Vật liệu và phương pháp nghiên cứu mủ cao su

- 37 - Phần II: Vật liệu và phương pháp Phần II: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP II.1. VẬT LIỆU Mủ cao su tươi được thu tại nông trường Phú Xuân, TP. Buôn Ma Thuột, tỉnh Đắc Lắc. Mủ cao su dùng cho đề tài bao gồm mủ của 3 giống cao su phổ biến ở Việt Nam: GT1, PB235 và RRIM600. II.2. PHƯƠNG PHÁP II.2.1. Phương pháp ly tâm mủ thu nhận lutoid Mủ cao su dùng cho thí nghiệm phải tinh khiết không pha loãng hay pha lẫn ammoniac được thu gom từ các chén sứ trong vườn cao su vào buổi sáng sớm. Nếu mủ đã bị pha loãng hay pha lẫn ammoniac thì khi ly tâm sẽ không cho ra được lutoid. Sau đó, mủ được lọc sơ để loại côn trùng rơi vào mủ, ướp lạnh và chuyển về phòng thí nghiệm. Toàn bộ quá trình thu mủ, vận chuyển cần nhẹ nhàng tránh xáo động mủ vì có thể gây đông mủ. Mủ ướp lạnh chỉ sử dụng được trong vòng 1 ngày, sang ngày thứ 2 dù mủ chưa đông nhưng không thể phân tách lutoid được nữa. Mủ cao su tươi được ly tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong thời gian 20 phút. Ở thời gian ly tâm ngắn hơn khó có thể phân tách được lutoid theo ý muốn. Sau khi ly tâm, tách bỏ lớp mủ kem tạo thành lớp trắng dẻo trên bề mặt ống ly tâm, đổ bỏ phần dịch bên dưới, chỉ chừa lại phần lutoid màu vàng nhạt ở đáy ống ly tâm. Sau đó cho thêm vào ống ly tâm nước cất lạnh và ly tâm lần thứ 2 để loại hoàn toàn phần cao su. Phần lutoid thu được đem nghiền bằng cối có chứa cát thủy tinh, rồi lọc sạch. Nguyễn Quang Nhân - 38 - Phần II: Vật liệu và phương pháp II.2.2. Kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ • Nguyên tắc: Nguyên tắc kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ dựa vào độ hoà tan của protein thông qua tác động lên hằng số điện môi của dung dịch. Các dung môi hữu cơ (acetone, ethanol) có hằng số điện môi nhỏ, làm giảm hằng số điện môi hiện hữu của môi trường, ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein, tức là làm giảm độ hòa tan của protein trong dung dịch và dẫn đến kết tủa protein. Điều này có được bằng cách thêm dung môi hoà tan trong nước (acetone, ethanol) vào dung dịch chứa protein. Đây là kiểu tạo kết tủa protein thuận nghịch nghĩa là protein có thể hòa tan lại trong nước [2]. Nếu tiến hành kết tủa protein ở nhiệt độ thấp (<5oC) và lấy kết tủa nhanh ra khỏi dung môi, protein không bị biến tính. Nếu nhiệt độ cao hơn (20-30oC) và kết tủa bị giữ trong dung môi hữu cơ lâu, protein sẽ bị biến tính [2]. • Tiến hành: Sử dụng ethanol tuyệt đối và acetone lạnh cho từ từ vào dịch enzyme theo các tỉ 1:2 ; 1:3 ; 1:4 (Thể tích dịch protein : Thể tích dung môi hữu cơ), đồng thời khuấy đều liên tục. Sau đó, để tủa trong tủ lạnh 1 giờ rồi ly tâm tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút, thu tủa protein. Để tủa dưới quạt gió một lúc để đuổi dung môi hữu cơ, rồi hòa tủa vào dịch đệm, giữ trong tủ lạnh. Dịch enzyme sau đó được tiến hành định lượng protein theo phương pháp Lowry và xác định hoạt tính chitinase bằng DNS. II.2.3. Kết tủa protein bằng muối trung tính • Nguyên tắc: Các muối trung tính [(NH4)2SO4 – ammonium sulfate] vừa làm trung hòa điện (do các ion tác động tương hỗ với các nhóm tích điện trái dấu) vừa loại bỏ lớp vỏ hydrate của phân tử keo làm các phân tử protein kết tụ lại [2]. Trong số các muối trung tính thì muối (NH4)2SO4 là tốt nhất và được dùng phổ biến vì nó Nguyễn Quang Nhân - 39 - Phần II: Vật liệu và phương pháp không làm hại mà làm ổn định (làm bền) hầu hết các loại protein enzyme. Nồng độ (NH4)2SO4 bão hòa cần thiết để kết tủa protein enzyme khác nhau cho hiệu quả kết tủa khác nhau. • Tiến hành: Sử dụng (NH4)2SO4 với các độ bão hòa 10% ; 20% ; 30% ; 40% ; 50% ; 60% ; 65% ; 70% ; 75% ; 80% ; 85% ; 90% ; 95% ; 100% cho từ từ vào dịch protein khuấy cho tan hết. Sau đó, để tủa trong tủ lạnh 1 giờ rồi ly tâm lấy tủa protein (tốc độ ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút). Dịch enzyme sau đó được tiến hành định lượng protein theo phương pháp Lowry và xác định hoạt tính chitinase bằng DNS. II.2.4. Thẩm tích • Nguyên tắc: Phương pháp này dùng để phân tách các chất tan dựa trên kích thước của chúng khi cho chúng khuếch tán qua một màng bán thấm. Dung dịch cần phân tách được chứa trong một túi bán thấm, túi này được đặt trong một thể tích đệm lớn có lực ion thấp. Các lỗ trên màng quá nhỏ đối với các đại phân tử có khối lượng phân tử lớn hơn hay bằng 10000 Da. Các phân tử nhỏ khuếch tán dễ dàng qua các lỗ này. Sự khuếch tán này tiếp tục cho đến lúc nồng độ của chúng trong và ngoài màng bằng nhau. Vì thế, nồng độ của các phân tử nhỏ bên trong màng giảm xuống. Sự cân bằng này đạt được sau 4-6 giờ. Tất nhiên, nếu sau đó thay dung môi thẩm tích bằng dung môi mới sau khi đã đạt được sự cân bằng, nồng độ của các phân tử nhỏ trong màng tiếp tục bị giảm xuống nhờ thẩm tích liên tục [10]. Thẩm tích thường được sử dụng để loại muối và các phân tử nhỏ khỏi dung dịch chứa các đại phân tử. • Tiến hành: Sử dụng màng thẩm tích cellophane, cắt màng theo chiều dài mong muốn, ngâm trong acid acetic 1% trong 1 giờ, sau đó chuyển qua nước cất. Tiếp tục Nguyễn Quang Nhân - 40 - Phần II: Vật liệu và phương pháp luộc ống trong dung dịch EDTA kiềm (1% sodium carbonate, 10-3M EDTA) trong 1 giờ, sau đó thay bằng nước cất. Màng được bảo quản trong nước cất ở 4oC có bổ sung một ít sodium azide (NaN3). Cột chặt một đầu túi, đổ dung dịch enzyme cần loại muối vào túi, chừa lại một khoảng không khí (khoảng 10% thể tích), buộc chặt đầu còn lại. Túi thẩm tích được đặt vào dung dịch đệm citrate pH 5,0 trong một becher to, cột một đầu túi vào đũa thủy tinh gác ngang miệng becher. Dùng máy khuấy từ khuấy nhẹ nhàng liên tục. Thay dịch đệm vài lần để loại muối [10]. Sử dụng phương pháp này đối với các mẫu tủa bằng muối (NH4)2SO4. II.2.5. Xác định hàm lượng protein hòa tan theo phương pháp Lowry • Nguyên tắc: Phương pháp Lowry sử dụng phối hợp phản ứng Biuret (tác dụng lên nối peptide) và phản ứng với thuốc thử Folin (tác dụng lên gốc acid amin vòng thơm như tyrosin, tryptophan) để tạo phức màu đặc trưng. Các liên kết peptide, mà cụ thể là các phân tử nitrogen, trong phân tử protein tương tác với CuSO4 trong môi trường kiềm (thuốc thử Biuret) tạo phức Cu-Protein. Phức này tương tác với thuốc thử Folin sẽ tạo thành phức chất có màu xanh (heteropolymolybdenum blue). Màu này tỉ lệ với hàm lượng tyrosin và tryptophan (tương đương hàm lượng protein vì hầu hết protein đều chứa 2 loại acid amine này). Ngoài ra trong thuốc thử Folin có acid phosphomolybdic và acid phosphotungstic (hoặc phosphowolframic) làm tăng độ nhạy của phức chất. Phức chất màu xanh có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 750nm [16]. Trong phản ứng Lowry cường độ màu của phức chất có thể tăng lên khi có sự hiện diện của muối amon, phenol, vòng imidazol, pirimidin, acid uric, các ion kim loại…Cường độ màu giảm khi có mặt etanol, aceton, TCA, acid pecloric (HClO4)…Vì vậy để đạt cường độ màu chính xác của dung dịch protein với thuốc thử Folin đòi hỏi protein phải tinh sạch. Phương pháp Lowry có độ nhạy tương Nguyễn Quang Nhân - 41 - Phần II: Vật liệu và phương pháp đối cao, nồng độ protein tối ưu nằm trong khoảng 10-1000μg/ml. Tuy nhiên phương pháp này không dùng để định lượng các protein không chứa acid amin vòng thơm như gelatin. • Hoá chất: - Dung dịch albumin bò (BSA-bovine serum albumin) 0,1%. - Dung dịch Na2CO3 2% (pha trong dd NaOH 0,1M). - Dung dịch CuSO4 1%. - Dung dịch muối Seignette (KNaC4H4O6.4H2O - Sodium Potassium Tartrate) 2%. - Dung dịch Lowry (dd C)(Pha ngay trước khi dùng): hỗn hợp 50ml dd Na2CO3 2% ; 0,5ml dd CuSO4 1% ; 0,5ml dd muối Seignette. - Thuốc thử Folin. • Tiến hành - Dựng đường chuẩn albumin: Nồng độ protein μg/ml 0 50 100 150 200 250 Dd đệm citrate pH 5,0 (ml) 10 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 Dd BSA 0,1% (ml) 0 0,5 1 1,5 2,0 2,5 Hút 0,4ml dung dịch protein từ các ống nghiệm vừa pha cho vào các ống nghiệm mới, thêm vào 2 ml dung dịch Lowry, lắc đều, để yên ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Sau đó thêm 0,2ml thuốc thử Folin, lắc đều, để yên trong 30 phút. Thêm 1,4ml dd đệm, lắc đều, đem đo OD ở bước sóng 750mm. - Xác định hàm lượng protein trong mẫu: Hút 0,4ml dịch protein cần phân tích, thêm 2ml dd Lowry, lắc đều, để yên trong 10 phút. Thêm 0,2ml thuốc thử Folin, lắc đều, để yên trong 30 phút. Thêm 1,4ml dd đệm, lắc đều, đem đo OD ở 750nm. • Cách tính kết quả Nguyễn Quang Nhân - 42 - Phần II: Vật liệu và phương pháp Lấy giá trị OD của các ống đường chuẩn trừ cho OD trung bình của 2 ống thử không để có ΔOD. Từ đó lập đường chuẩn theo ΔOD và nồng độ protein (μg/ml) tương ứng. Lấy giá trị ΔOD của mẫu với ống thử không chiếu vào đường chuẩn để suy ra nồng độ protein tương ứng. Nếu ΔOD mẫu nằm ngoài đường chuẩn thì pha loãng mẫu. Sau khi có kết quả chiếu từ đường chuẩn thì nhân với độ pha loãng để có nồng độ protein của dung dịch. II.2.6. Xác định hoạt độ chitinase theo phương pháp định lượng đường khử với thuốc thử DNS • Nguyên tắc Phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân chitin bởi chitinase thành N- acetylglucosamin (GlcNAc). GlcNAc là một loại đường khử. Đường khử trong môi trường kiềm nóng sẽ khử thuốc thử DNS (acid 3,5-dinitrosalicylic) màu vàng thành acid 3-amino-5- nitrosalicylic màu đỏ da cam [18]. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với độ hấp thụ (OD) tại bước sóng 540nm và tỉ lệ thuận với hàm lượng đường khử trong mẫu. Hình 2.1: Phản ứng phân cắt chitin bằng chitinase Đường khử trong môi trường kiềm nóng Acid 3,5-dinitrosalicylic (màu vàng) Acid 3-amino-5-nitrosalicylic (màu da cam) Hình 2.2: Phản ứng của đường khử với thuốc thử DNS Nguyễn Quang Nhân - 43 - Phần II: Vật liệu và phương pháp Dựa vào đồ thị chuẩn với nồng độ của N-acetylglucosamin tinh khiết và ΔOD ở 540nm sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu, qua đó biết được hoạt tính chitinase của enzyme. • Định nghĩa đơn vị hoạt độ chitinase: Một đơn vị hoạt độ (UI) chitinase được định nghĩa là lượng enzyme xúc tác thủy phân chitin tạo các đầu khử tương ứng với 1μg N-acetylglucosamin trong 1 phút dưới điều kiện phản ứng. • Hoá chất - Thuốc thử DNS. - Dung dịch huyền phù chitin 1%: lấy 5g chitin hòa tan vào 50ml HCl đậm đặc. Khuấy liên tục trong thời gian 3 phút ở 40oC. Sau đó, vừa khuấy vừa thêm từ từ 500ml nước lạnh (5oC). Dịch huyền phù thu lại bằng cách ly tâm (3500 vòng/phút trong 7 phút). Huyền phù được rửa với nước cất nhiều lần cho đến pH thích hợp, rồi hòa vào đệm citrate pH 5,0. Sau đó bảo quản lạnh dịch huyền phù. - Dung dịch N-acetylglucosamin chuẩn 500μg/ml pha trong đệm. • Tiến hành - Dựng đường chuẩn N-acetylglucosamin: Từ dung dịch N-acetylglucosamin chuẩn pha các dung dịch N- acetylglucosamin có nồng độ từ 0-250μg/ml. Nồng độ GlcNAc (μg/ml) 0 50 100 150 200 250 Dd N-acetylglucosamin chuẩn (ml) 0 0,4 0,8 1,2 1,6 2 Dd đệm (ml) 4 3,6 3,2 2,8 2,4 2 Dd NaOH 2M (ml) 2 2 2 2 2 2 Lắc đều, rút ra 3ml mỗi ống, thêm 1ml thuốc thử DNS vào mỗi ống nghiệm, lắc đều, đun sôi cách thủy trong 5 phút. Làm nguội, đo OD ở bước sóng 540nm. Vẽ đường chuẩn theo nồng độ GlcNAc và ΔOD540. Nguyễn Quang Nhân - 44 - Phần II: Vật liệu và phương pháp - Xác định hoạt độ chitinase của mẫu enzym: Hỗn hợp phản ứng gồm: trộn 2ml dịch huyền phù chitin 10mg/ml và 2ml dịch enzyme, pH 5,0, lắc đều. Hỗn hợp ủ trong thời gian 3 giờ, phản ứng được ngừng lại bằng cách đun sôi cách thủy trong 5 phút, để nguội tới nhiệt độ phòng. Thêm 2ml dd NaOH 2M vào mỗi ống, lắc đều, lọc, rút ra 3ml mỗi ống. Thêm 1ml DNS, lắc đều, đun sôi cách thủy trong 5 phút, làm nguội và đo OD ở bước sóng 540nm. Tiến hành với mẫu kiểm chứng tương tự như mẫu thí nghiệm chỉ khác là dd enzyme được bổ sung khi đã kết thúc thời gian phản ứng. • Cách tính kết quả HT = X . K . V v . t (Công thức 1) Trong đó: HT : Hoạt độ chitinase (UI/ml). X : Lượng đường khử sinh ra (μg/ml). K : Hệ số pha loãng. V : Tổng thể tích dung dịch phản ứng (ml). v : Thể tích enzym đem phản ứng (ml). T : Thời gian phản ứng (phút). Công thức xác định hoạt độ riêng HTR = C HT (Công thức 2) Trong đó: HTR: Hoạt độ riêng enzyme (UI/mg protein). C: Nồng độ dịch enzym (mg/ml). Nguyễn Quang Nhân - 45 - Phần II: Vật liệu và phương pháp II.2.7. Tinh sạch enzyme bằng phương pháp lọc gel Sephadex • Nguyên tắc: Phương pháp lọc gel Sephadex dùng để tách các phân tử trong một hỗn hợp theo kích thước, hình dáng và trọng lượng phân tử. Các phân tử có kích thước nhỏ đủ lọt vào bên trong lỗ gel thì bị giữ lại, di chuyển chậm qua cột. Trong khi đó các phân tử có kích thước lớn nằm ở kẽ hở giữa các hạt gel sẽ di chuyển nhanh hơn và được giải phóng ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ. • Dụng cụ và hóa chất: - Ống nghiệm loại nhỏ (được ngâm tẩy trùng trong dd sulfo-cromic trong 24 giờ, rửa sạch, tráng nước cất và sấy khô). - Dung dịch NaN3 0,02%. - Gel Sephadex G50 (Kích thước lỗ 20 – 80 μm, khoảng trọng lượng phân tử protein phân tách 1500 – 30000Da, hệ số trương nở 9-11ml/g gel khô): Cân 2g gel khô ngâm trong lượng thừa NaN3 0,02% trong 24 giờ để gel trương nở hoàn toàn. - Dung dịch đệm citrate pH 5,0. - Dung dịch HNO3 50%. • Tiến hành Rửa cột bằng HNO3 50% rồi rửa lại bằng nước cất nhiều lần, tráng bằng acetone, để khô. Cho vào đáy cột lớp bông gòn thủy tinh và lớp giấy lọc bên trên để tạo mặt phẳng. Đóng khóa cột, dùng becher cho từ từ dung dịch gel ngâm trong NaN3 0,02% vào cột. Gel cho vào cột phải liên tục, tránh hiện tượng phân lớp. Khi gel đã cao hơn 10cm có thể mở khóa từ từ để cho lượng nước dư trong gel chảy bớt đi. Tiếp tục nhồi cột cho đến khi lớp gel cao khoảng 4/5 chiều dài cột. Sau khi nhồi cột xong, cắt một miếng giấy lọc đặt lên trên mặt lớp gel nhằm tránh hiện tượng xáo trộn bề mặt gel khi cho mẫu vào cột. Cho dung dịch Nguyễn Quang Nhân - 46 - Phần II: Vật liệu và phương pháp đệm vào để chạy ổn định cột trong 30 phút. Chỉnh tốc độ dòng khoảng 2ml/ 9-10 phút. Chọn mẫu enzyme có hoạt tính tốt nhất để qua gel, trước khi nạp cần chỉnh lại nồng độ protein cho thích hợp khoảng 0,5 – 1 mg/ml. Đợi lớp dung dịch bên trên vừa chạm bề mặt gel thì khóa cột. Hút 0,5ml dung dịch enzyme cho vào cột. Mở khóa cho dung dịch chạy tiếp. Khi mẫu enzyme vừa thấm hết vào bề mặt gel, cho dung dịch đệm liên tục vào cột gel để rửa giải. Dịch rửa giải bên dưới được hứng vào các ống nghiệm. Hứng khoảng 20-40 ống, mỗi ống 2ml. Đem các ống đo OD ở bước sóng 280nm. Dựa vào giá trị đo được, vẽ thành các peak, gôm các ống nghiệm thuộc cùng một peak. Chọn những peak cao đem xác định hàm lượng protein và xác định hoạt tính enzyme. Tính % hiệu suất hoạt tính của enzyme và % hiệu suất hàm lượng protein thu được qua lọc gel: V . X V1 . X1 + V2 . X2 + … H% = (Công thức 3) H% : Phần trăm hiệu suất hoạt tính hoặc hàm lượng enzyme. V : Tổng thể tích enzyme cho vào lọc gel. V1, V2, … : Thể tích các peak 1, 2, … X : Hoạt tính hoặc hàm lượng enzyme cho vào lọc gel. X1, X2, … : Hoạt tính hoặc hàm lượng enzyme của các peak 1, 2, … II.2.8. SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis) • Nguyên tắc: Trong phương pháp này, các protein được phản ứng với các chất hoạt động bề mặt mang điện tích âm là SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) để tạo thành một phức hợp mang điện tích âm và sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Nguyễn Quang Nhân - 47 - Phần II: Vật liệu và phương pháp Thêm vào đó một chất khử là Mercaptoethanol hoặc DTT (dithiothreitol) để phá vỡ cầu nối -S-S- (disulfur) của protein và các tiểu đơn vị của chúng. Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein trong cùng một điều kiện chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ. Mục đích của phương pháp điện di được sử dụng để đánh giá độ tinh sạch và xác định phân tử lượng của protein, người ta thường so sánh với một thang phân tử chuẩn là hỗn hợp protein có trọng lượng phân tử khác nhau đã biết. Tốc độ di chuyển của protein trong phương pháp điện di phụ thuộc vào: - pH của môi trường (pH môi trường làm thay đổi điện tích của phân tử protein do đó phải dùng dịch đệm để duy trì một pH ổn định). - Hình dáng và trọng lượng của phân tử. - Cường độ của điện trường. - Nhiệt độ. - Tính chất của giá mang (giấy, acetate, cellulose, gel…) sẽ ảnh hưởng ít nhiều lên sự di chuyển của protein. - Thời gian điện di. Lớp gel gom mục đích làm cho các protein trong mẫu được dồn lại tạo thành băng mỏng, lớp gel phân tích sẽ tạo ra các băng protein có kích thước khác nhau từ cùng một điểm xuất phát ban đầu. • Hóa chất và dụng cụ: Bộ nguồn điện di, hộp điện di, dụng cụ làm gel (tấm kính, lược, kẹp, …), pipet, máy khuấy từ, máy hút chân không. Cấu tạo của một khung gel: gel được chuẩn bị trong một khoảng hẹp, được tạo thành bởi hai tấm kính, phân cách nhau bởi một tấm đệm bằng chất dẻo hoặc nguyên liệu thích hợp, miếng đệm dài hơn tấm kính khoảng 1cm chiều rộng và có độ dày 0,5mm, các giếng nơi mẫu cho vào được tạo thành từ các răng Nguyễn Quang Nhân - 48 - Phần II: Vật liệu và phương pháp lược chạy dài ngang đỉnh gel có cùng chiều dày với miếng đệm, các răng lược dài khoảng 1cm, rộng 2-10mm, khoảng cách giữa các răng khoảng 3mm. - Dung dịch Acrylamide 30%. - Đệm gel phân tách (Tris-HCl pH8,8). - Đệm gel gom (Tris-HCl pH6,8). - Dung dịch SDS10%. - Dung dịch Ammonium Persulfate (APS) 25%. - Dung môi pha mẫu. - Đệm điện di (pH=8,3). - Dung dịch nhuộm protein. - Dung dịch rửa mẫu. • Tiến hành: - Chuẩn bị gel phân tách (Resolving gel) ở cực dương (15%): Hóa chất Thể tích (μl) Đệm Tris-HCl pH 8,8 745 Nước cất hai lần 1375 Dung dịch acrylamide 30% 2145 Dung dịch SDS 10%