Vật liệu và phương pháp nghiên cứu muỗi Aedes aegypti

VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 21 CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Mesocyclops sp. được thu nhận từ tỉnh Bến Tre, nhân giống tại phòng Côn trùng thuộc Khoa Y tế cộng đồng, viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh. Theo tài liệu [6, trang 46], một loài Mesocyclops aspericornis phân bố ở tỉnh Bến Tre trong tổng số 4 loài M. aspercornis, M. thermocyclopoides, M. woutesi, M. pehpeiensis. Trứng muỗi Aedes aegypti được thu nhận tại phòng Côn trùng thuộc Khoa Y tế cộng đồng, viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh. 2.1.2. Những dụng cụ cần thiết khi điều tra muỗi trưởng thành -Ống nghiệm bắt muỗi 18 mm Kimax, USA -Máy hút muỗi MX-991/U, Fulton, USA. -Bông gòn không thấm, Việt Nam. -Kính lúp cầm tay. -Bảng điều tra véc tơ SD/SXHD và ổ bọ gậy Aedes (xem bảng phụ lục) -Đèn pin hiệu. -Sổ ghi chép. -Nhãn ghi. -Que đẩy bông. Hình 2.1. Ống nghiệm bắt muỗi Hình 2.3. Máy hút muỗi Hình 2.2. Đèn pin soi muỗi Hình 2.4. Kính lúp cầm tay 22 2.1.3. Những dụng cụ cần thiết khi điều tra LQ -Vợt tiêu chuẩn, đường kính 16cm, mắt lưới 200μ. -Gáo lọc LQ đường kính 14 cm, China. -Máy đếm bằng tay FH-102, Takanokeiki Co., Ltd, Janpan. -Khay thu thập LQ. -Cốc định lượng thủy tinh 100 ml Pyrex, USA.. -Pipet thẳng 5 ml, China. Hình 2.5. Vợt bắt LQ -Lọ đựng mẫu. -Túi đựng dụng cụ. -Lam kính 25,4x76,2 mm, Sail Brand, China. -Kẹp 12,5 cm, Saraj, Janpan. -Glycerin 10 %. -Cồn 90o Hình 2.6. Gáo lọc LQ Hình 2.7. Máy đếm bằng tay Hình 2.8. Khay thu thập LQ 23 2.1.4. Những vật liệu và dụng cụ dùng trong thí nghiệm Mesocyclops sp. -Đĩa petri thủy tinh 60x15 mm Pyrex, USA. -Đĩa petri nhựa 60x15 mm Falcon, USA. -Đĩa petri thuỷ tinh 90x15 mm Kimax, USA. -Kính lúp SM Z645, Nikon, Janpan. Hình 2.9. Kẹp 12,5 cm, Saraj, Janpan Hình 2.10. Lọ đựng mẫu Hình 2.11. Cốc định lượng thủy tinh 100 ml Hình 2.12. Pipet thẳng 5 ml -Pipette thẳng 5 ml, China. -Ly nhựa 300 ml, China. -Cốc thủy tinh 100 ml Pyrex, USA. -Lúa mạch. Hình 2.13. Các loại đĩa petri Hình 2.14. Ly nhựa 300 ml 24 2.2. Phương pháp nghiên cứu thường qui của viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh 2.2.1. Giám sát vectơ Điểm giám sát véc tơ được lựa chọn tại nơi có điều kiện thuận lợi cho sự sinh sản và phát triển của Aedes aegypti. Trong đề tài này, chúng tôi điều tra muỗi trưởng thành và xác định ổ LQ nguồn tiến hành ở 1 xã thử nghiệm và xã đối chứng 4 lần/năm. Mỗi lần điều tra 100 hộ gia đình (phân bổ ngẫu nhiên) trong từng xã, 2 lần (tháng 8 và tháng 11) thực hiện vào mùa mưa (tháng 6-11), 2 lần (tháng 2 và tháng 5) thực hiện vào mùa khô (tháng 12-5). Trong công tác thực địa, điều tra véc tơ 3 tháng một lần. Số nhà điều tra ở xã thử nghiệm là 100 và ở xã đối chứng là 100 nhà. Hình 2.15. Kính lúp SM Z645 Hình 2.16. Lúa mạch 25 2.2.1.1. Nơi khảo sát Chọn hai điểm gồm 1 xã thử nghiệm và 1 xã đối chứng thuộc tỉnh Bến Tre là: • Xã thử nghiệm: xã Vang Quới Đông (VQĐ), huyện Bình Đại, tỉnh Bến Tre. • Xã đối chứng: xã Tân Lợi Thạnh (TLT), huyện Giồng Trôm, tỉnh Bến Tre. Hình 2.17. Bản đồ vị trí của xã VQĐ và xã TLT Vang Quới Đông Tân Lợi Thạnh Hình2.18. Cảnh quan ở tỉnh Bến Tre 26 2.2.1.2. Điều tra muỗi trưởng thành Mục đích So sánh lượng muỗi cái Aedes aegypti tại xã thử nghiệm VQĐ và xã đối chứng TLT thông qua các chỉ số (chỉ số mật độ muỗi Aedes aegypti cái (DI), chỉ số nhà có muỗi Aedes aegypti cái (HI)). Phương pháp Giám sát muỗi trưởng thành bằng phương pháp soi bắt muỗi đang đậu nghỉ trong nhà, được áp dụng để đánh giá quần thể muỗi. Ở phương pháp này, người điều tra soi bắt muỗi cái đậu nghỉ trên quần áo, chăn màn, các đồ vật trong nhà vào buổi sáng, ở mỗi nhà muỗi bị bắt trong 10-15 phút. Dụng cụ thu mẫu có thể là máy hút muỗi, ống nghiệm bắt muỗi. Kỹ thuật bắt muỗi Kỹ năng và sự cần cù của người bắt muỗi có ảnh hưởng đáng kể tới kết quả điều tra. Muỗi được bắt ở nơi tối như: quần áo treo trên mắc, trên lọ cắm hoa, trên mảnh vải phủ dài, trên chăn màn, thành giường, trên đồ vật sẫm màu ở trong nhà. Tay trái cầm đèn pin soi tìm từng chỗ, nhẹ nhàng để tránh khua động làm muỗi bay mất. Khi thấy muỗi, tay phải cầm ống nghiệm nhẹ nhàng úp lên con muỗi đang đậu miệng ống nghiệm úp thẳng góc áp sát lên mặt đồ vật có muỗi đậu để bắt muỗi. Muỗi tự động bay lên đáy ống nghiệm, lấy ngón tay trỏ bịt miệng ống rồi lấy bông đậy nút miệng ống, dùng que đẩy nút bông nghiệm bắt nhốt 3-5 con muỗi. Muỗi bắt ở mỗi nhà để riêng và ghi nhãn theo quy định. Tính các chỉ số • Chỉ số mật độ muỗi Aedes aegypti (DI): Là số muỗi cái Aedes aegypti trung bình trong một gia đình khảo sát. DI (con/nhà)= • Chỉ số nhà có muỗi Aedes aegypti (HI) : là tỷ lệ (phần trăm) nhà có muỗi cái Aedes aegypti trưởng thành. HI (%)= Số muỗi cái Aedes aegypti bắt được Số nhà giám sát Số nhà có muỗi cái Aedes aegypti x 100% Số nhà giám sát 27 2.2.1.3. Khảo sát ổ sinh sản của LQ Aedes aegypti Mục đích - Khảo sát đặc điểm chủng loại DCCN hiện có và chủng loại DCCN có LQ ở tỉnh Bến Tre nhằm xác định nguồn sinh sản chủ yếu của muỗi Aedes aegypti ở trong và xung quanh nhà. - So sánh lượng LQ Aedes aegypti tại xã thử nghiệm VQĐ và xã đối chứng TLT thông qua các chỉ số (chỉ số mật độ lăng quăng (DI), chỉ số nhà có LQ Aedes aegypti (HI), chỉ số dụng cụ chứa nước có LQ Aedes aegypti (CI), chỉ số Breteau (BI)). Phương pháp giám sát ổ LQ nguồn Phương pháp này dựa vào kết quả đếm toàn bộ số lượng LQ Aedes aegypti tuổi III-IV trong các chủng loại DCCN khác nhau trong và xung quanh nhà để xác định nguồn muỗi Aedes aegypti chủ yếu ở địa phương theo mùa trong năm hoặc theo từng giai đoạn để điều chỉnh, bổ sung các biện pháp tuyên truyền và phòng chống véc tơ thích hợp. Vì cán bộ làm việc trên thực địa thường phải điều tra một số lượng lớn chum vại chứa nước và sau đó định loại LQ thu thập được, nên chúng tôi dựa vào LQ tuổi III-IV vì việc định loại dễ dàng hơn so với định loại LQ tuổi I-II. Tỷ lệ chết ở LQ tuổi I-II cao hơn, vì vậy số lượng LQ có thể không phản ánh được số lượng muỗi trưởng thành được sinh ra (Southwood và cs 1972). Mặc dù so với LQ tuổi III-IV, số lượng quăng (nhộng) có mối quan hệ chặt chẽ hơn với số lượng muỗi trưởng thành, do đó có liên quan chặt chẽ với nguy cơ lan truyền bệnh (Focks và Chadee 1997), nhưng việc định loại quăng (nhộng) khó, phải đợi chúng biến thái thành muỗi trưởng thành. Sau khi bắt muỗi thì điều tra LQ bằng cách quan sát, ghi nhận ở toàn bộ DCCN trong và xung quanh nhà. Nếu điều tra ổ LQ nguồn: - Đối với DCCN lớn như hồ > 1000 lít hay lu > 200 lít đầy nước phải dùng vợt tiêu chuẩn (đường kính 16 cm, mắt lưới 200 μm) để thu thập LQ. 28 - Đối với DCCN nhỏ < 50 lít ta lọc lấy hết LQ và đếm số lượng, dụng cụ điều tra LQ cần là vợt tiêu chuẩn, pipette, gáo lọc LQ. Hình 2.19. Dùng vợt tiêu chuẩn để thu thập LQ Hình 2.20. Một số DCCN là nơi sinh sản của LQ Aedes aegypti Sau khi thu thập LQ từ các DCCN trong và xung quanh nhà của 100 hộ dân cư vào buổi sáng, làm tiêu bản, quan sát và định loại các loại LQ với các bước: • Làm chết LQ bằng cồn 90o. • Ký hiệu tên mẫu (nơi và tên ngườithu mẫu, số thứ tự DCCN) trên lam kính. • Nhỏ 1 giọt glycerin 10% trên lam kính. 29 • Xếp LQ thẳng hàng trong glycerin trên lam kính. • Quan sát dưới kính lúp SM Z645. • Ghi số lượng LQ từng loại vào bảng phân loại LQ. Hình 2.21. Một số mẫu phân loại LQ trên lam kính Bảng 2.1. Hệ số quy đổi để xác định giá trị tương đối của LQ bằng phương pháp thu mẫu khác nhau (pipette, vợt, bẫy phễu) trong các DCCN Thứ tự Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt Hệ số Pipette LQ Hệ số vợt LQ Hệ số bẫy phễu LQ 1 Box Tank > 500L Hồ vuông >500L 1 16 20 2 Cylindrical Tank > 1000L (CLDRWSS) Hồ tròn >1000L CLDRWSS 1 7,9 5 3 Cylindrical Tank > 1000L Hồ tròn >1000L Non- CLDRWSS 1 7,9 5 4 Other tanks Những hồ khác 1 4,5 10 5 UNICEF style Jar > 1000L (CLDRWSS) Hồ unicef CLDRWSS 1 11 5 6 UNICEF Style Jar > 1000L Hồ unicef Non-CLDRWSS 1 11 5 7 Standard Jar > 100L Chum, vại, kiệu >100L 1 2,8 7,4 8 Small Jar < 100L Chum, vại, kiệu <100L 1 2,4 3 9 Well Giếng 1 1 5 10 Bucket Thùng 1 1 1 11 Ant Trap Bẫy kiến 1 1 1 12 Discard Đồ phế thải 1 1 1 13 Flower vase Bình bông 1 1 1 14 Aquarium Bể kính 1 4 10 15 Drum Phuy 1 3,5 3,5 16 Other Khác 1 1 1 30 Tính các chỉ số • Chỉ số nhà có LQ Aedes aegypti (HI): là tỷ lệ (%) nhà có LQ Aedes aegypti. HI (%)= • Chỉ số dụng cụ chứa nước có LQ Aedes aegypti(CI): là tỷ lệ (%) dụng cụ chứa nước (DCCN) có LQ Aedes aegypti. CI (%)= • Chỉ số Breteau (BI): là tổng số DCCN có LQ Aedes aegypti trong 100 nhà khảo sát. Đôi khi trong thực tế chỉ khảo sát 50 nhà, vậy công thức chung là BI = ƒ BI≤5: nguy cơ xảy ra dịch SD/SXHD rất thấp. ƒ 5<BI<50: nguy cơ xảy ra dịch SD/SXHD trung bình. ƒ BI≥50: nguy cơ xảy ra dịch SD/SXHD cao. (Dr Bernard Rouchon 2004) • Chỉ số DCCN có Mesocyclops sp.: là tổng số DCCN có Mesocyclops sp. trong tổng số DCCN của 100 nhà điều tra %DCCN có Mesocyclops sp. = Số nhà có lăng quăng Aedes aegypti x 100% Số nhà giám sát Số DCCN có lăng quăng Aedes aegypti x100% Tổng số DCCN giám sát Số DCCN có lăng quăng Aedes aegypti x 100 Số nhà giám sát Số DCCN có Mesocyclops x 100 Số DCCN 31 2.2.1.4. Nghiên cứu khả năng diệt LQ của Mesocyclops sp. ngoài thực địa (tỉnh Bến Tre) Mục đích Khảo sát khả năng diệt LQ Aedes aegypti của Mesocyclops sp. trong điều kiện môi trường tự nhiên khi phóng thả trong các DCCN ở xã VQĐ thuộc tỉnh Bến Tre. Theo dõi sự tồn tại của Mesocyclops trong điều kiện môi trường tự nhiên khi phóng thả trong các DCCN tại thực địa. Phương pháp Chúng tôi tiến hành điều tra ở 1 xã thử nghiệm 4 lần/năm. Khảo sát xã VQĐ vào tháng 11 năm 2008; tháng 2, 5, 8 năm 2009. Mỗi đợt điều tra thực địa gồm 100 nhà phân bố một cách ngẫu nhiên trong 3 ấp ở xã VQĐ. Các điều tra viên được chia thành 10 nhóm nhỏ, mỗi nhóm được phân công điều tra 10 hộ gia đình. Một nhóm có 2 điều tra viên và 1 cộng tác viên (CTV) là người của địa phương. Công việc tại hộ gia đình của các thành viên trong nhóm điều tra được phân công cụ thể: 1 người phỏng vấn theo “bảng điều tra véc tơ SD/SXHD và ổ bọ gậy Aedes”, 1 người phụ trách điều tra và định loại muỗi và LQ cùng với sự hỗ trợ của CTV địa phương Mỗi tháng các CTV theo dõi sự tồn tại, phóng thả Mesocyclops sp. và điều tra ghi tổng số DCCN lớn có Mesocyclops sp. ở xã VQĐ. Mỗi dụng cụ chứa chừng 1- 1,5m3 (1000-1500 lít) nước chỉ cần thả 30-35 con Mesocyclops. 2.2.2. Nghiên cứu khả năng diệt LQ Aedes aegypti của Mesocyclops sp. trong phòng thí nghiệm Mục đích Khảo sát khả năng diệt LQ Aedes aegypti của Mesocyclops sp. thu nhận từ tỉnh Bến Tre, trong phòng thí nghiệm Côn trùng thuộc Khoa Y tế cộng đồng ở viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh. Phương pháp 32 Mesocyclops sp. thu thập ở thực địa, được nuôi trong phòng thí nghiệm; chọn một Mesocyclops trưởng thành để thực hiện thử nghiệm. LQ Aedes aegypti tuổi I: muỗi bắt ở thực địa sau khi định danh và nuôi trong phòng thí nghiệm, muỗi đẻ trứng, trứng được bảo quản và cho nở cùng một lúc để có lô LQ tuổi một tương đối đồng nhất. Thả một Mesocyclops sp. trưởng thành vào 10 đĩa petri thủy tinh, mỗi đĩa có chứa 30 ml nước máy đã khử Clo với pH 6,5, ở nhiệt độ phòng và 50 LQ Aedes aegypti tuổi I. Thêm 50 LQ Aedes aegypti tuổi I mỗi ngày trong vòng 5 ngày liên tục. Việc tính tỉ lệ săn mồi hàng ngày trung bình dựa vào số LQ bị chết và bị ăn thịt. Những con LQ còn sống được lấy ra hàng ngày và thêm 1 mẻ 50 con vào. Thí nghiệm đối chứng dùng 10 đĩa petri thủy tinh chỉ chứa LQ Aedes aegypti tuổi I, không thêm thức ăn trong suốt quá trình thử nghiệm cho bất cứ thí nghiệm nào để tính tỉ lệ chết có thể có của LQ. Mỗi ngày đếm xác LQ bị cắn chết và số LQ còn sống trong mỗi cốc, từ đó suy ra số LQ tuổi I bị ăn thịt. Số LQ bị tiêu diệt là tổng cộng của số LQ bị ăn thịt và số LQ bị cắn chết trong vòng 24h. Lô đối chứng: Đếm số LQ bị chết mỗi ngày. Lập lại thí nghiệm 6 ngày liên tiếp, tính tổng số LQ tuổi I bị tiêu diệt bởi 1 Mesocyclops sp. trong 24 giờ, và tỉ lệ (phần trăm) LQ bị diệt. Hình 2.24. Trứng muỗi Aedes agypti ngâm nước để thu LQ tuổi I 33 2.2.3. Nghiên cứu khả năng sinh sản của Mesocyclops sp. trong phòng thí nghiệm Mục đích • Xác định thời gian hình thành lại túi trứng sau khi đẻ của Mesocyclops sp. cái. • Xác định thời gian nauplii (I) biến thái thành copepodit (I). • Xác định thời gian nauplii (I) thành Mesocyclops sp. cái có túi trứng lần đầu. • Số lượng nauplii do 1 con cái sinh ra sau 1 lần rụng trứng. • Số lần túi trứng hình thành đối với 1 con Mesocyclops sp. cái. • Tỉ lệ (%) copepodit (I) hình thành từ nauplii (I). Phương pháp Thả một Mesocyclops sp. cái vào đĩa petri thủy tinh chứa 30 ml nước máy đã khử Clo với pH 6,5, ở nhiệt độ phòng. Đĩa petri có chứa lúa mạch làm nguồn thức ăn cho Mesocyclops. Theo dõi thí nghiệm để tách Mesocyclops cái ngay sau khi đẻ để tránh trường hợp Mesocyclops cái ăn thịt ấu trùng. Thêm nước đã khử Clo và thức ăn trong quá trình quan sát. Hình 2.25. Mesocyclops sp. bắt LQ Aedes aegypti tuổi I (20X) trong phòng thí nghiệm 34 2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu -Thống kê và xử lý số liệu thu được bằng phần mềm SPSS 12.0. -Xử lý số liệu côn trùng bằng phần mềm Vector productivity data calculator (version 5.0) và hệ thống mạng http:// www.dengue.qimr.edu.au. -Vẽ biểu đồ bằng phần mềm Microsoft Office Excel 2003. Hình 2.22. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu khả năng sinh sản của Mesocyclops sp. trong phòng thí Hình 2.23. Mesocyclops sp. mang túi trứng (50X) trong phòng thí nghiệm