếu lên đường cong chuẩn để tính được mật độ tế bào (CFU/ml). Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Kết quả sau khi tính toán được ghi nhận vào bảng bố trí thí nghiệm sau: Bảng 2.1. Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của B.subtilis CFU/ml Trạng thái nuôi pH 0 giờ 8 giờ 16 giờ 24 giờ 32 giờ 40 giờ 48 giờ 2 Lắc 7 2.2.2.4. Các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn B.subtilis [33] Protease Nitratase Amylase + + + ™ Phản ứng nitratase Tương tự như 2.2.1.4 ™ Phản ứng protease Nguyên tắc: Vi sinh vật tiết enzyme protease phân giải casein thành polypeptide và acid amin Cách tiến hành: Tăng sinh vi khuẩn B.subtilis trên môi trường sữa đậu nành trong 24 giờ. Đục một lỗ trên môi trường NB thạch đĩa có bổ sung 1% casein. Nhỏ dịch tăng sinh B.subtilis vào, ủ ở 37oC trong 24 giờ. Đọc kết quả: Nhỏ thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần lên bề mặt thạch. Kiểm tra vòng phân giải casein ™ Phản ứng amylase Nguyên tắc: Một số vi sinh vật có enzyme α-amylase thuộc nhóm hydrolase phân giải liên kết glycozide tạo thành dextrin có phân tử bé và maltose. Vì vậy dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột bị phân giải thành dextrin không cho phản ứng màu xanh tím với iod. Cách tiến hành: Tăng sinh vi khuẩn B.subtilis trên môi trường sữa đậu nành trong 24 giờ. Đục một lỗ trên môi trường Starch agar. Ủ ở 37oC trong 24 giờ. Khi đọc kết quả, dùng iod nhỏ lên bề mặt môi trường để quan sát đường kính vòng phân giải tinh bột. Đọc kết quả: Phản ứng (+): môi trường xung quanh vi khuẩn không màu, trong suốt, đó là vòng phân giải tinh bột Phản ứng (-): môi trường xung quanh vi khuẩn màu xanh tím 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu hình thái, hoạt chất sinh học của nấm sợi Linh chi 2.2.3.1. Phương pháp làm tiêu bản phòng ẩm để quan sát nấm sợi Linh chi [4] - Đặt vào đáy hộp petri một tờ giấy thấm, đặt tiếp lên đó một miếng lame. Đậy lại, gói giấy và đem khử trùng. - Đun chảy môi trường dinh dưỡng PGA đã khử trùng trong ống nghiệm. - Mở hé nắp đĩa petri gần ngọn lửa đèn cồn, đổ thạch trong ống nghiệm lên miếng lame sao cho thạch chảy dài thành một lớp mỏng một bên của tấm lame. - Khi thạch trên lame đã đặc lại, nhỏ nước cất vô trùng thấm đều tờ giấy thấm mà không tràn lên lame. - Dùng que cấy móc, khều nhẹ vào khuẩn lạc nấm sợi rồi chấm lên phần thạch của miếng lame trong phòng ẩm. - Hộp được gói giấy và nuôi ủ ở nhiệt độ phòng 2-3 ngày. - Mở hộp petri và lấy lame bên trong ra. - Dùng giấy thấm chùi mặt đáy của lame. - Đậy lamelle lên chỗ có khuẩn lạc mọc và đặt dưới kính hiển vi để quan sát mẫu. 2.2.3.2. Phương pháp xác định các hoạt chất sinh học của nấm sợi Linh chi [29] ™ Định tính saponin bằng phương pháp hóa học Phản ứng Liebermann-Burchard Cho vào ống nghiệm khoảng 0,5g dược liệu, thêm 5ml cồn 70o và đun cách thủy trong 5 phút. Lọc qua bông vào một chén sứ, cô trên bếp cách thủy đến cặn thật khô. Cho vào cặn này 1ml anhydrid acetic và 1 ml CHCl3, khuấy kỹ cho tan, Lọc bằng pipet Pasteur bịt bông, cho vào một ống nghiệm thật khô. Để ống nghiệm trên giá, nghiêng giá và dùng pipet cho thật nhẹ nhàng khoảng 0,5ml H2SO4 đậm đặc dọc theo thành ống nghiệm. Mặt ngăn cách giữa 2 lớp sẽ có màu từ nâu tới đỏ, đỏ-tím hay tím. Quan sát đồng thời lớp dung dịch phía trên có thể có màu xanh lá, xanh rêu, vàng-nâu, nâu-đỏ… ™ Định tính alkaloid Chuẩn bị mẫu: ngâm bột nguyên liệu trong dung dịch H2SO4 loãng 1%, sau đó cho lên nồi đun cách thủy 15 phút. Lọc nước chiết. Từ đây có thể định tính được alkaloid. Cách tiến hành: Dùng các loại thuốc thử sau: Thuốc thử Mayer: 1.35g HgCl2 hòa tan trong 100ml dung dịch KI 5%. Các alkaloid sẽ tủa vô định hình màu trắng vàng. Thuốc thử Wagner: hòa tan 5g I2 trong 100ml dung dịch KI 10%. Các alkaloid cho tủa màu nâu sáng đến nâu đen (phần lớn ở dạng tủa bông hoặc bột, đôi khi tạo thành giọt dầu có màu nâu đen). ™ Định tính steroid Phản ứng Salkowki: Hòa tan 1-2mg mẫu trong CHCl3 và nhỏ vào 1ml H2SO4 đậm đặc. Phản ứng dương tính là cho màu đỏ sẫm, xanh, xanh tím 2.2.4. Phương pháp khảo sát sự ảnh hưởng của nấm Linh chi đến sự phát triển của B.subtilis [36] ƒ Đối tượng Vi khuẩn Bacillus subtilis Cách tiến hành: - Đổ môi trường lên đĩa petri vô trùng - Dùng que cấy vòng cấy chuyền một ít sinh khối vi khuẩn từ ống giống qua các ống nghiệm chứa nước muối sinh lý vô trùng - Dùng pipetteman hút 0,1ml dịch vi khuẩn ở trên vào các đĩa môi trường. - Trải đều bằng que gạt thủy tinh. - Đặt lên mỗi đĩa 3 miếng sinh khối sợi nấm, đường kính mỗi miếng 1cm. - Ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng. - Quan sát kết quả thu được 2.3. Phương pháp xác định hoạt tính hệ enzyme của vi sinh vật sử dụng trong đề tài theo thời gian 2.3.1. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme amylase của B.subtilis [16] Nguyên tắc: Hoạt tính enzyme amylase được xác định theo phương pháp Smith và Roe (1966). Hoạt tính amylase biểu thị khả năng amylase xúc tác thủy phân tinh bột đến dextrin trong 1 phút ở 50oC và được thể hiện bằng số đơn vị của enzyme đó trong một gam mẫu. Khi phản ứng thủy phân tinh bột xảy ra, lượng tinh bột còn lại chưa bị phân hủy sẽ tạo phản ứng với iod và được đo bằng máy so màu quang học. Dụng cụ và hóa chất: Máy đo quang phổ. Bể ổn nhiệt. Dung dịch đệm phosphate (pH 6,2) + Dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M: 27,8 g Na2HPO4 hòa tan, dẫn nước đến 1000 ml (dung dịch a). + Dung dịch dinatri hydrophosphate: 53,05 Na2HPO4.7H2O hoặc 71,1 g Na2HPO4.12H2O hòa tan dẫn nước đến 1000 ml (dung dịch b). + Để chỉnh pH = 6,2: 81,5 ml dung dịch a + 18,5 ml dung dịch b. Dung dịch tinh bột 1%: 1 g tinh bột tan, cho vào bình định mức 100 ml, thêm 50 ml nước cất, lắc đều trong bể cách thủy 10 – 15 phút, đến khi tinh bột tan hoàn toàn, thêm 10 ml dung dịch đệm phosphate 6,2. Thêm nước cất cho đủ 100 ml. Dung dịch Lugol: cân chính xác 0,5 g iod + 5 g KI, thêm nước cất cho đủ 200 ml. Dung dịch HCl 1N: hòa tan 85 ml dung dịch HCl đậm đặc trong nước cất cho vừa đủ 1 lít. Dung dịch NaCl 3%: cân 3 g NaCl hòa tan với nước cất cho đủ 100 ml. Tiến hành: Dùng các ống nghiệm có đánh dấu sẵn và tiến hành cho vào các ống nghiệm các dung dịch và hóa chất Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm định lượng enzyme amylase Ống chuẩn Ống thử 1 ml nước cất 1 ml dịch enzyme các mẫu 1 ml đệm phosphate pH 6.2 1 ml đệm phosphate pH 6.2 1 ml dung dịch tinh bột 1% 1 ml dung dịch tinh bột 1% 0,5 ml dung dịch NaCl 3% 0,5 ml dung dịch NaCl 3% Đem ủ ở nhiệt độ 50oC trong 30 phút, sau đó cho mỗi ống 1 ml dung dịch HCl 1N để kiềm hãm sự hoạt động của enzyme. Cho nước cất đến 10 ml mỗ