Vật liệu và phương pháp nghiên cứu lên men

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Hoc trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TPHCM. 3.2. Thời gian thực hiện Đề tài được thực hiện từ ngày 5/04/2009 đến ngày 28/06/2010 3.3. Vật liệu 3.3.1. Thiết bị và dụng cụ - Máy đo quang phổ (UV – Vis) specific 20 genesis (USA) - Máy đo pH Horiba (Nhật Bản) - Autoclave (Memmert – Đức), - Kính hiển vi quang học Olympus – (Nhật Bản) - Cân phân tích, cân kỹ thuật. - Tủ cấy vô trùng, tủ ấm (Memmert – Đức), tủ sấy (Memmert – Đức) - Pipetman 100 – 1000 ml - Bếp điện - Bông thấm nước, bong không thấm nước - Giấy lọc, lame, lamell… - Cá dụng cụ thí nghiệm: becher, erlen, que cấy, đền cồn, bình định mức, ống đông, becher, pipette, crucible, giấy lọc. 3.3.2. Hóa chất + Các hóa chất dùng để pha các loại thuốc nhuộm : Tím kết tinh (Crystal violet), ethanol 95%, ammonoxalat, iod, KI, thuốc nhuộm fushin, lục malachite, xanh metylen, etanol, KOH, dung dịch acid carbolic, dung dịch acid tannic, FeCL3, formalin, NaOH, AgNO3,NH4OH, H2O2, dung dịch Tetramethy-p-phenylene diamine dihydrochloride, + Các hóa chất dùng để pha môi trường MRS (phụ lục 5). Đây là môi trường tổng hợp đặc hiệu cho việc nuôi cấy vi khuẩn lactic, tên đầy đủ là: de Man, Rogosa and Sharpe (Robinson. 2007) + Thuốc thử Uffelmann: Cho 2% dung dịch phenol tinh chất vào trong  nước. thêm dung dịch FeCl3 cho tới khi dung dịch phenol chuyển thành màu tím. + Thuốc thử xanh bromophenol (BPB): 2 g BPB, bổ sung dần 5 ml NaOH 0,1M, nghiền trong cối sứ, hòa với nước cất cho đủ 100 ml. 3.4. Phương pháp luận Theo tiêu chí an tòan sinh học là trên hết, cho nên đề tài chủ yếu tiến hành phân lập các vi khuẩn lên men lactic (LAB) vì chúng được xếp vào lọai GRAS (generally recognized as safe). Để phân lập trước hết cần chọn các nguồn vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống như nem, các loại sữa chua và các nguồn đã được nghiên cứu là có chứa hệ vi sinh vật đường ruột để phân lập ra các chủng vi khuẩn lactic và phân lập bằng phương pháp phân lập giống thuần khiết phổ biến trong phòng thí nghiệm vi sinh. Như đã đề cập ở mục 2.3.4.1, việc định danh LAB chủ yếu dựa vào các phương pháp cổ điển (như dựa vào hình thái, cấu trúc, sinh lý, sinh hóa) theo Bergey’s Manual (Benson Lab Manual, 2001) cùng với việc kiểm tra khả năng lên men các loại đường khác nhau và so sánh với khóa phân loại của Bergey để phân loại, định danh chúng đến cấp giống (hình 3.1 và 3.2). Chọn môi trường sử dụng trong suốt quá trình phân lập là môi trường MRS trong đó có bổ sung thêm 0.02% natri azide (NaN3) do chất này gây ức chế quá trình hô hấp cho nên loại bỏ được các vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, làm tăng tính chọn lọc của môi trường đối với LAB và giúp lọai bỏ phần lớn các vi khuẩn gây bệnh. Mục tiêu của đề tài tài là phân lập vi khuẩn lactic mang hoạt tính probiotic. Vì vậy để xác định những chủng đã phân lập có mang hoạt tính của một probiotics hay không ta tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của chúng bằng cách cho chúng đối kháng trực tiếp với sinh vật chỉ thị là E. coli và Salmonella bằng phương pháp đo độ đục (Turbidometric assay method). Nếu xác định được các chủng phân lập được có tính kháng khuẩn cao thì đã đạt được mục tiêu của đề tài. Hình 3.1: Sơ đồ phân lọai vi khuẩn theo kết quả nhuộm Gram và hình thái (theo khóa phân lọai của Bergey) Hình 3.2: Sơ đồ các bước phân lập và định danh vi khuẩn lactic Loại bỏ vi khuẩn kị khí bắt buộc Môi trường thuận lợi cho LAB _ Hình cầu Hình que Nhuộm bào tử + Cấy truyền sang MRS agar Phân lập giống thuần khiết Nhuộm Gram Quan sát hình thái tế bào Tăng sinh trong MRS broth Loại VK sinh bào tử hình cầu Sporosarcina Loại VK kháng acid gây bệnh như Mycobacterium… Loại Arthrobacter Corynebacterium Propionibacterium Loại VK sinh bào tử hình que(Bacillus spp.Clostrididium) Loại bỏ vi khuẩn Gram – (E.coli, Salmonella…) Lên men đường Vi khuẩn lên men lactic Lên men dị hình Lên men đồng hình _ Quan sát hình thái khuẩn lạc MRS bổ sung 0,02% NaN3 loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc Sữa chua Sữa men sống Nem chua Cứt xu em bé _ Đều Quan sát đều, không đều Nhuộm kháng acid Catalase + Định tính acid lactic Kiểm tra khả năng di động 3.5. Phương pháp thí nghiệm 3.5.1. Thu thập mẫu Mẫu là những sản phẩm lên men có chứa vi sinh vật sống được dùng làm nguồn phân lập vi khuẩn lactic gồm: sữa chua, sữa chua men sống, nem và từ cứt xu của em bé. Mẫu được kí hiệu theo bảng sau: Bảng 3.1: Bảng kí hiệu các nguồn phân lập Nguồn phân lập Tên sản phẩm Kí hiệu các nguồn phân lập Sữa chua Long Thành L Nem Nem Đồng Tháp Na Nem Tiền Giang Nb Sữa chua men sống Yakult Y Beta gen B Cứt xu em bé E Trong đó : Nem Đồng Tháp được mua tại Lai Vung, Đồng Tháp Nem Tiền Giang được mua tại Tiền Giang. Sữa chua men sống Yakult được công bố là có chứa vi khuẩn Lactobacillus casei Shirota ở dạng sống. Cứt xu em bé được lấy từ em bé sau khi vừa sinh tại bệnh viện Từ Dũ, thành phố Hồ Chí Minh. 3.5.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic. 3.5.2.1. Tăng sinh Mục đích: kích hoạt các vi khuẩn có trong mẫu phát triển lại bình thường vì chúng có thể bị suy yếu trong quá trình bảo quản của các mẫu. Trong đó các vi khuẩn lactic có khả năng phát triển nhiều hơn vì ta đã sử dụng môi trường chọn lọc đối với vi khuẩn lactic (mục 3.4). Đồng thời đây cũng là bước đầu giúp thu lượng sinh khối vi khuẩn phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Môi trường sử dụng MRS broth có bổ sung 0,02% NaN3, đã khử trùng ở 1210C, trong 15 phút. Với các mẫu là dạng dịch như: sữa chua, sữa chua men sống, hút 1ml cho vào ống nghiệm chứa khoảng 10ml MRS broth, còn lại đối với các với các mẫu là dạng rắn lấy khoảng 2g, đánh tơi cho vào ống nghiệm chứa MRS broth. Quấn màng PVC (màng bọc thực phẩm) quanh nấp ống nghiệm cho kín đem ủ ở 370C, 24 giờ. . 3.5.2.2. Phân lập Mục đích: tách các khuẩn lạc riêng lẻ khác nhau, giúp chọn lựa ra các chủng vi khuẩn đồng nhất. Các mẫu sau khi tăng sinh đem pha loãng tới độ pha loãng là 10-9 Gieo cấy mẫu để tách khuẩn lạc vi khuẩn riêng rẽ: sử dụng môi trường phân lập là môi trường MRS agar. Tiến hành cấy trang ở các độ pha loãng từ 10-5 ÷ 10-9 kết hợp với phương pháp cấy ria để tách các khuẩn khác nhau, sau đó cấy truyền các khuẩn lạc đã đồng nhất vào các ống thạch nghiêng ủ ở 370C, 24 giờ, bảo quản ống giống ở nhiệt độ 40C 3.5.3. Các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn lactic. 3.5.3.1. Nhuộm Gram Mục đích: giúp ta phân biệt vi khuẩn thành 2 nhóm lớn: vi khuẩn G+ (Gram-positive) bắt màu tím và vi khuẩn G- (Gram-negative) bắt màu hồng. Ngoài ra nhuộm Gram cho phép ta quan sát rõ hình thái tế bào hơn so với soi vi khuẩn sống. Sau khi thu được các chủng vi khuẩn đồng nhất, ta tiến hành nhuộm Gram và loại bỏ các vi khuẩn Gram âm, giúp sàng lọc ra các vi khuẩn Gram dương có khả năng là vi khuẩn lactic. 3.5.3.2. Nhuộm bào tử . Mục đích: Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử : dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipit. Trước hết xử lý để tế bào chất bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và axit. Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh. Tẩy màu tế bào chất của tế bào và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm khác bổ sung. Nhờ đó tế bào chất của bào tử và tế bào chất tế bào bắt màu phân biệt. Trong đó bào tử sẽ có màu xanh và tế bào có màu đỏ. Các vi khuẩn Gram dương thu được từ bước trên được tiếp tục kiểm tra khả năng sinh bào tử. Sử dụng sinh khối vi khuẩn khi đã già để nhuộm bào tử. Từ kết quả thu được ta loại bỏ các chủng có bào tử, do LAB là vi khuẩn Gram dương nhưng không sinh bào tử. 3.5.3.3. Nhuộm kháng acid Vi khuẩn kháng acid có vỏ bên ngoài chống được cồn và acid nên nó vẫn giữ màu nhuộm sau khi bị xử lý với dung dịch cồn và acid, vì vậy nó được phân loại là vi khuẩn kháng acid. Còn những vi khuẩn không mang đặc tính kháng acid màu nhuộm ban đầu sẽ bị rửa trôi và bắt màu thuốc nhuộm bổ xung. Trong đó vi khuẩn kháng acid sẽ bắt màu đỏ. Vi khuẩn không kháng acid bắt màu xanh Mục đích: nhuộm kháng acid để loại bỏ những vi khuẩn kháng acid như Mycobacterium. Chúng không phải là vi khuẩn lactic mà ta mong muốn vì chúng là những chủng có khả năng gây bệnh cho người. Các chủng phân lập là Gram dương không sinh bào tử được tiếp tục tiến hành nhuộm kháng acid. Từ kết quả thí nghiệm, ta chỉ giữ lại những vi khuẩn không có khả năng kháng acid. 3.5.3.4. Thử nghiệm catalasa. Mục đích: kiểm tra khả năng phân huỷ H2O2 tạo ra O2 của vi sinh vật nhờ sản sinh ra enzyme catalasa. Các chủng vi khuẩn thu được sau bước nhuộm kháng acid được tiến hành thử nghiệm catalase. Nếu thấy sủi bọt là dương tính, không sủi bọt là âm tính. Có thể nhỏ trực tiếp dung dịch H2O2 lên khuẩn lạc trên thạch đĩa để ghi nhận kết quả. Trong thí nghiệm này, chỉ có những chủng vi khuẩn cho catalase âm tính là có khả năng là vi khuẩn lactic. 3.5.3.5. Thử nghiệm khả năng sinh acid. Mục đích: kiểm tra khả năng sinh acid của vi khuẩn trong quá trình trao đổi chất của chúng. Trong thí nghiệm này các chủng cho catalase âm tính thu được từ bước trên sẽ được kiểm tra với thuốc thử Uffelmann. Các chủng phân lập là vi khuẩn lactic khi chúng tạo acid lactic và làm đổi màu tím của thuốc thử thành màu vàng nhạt. 3.5.3.6. Thử nghiệm khả năng di động. Mục đích: Xác định khả năng di động của vi sinh vật trong môi trường thạch mềm 0.5-0.7% agar. Vì vi khuẩn lactic không có khả năng di động, chỉ mọc theo đường cấy thẳng đứng trong ống chứa môi trường thạch mềm và không làm đục môi trường xung quanh nên trong thí nghiệm này ta sẽ loại bỏ được các vi khuẩn di động không phải là vi khuẩn lactic, chúng sẽ mọc lan ra khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung quanh. 3.5.3.7. Thử nghiệm khả năng lên men đường và khả năng sinh khí * Mục đích: kiểm tra vi sinh vật có khả năng lên men các loại đường nào. Các loại đường được sử dụng là: glucose, lactose, saccharose, maltose và mannitol. Kết quả từ thí nghiệm này giúp ta định danh đến cấp giống các chủng vi khuẩn lactic phân lập được dựa theo khóa phân loại của Bergey * Tiến hành: - Môi trường MRS broth với lượng đường glucose lần lựơc thay thế bằng các loại đường cần kiểm tra. - Đặt vào mỗi ống nghiệm 1 ống nhỏ (ống Durham) lộn ngược đầu để hứng khí CO2 sinh ra nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường. Khử trùng trong 15 phút ở 1210C.. - Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá vào các ống nghiệm, đặt ở 37 0C, theo dõi hiện tượng sinh axit sau 1-3 ngày. Trường hợp dùng nút bông cần quấn bằng màng PVC (màng bọc thực phẩm) để bịt kín miệng ống nghiệm * Kết quả: - Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường (sinh axit) chất chỉ thị xanh bromophenol (BPB) sẽ chuyển màu đỏ. - Nếu có bọt khí bên trong ống durham thì chủng vi khuẩn đó lên men có sinh khí - Đối với những ống nghiệm không có bọt khí trong ống durham thì ta cần kiểm tra lại bằng cách đốt đỏ que cấy và đặt sát bề mặt môi trường, nếu thấy có bọt khí nổi lên thì chủng vi khuẩn đó cũng lên men có sinh khí 3.6. Thử nghiệm khả năng sinh H2O2 * Mục đích : kiểm tra khả năng sinh , là một chất tham gia vào hoạt động kháng khuẩn của của vi sinh vật. * Nguyên tắc : H2O2 là một chất vưa có tính khử vừa có tính oxy hóa Trong môi trường acid, H2O2 có tính oxy hóa mạnh, khi tác dụng với chất khử KI tạo ra I2 , nhận biết phản ứng bằng cho thêm hồ tinh bột H2O2 + 2KI I2 + 2KOH * Tiến hành : - Nuôi ủ các chủng vi khuẩn trong môi trường lỏng 24 giờ - Lấy mỗi mẫu 5ml dịch nuôi cấy, thêm 1ml H2SO4 1M và 1ml KI, sau đó thêm 3 giọt hồ tinh bột . Quan sát sự chuyển màu và ghi kết quả. * Kết quả: - Dung dịch chuyển thành màu xanh tím : có H2O2 - Dung dịch không đổi màu : không có H2O2. 3.7. Thử nghiệm khả năng kháng vi sinh vật bằng phương pháp đo độ đục (turbidimetric method). * Mục đích: Những vi sinh vật mang đặc tính probiotic phải là những sinh vật có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh nên trong thí nghiệm này cần phải kiểm tra khả năng ức chế sự phát triển vi khuẩn gây bệnh của những chủng vi khuẩn LAB phân lập được nhằm tuyển chọn những chủng mang đặc tính probiotic trong đó vi khuẩn E. coli và Salmonella được chọn làm vi sinh vật chỉ thị. * Nguyên tắc: Khi một pha lỏng có chứa nhiều phân tử không tan sẽ tạo thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phân tử hiện diện trong môi trưởng lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm cho môi trường trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỉ lệ thuận với mật độ tế bào. Do đó, thông qua việc đo độ đục bằng máy quang phổ kể ở bước sóng 610nm của dịch huyền phù tế bào ta có thể định tính được mật độ vi sinh vật ở điều kiện cần khảo sát Dựa trên khả năng kháng khuẩn của các sản phẩm trao đổi chất của LAB đối với vi sinh vật chỉ thị trong môi trường lỏng. Vi sinh vật chỉ thị bị ức chế tăng trưởng dẫn đến nồng độ tế bào giảm so với đối chứng Ống đối chứng là sự phát triển bình thường của VK chỉ chị E. coli. Ống kiểm tra là ống có chứa dịch nuôi LAB đã ly tâm, nếu vi khuẩn LAB có tính kháng khuẩn thì ống kiểm tra sẽ có mật độ tế bào thấp hơn ống đối chứng. Thí nghiệm được tiến hành với 2 nghiệm thức : + Nghiệm thức 1: xác định hoạt tính dựa trên sự ức chế vi khuẩn chỉ thị E.coli và Salmonella bằng các chất được sinh ra trong quá trình trao đổi chất của các chủng LAB. + Nghiệm thức 2 : xác định hoạt tính dựa trên sự ức chế vi khuẩn chỉ thị E.coli và Salmonella bằng các chất sinh ra trong quá trình trao đổi chất của các chủng LAB nhưng đã được loại bỏ yếu tố acid lactic bằng cách trung hòa bằng dung dịch NaOH 1N. * Chuẩn bị : Dịch nuôi cấy E.coli và Salmonella (ủ 21h, 370C) pha loãng 10-2 tương ứng nồng độ tế bào 105 tế bào/ml. Dịch nuôi cấy LAB trong MRS broth ủ kị khí 18- 24h, ở 37oC , mang 1 nửa đi trung hòa về pH 6 bằng NaOH 1N, thanh trùng ở 80oC trong 10 phút, sau đó ly tâm 4000 vòng/ phút trong 15 phút, loại bỏ sinh khối. *Cách thực hiện: Ống thí nghiệm : gồm 1 ml dịch nuôi cấy E.coli hoặc Salmonella nồng độ 105 tế bào/ml với 1 ml dịch ly tâm LAB (trung hòa hoặc không trung hòa), bổ sung 8 ml môi trường cao thịt-peptone. Ủ hiếu khí 37oC, 24 giờ . Ống đối chứng : giống ống thí nghiệm, nhưng 1 ml dịch ly tâm LAB được thay bằng 1ml MRS broth đã tiệt trùng. Ống trắng : gồm 9ml môi trường cao thịt-peptone và 1ml MRS broth đã tiệt trùng. Tiến hành đo độ đục của tất cả các ống bằng máy quang phổ kế ở bước sóng 610nm. * Công thức tính toán: Tỉ lệ sống sót của VSV chỉ thị (%) = ODTN/ODĐC*100 % OD = ODĐC / ODTN * 100% Như vậy với %OD càng nhỏ thì khả năng kháng vi sinh vật của chủng đó càng cao. Trong đó : ODĐC : giá trị OD của ống đối chứng ODTN : giá trị OD của ống thí nghiệm. % vi sinh vật chỉ thị bị ức chế được tính như sau: D% = 100% - %OD , thể hiện khả năng kháng vi sinh vật của chủng đó, D% càng lớn, khả năng kháng vi sinh vật càng cao. Chú ý: kết quả thu được là số liệu trung bình của 3 lần lặp lại với mức ý nghĩa thống kê 95%. 3.8. Thử nghiệm khả năng chịu acid và muối mật 3.8.1. Khả năng chịu acid : Bên trong hệ tiêu hóa của chúng ta dạ dày là nơi có pH rất thấp do và ruột thường rất thấp (pH<3) do sự có mặt của acid như acid hydrochloric nhằm tạo điều kiện acid cho các protease hoạt đông tiêu hóa thức ăn. Chính vì vậy các vi khuẩn probiotics cần phải chịu được điều kiện pH thấp trong 1 thời gian nhất định để có thể đi qua dạ dày tới ruột và phát huy được tác dụng probiotics của mình. Để kiểm tra khả năng này, người ta nuôi cấy các vi khuẩn probiotics trên môi trường MRS với điều kiện pH là 2, 3, 4, 5 và đối chứng trên môi trường MRS thông thường có pH = 6.5 - 7. Do môt trường MRS có màu nâu tương đối đậm nên muốn thu kết quả chính xác ta cần phải tiến hành ly tâm và thu sinh khối vi khuẩn vào trong nước muối sinh lý với thể tích tương ứng để đo quang xác định mật độ của tế bào ở bước sóng là 610 nm. 3.8.2. Khả năng chịu muối mật Có 2 loại muối mật là glycochalat natri và taruocholat natri. Muối mật có chức năng quan trọng trong việc tiêu hóa và hấp thu lipid ở ruột non kéo theo sự hấp thu các vitamin tan trong lipid như A, D, E, K. Vì thế muối mật có ảnh hưởng đến vi sinh vật do tác động lên màng phospholipid của chúng. Khi xuống đến hồi tràng, 95% muối mật được tái hấp thu rồi theo tĩnh mạch chủ trở về gan và được tái bài tiết, gọi là chu trình ruột gan. Còn 5% muối mật được đào thải theo phân có tác dụng giữ nước trong phân và duy trì nhu động ruột già. Chính vì thế mà khả năng chịu được muối mật cũng là một điều kiện để đánh giá hoạt tính của probiotics. Nó cũng phản ánh khả năng sống sót của các chủng probiotic bên trong đường ruột Để kiểm tra khả năng này, ta sử dụng mật bò (oxbile, Merck) và tương tự như kiểm tra khả năng chịu pH thấp, cũng nuôi cấy vi khuẩn probiotic trong môi trường MRS có bổ sung 0,3% muối mật và đối chứng trên môi trường MRS thông thường. Tiến hành ủ 24 giờ trong tủ ấm 370C, sau đó ly tâm thu sinh khối và đem đo quang ở bước sóng 610 nm để khảo sát mật độ tế bào.